Тест система по парвовирусу свиней

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Елисеева О. В., Латышев О. Е., Гребенникова Т. В., Алипер Тарас Иванович

Разработана тест-система для выявления ПВС методом ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего неструктурный белок NS-1. Данная область генома ПВС является высококонсервативной и позволяет выявлять все штаммы ПВС.

Kit based on Real-time PCR for detection of porcine parvovirus

Parvoviral infection of swine is caused by a small non5enveloped virus (Porcine parvovirus, PPV) and leads to serious reproductive disorders in pregnant sows. The present work it has been shown the results of the development of diagnostic test kits for detection of porcine parvovirus by a TaqMan5based real5time poly5 merase chain reaction. A test system has a high sensitivity, specificity and can detect parvovirus antigen in mummi5 fied fetuses, in the blood and serum, as well as in the semen of boars.

Г.С. Бурмакина, А.С. Малоголовкин, А.В. Николаев, А.В. Луницин, С.Ж. Цыбанов

из расчета 100 LD50. У инфицированных кроликов через 15. 25 ч отмечали клинические проявления болезни: угнетение, отказ от корма, носовое кровотечение и гибель в течение 24.96 ч.

Животных, которые не погибли после инфицирования вирусом ГБК, подвергли эвтаназии на 7-е сутки. Пробы органов и тканей от инфицированных кроликов исследовали методом ОТ-ПЦР.

С использованием ОТ-ПЦР РНК ВГБК была выявлена в печени, селезенке, сердце, легких, мышцах, почках, коже и шерсти зараженных животных. Кроме того, посредством разработанной методики можно выявлять РНК вируса в пробах печени инфицированных кроликов в ранние (1-е сутки) и поздние (4-5-е сутки) сроки после заражения. В ходе экспериментов методом ОТ-ПЦР было установлено наличие РНК возбу-

1. Moss S.R., Turner S.L., Trout R.C., White P.J., Hudson P.J., Desai A., Armesto M., Forrester N.L., Gould E.A. Molecular epidemiology of Rabbit haemorrhagic disease virus // J. Gen. Virol., 2002; 83: 2461—2467.

2. Tian L., Liao J., Li J., Zhou W., Zhang X., Wang H. Isolation and identification of a non-haemagglutinating strain of rabbit hemorrhagic

дителя ВГБК в печени инфицированных кроликов, не павших после заражения, даже в тех случаях, когда результат РГА и ИФА был отрицательным.

Разработана методика ОТ-ПЦР, посредством которой можно обнаруживать геном вируса ГБК в пробах различных органов и тканей. Специфичность метода подтверждена его отрицательными показаниями при исследовании проб органов интактных животных, а также вирусов миксомы кроликов и везикулярной экзантемы. Аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР составляет 101,5 LD5o/мл. Посредством разработанной методики удается выявлять РНК вируса в пробах печени инфицированных кроликов в разные сроки после заражения.

disease virus from China and sequence analysis for the VP60 Gene // Virus Genes, 2007; 35: 745—752.

G.S. Burmakina, A.S. Malogolovkin, A.V. Nikolaev, A.V. Lunitsin, S.G. Cibanov. Identification of the rabbit hemorrhagic disease virus genome by PCR. In the article the results of RT-PCR elaboration for RHDV detection are presented. High specificity and sensitivity of this method were shown experimentally. Samples of different organs (liver, spleen, lungs, heart, kidneys, muscles, skin and hair) of infected animals were tested for RHDV genome identification RT-PCR. The elaborated technique allows to detect RHDV genome in all these organs on different days after infection.

УДК 619: 616.98: 616-076

Тест-система на основе ПЦР

в реальном времени

для обнаружения парвовируса свиней

О.В. Елисеева1, О.Е. Латышев1, Т.В. Гребенникова12, Т.И. Алипер1,2

Ключевые слова: парвовирус свиней, полимеразная цепная реакция в реальном времени Сокращения: КЧС—классическая чума свиней, ПВИС— парвовирусная инфекция свиней, ПВС—парвовирус свиней, п.н. — пары нуклеотидов, ППЭС—перевиваемая линия клеток почек эмбрионов свиней, ПЦР—полимеразная цепная реакция, РГА — реакция гемагглютинации, РРСС—репродуктивно-респираторньй синдром свиней, СПМИ — синдром послеотъемного мультисистемно-го истощения, ЦВС-2 — цирковирус свиней 2-го типа

Парвовирус свиней относится к категории важных патогенов, которые вызывают нарушения репродуктивной функции свиноматок и наносят значительный экономический ущерб свиноводческим хозяйствам [12]. Болезнь, вызванная данным вирусом, клинически проявляется только у супоросных свиноматок и характеризуется малочисленными пометами, гибелью эмбрионов и плодов с рассасыванием и мумификацией, рождением мертвых плодов, бесплодием, повторным

РВЖ • СХЖ • № 1/2012

приходом в охоту, гибелью новорожденных поросят и реже абортами [3, 4]. У животных других возрастных групп заболевание обычно протекает в латентной форме. Однако имеются сообщения, что ПВС вызывает кожные поражения у поросят [10, 11, 19], интерстициальный нефрит у свиней убойного возраста [7] и негнойный миокардит у поросят-сосунов [6]. Согласно последним данным, ПВС может усиливать проявление клинических признаков СПМИ, вызванного ЦВС-2 [9].

ПВС относится к роду Parvovirus семейства Par-voviridae [17]. Его геном представлен однонитевой молекулой ДНК (приблизительно 5 тыс. нуклеотидов), и имеет две основные открытые рамки считывания. Открытая рамка считывания, расположенная на 3' -конце генома, кодирует неструктурные белки (NS). Открытая рамка считывания, расположенная на 5' -конце генома, кодирует структурные белки (VP). Каждая из этих рамок кодирует минимум по два белка [5, 18]. Генетическая вариабельность штаммов ПВС представлена изменениями в структурном белке VP-2. В последнее время выявлены новые антигенные варианты (типы) ПВС, выделенные из полевых изолятов [14, 20].

Классические методы выявления ПВИС — выделение вируса, РГА и иммунофлуоресценция [2, 8, 15]. Для определения вирусного антигена на исследование направляют мумифицированные плоды, мертворожденных поросят, сперму хряков, кровь свиноматок с нарушениями репродуктивной функции. Однако мумифицированные плоды старше 70-дневного возраста и мертворожденные поросята не пригодны для выделения вируса, поскольку содержат вирусный антиген, связанный с антителами. В последнее время для диагностики широко применяют метод ПЦР, основанный на ферментативной амплификации специфических участков генома [1, 16]. Данный метод чувствителен, специфичен, экономичен, прост в исполнении и, кроме того, позволяет выявлять вирус, несмотря на его связь с антителами.

В настоящее время широкое распространение получает современная модификация метода ПЦР — ПЦР с детекцией специфического продукта амплификации в режиме реального времени. Метод обладает рядом преимуществ по сравнению с обычной ПЦР и позволяет получать результаты в течение нескольких часов, снижает риск контаминации. Кроме того, посредством ПЦР в реальном времени доступен не только качественный, но и количественный анализ.

Разработать тест-систему для выявления ПВС методом ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего неструктурный белок NS-1. Данная область генома ПВС является высококонсервативной и позволяет выявлять все штаммы ПВС.

Материалы и методы

Вирусы, клетки, исследуемые образцы. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали образцы ДНК, выделенные из культур клеток ППЭС, зараженных ПВС (штамм ИЛ-82). Титр данного вируса в РГА сос-

3.68 х |0Л ^ 3.68 х 104

11 16 21 26 31 Номер цикла

Рис. 1. Результаты ПЦР в реальном времени на матрице серии последовательных разведений рекомбинантной плазмиды. Кривые флуоресценции соответствуют положительным результатам обнаружения ДНК ПВС

тавлял 1/1048. Суспензии внутренних органов абортированных плодов и кровь были получены из свиноводческих хозяйств РФ.

Праймеры и зонды. Последовательности синтетических олигонуклеотидов (праймеров и зонда) для детекции фрагмента ДНК (193 п.н.), кодирующего неструктурный белок NS-1, разрабатывали с использованием компьютерных программ Assembly Lign (Oxford Molecular Group PLC, США), Amplify версия 1.0 (University of Wisconsin, США); Oligo версия 4.0 (США). Зонд метили на 5'-конце флуорофором FAM и на З'-конце гаситетелем флуоресценции BHQ1.

Оптимизация проведения ПЦР в реальном времени. Реакцию для наработки фрагмента ДНК проводили в объеме 25 мкл. К 5 мкл ДНК добавляли реакционную смесь для ПЦР, содержащую 2,5 мкл 10X буфера для ПЦР (Fermentas), 10 пМ каждого праймера, 5 пМ зонда, 0,25мМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы и 11, 75 мкл деионизованной стерильной воды. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали следующий температурный режим: 1 цикл: при 940С — 5 мин, 35 циклов: при 940С — 15 с, 600С — 15 с, 720С — 1 мин. Ставили реакцию и учитывали результаты с использованием детектирующего амплификатора ДТ-96 (ДНК-технология, Россия). Результаты отображались на экране монитора компьютера в виде зависимости интенсивности флуоресценции от цикла реакции.

О.В. Елисеева, О.Е. Латышев, Т.В. Гребенникова, Т.И. Алипер

5Ю = 0,569 й_2 = 0,9943

Рис. 2. Калибровочный график для количественного анализа

Чувствительность и специфичность ПЦР в реальном времени. Для определения абсолютной чувствительности разработанной тест-системы делали десятикратные разведения рекомбинантной плазмиды на деионизованной стерильной воде. Молекулярная концентрация плазмиды при этом составила от 3,68 х 1010 до 3,68 х 100 копий/мкл. Так же определяли сравнительную чувствительность тест-системы на основе ПЦР в реальном времени, тест-системы на основе ПЦР и РГА, используя 10-кратные разведения культурального ПВС. Специфичность разработанной тест-системы исследовали, используя различные вирусы, вызывающие сходную с ПВИС клиническую картину (вирусы РРСС, КЧС, ЦВС-2).

Для определения чувствительности использовали рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент генома ПВС, кодирующий часть неструктурного белка NS1. Массовая концентрация рекомбинантной плазмиды составила 0,13 мкг/мкл, молекулярная концентрация рекомбинантной плазмиды — 3,68 х 1010 молекул/мкл. Готовили серию стандартных растворов рекомбинантной плазмиды. Диапазон полученных концентраций — от 3,68 х 1010 до 3,68 х 100 копий/мкл.

На рисунке 1 представлены результаты ПЦР в реальном времени серии стандартных растворов калибровочного графика, которые отображены в виде зависимости флюоресценции от номера цикла. В серии экспериментов была определена чувствительность разработанной тест-системы, которая составила 20.30 молекул/мкл в исследуемом образце.

Важной характеристикой метода ПЦР в реальном времени служит возможность проведения не только качественного, но и количественного анализа. Для этого необходимо построить калибровочный график, который выражает линейную зависимость значений порогового цикла Ct и десятичного логарифма концентрации ДНК Log10 (рис. 2). По калибровочному графику, в соответствии с полученным значением &, расчитывают концентрации ДНК исследуемых образцов.

Номер лунки Идентификатор пробирки Ср, Fam Ср, Нех Результат

В1 КЧС_проба_1 (РРУ) -

В5 ЦВС_проба_2 (РРУ) -

Зависимость флуоресценции канала FAM от номера цикла

1 б 11 16 21 26 31

В России для обнаружения парвовирусного антигена в суспензии внутренних органов абортированных плодов обычно используют метод РГА. Сегодня для диагностических исследований также применяют метод ПЦР, основанный на ферментативной амплификации специфических участков генома. Данный метод характеризуется большей чувствительностью по сравнению с РГА и позволяет выявлять вирус несмотря на его связь с антителами, исследовать кровь и сыворотку животных.

В нашей работе мы сравнили чувствительность различных диагностических тест-систем (табл.).

Сравнение чувствительности различных диагностических методов на матрице культуры клеток ППЭС, зараженной парвовирусом свиней

Разведение культуры клеток ППЭС, Метод исследования

РВЖ • СХЖ • № 1/2012

Анализ полученных данных показал, что разработанная тест-система для обнаружения ДНК ПВС на основе ПЦР в реальном времени имеет примерно такую же чувствительность, что и обычная ПЦР тест-система, но в 100 раз чувствительней РГА.

Специфичность тест-системы исследовали с использованием различных штаммов вирусов, вызывающих сходные с ПВИС симптомы заболевания. Результаты исследований приведены на рисунке 3.

1. Гребенникова Т.В. и др. Медицинская вирусология. —

2. Орлянкин Б.Г. и др. Парвовирусные инфекции и их влияние на продуктивность животных. — М.: ВНИИТЭИСХ, 1985.

3. Орлянкин Б.Г. Биология парвовирусов животных // Сельскохозяйственная биология, 1986; 11: 104.

4. Сергеев В.А. Вирусы и вирусные вакцины. — М.: Библи-оника, 2007.

5. Bergeron J. et al. Genomic organization and mapping of transcription and translation products of the NADL-2 Strain of Porcine parvovirus // Virology, 1993. 197: 86—98.

6. Bolt D.M. et al. Non-suppurative myocarditis in piglets associated with porcine parvovirus infection // J.Comp.Pathology, 1997; 117 (2): 107—118.

7. Drolet R. et al. Infectious agents identified in pigs with multifocal interstitial nephritis at slaughter // Vet. Record, 2002; 150 (5): 139—143.

8. Joo H.S. et al. Pathogenesis of porcine parvovirus infec-tion:pathology and immunofluorescence in the foetus // J.Comp.Pathology, 1977; 87: 383—391.

9. Krakowka S. et al. Viral wasting syndrome of swine: Experimental reproduction of Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus // Vet. Pathology, 2000; 37: 254—263.

10. Kresse J.I. et al. Parvovirus infection in pigs with necrotic and vesicle-like lesions // Vet. Microbiology, 1985; 10: 525—531.

11. Lager K.M. et al. Porcine parvovirus associated with cutaneous lesions in piglets // J. Vet. Diag. Investigation, 1994; 6 (3): 357—359.

СТО 42418073-002-2007). Образцы, которые дали положительные результаты в ПЦР, также оказались положительными в ПЦР в реальном времени. По результатам исследований можно сделать выводы о возможности использования разработанной тест-системы для обнаружения ПВС методом ПЦР в реальном времени для диагностики ПВИС у животных.

Разработанная тест-система для обнаружения ПВС методом ПЦР в реальном времени, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Она пригодна для рутинных диагностических исследований в региональных лабораториях для выявления ПВС в пробах биологического материала разного происхождения, полученного от животных.

12. Maldonado J. et al. Identification of viral pathogens in aborted fetuses and stillborn piglets from cases of swine reproductive failure in Spain // The Veterinary J., 2005; 169:454—456.

13. Martinez C. et al. Production of porcine parvovirus empty capsids with high immunogenic activity // Vaccine, 1992; 10: 684—690.

Парвовирусная инфекция (болезнь репродуктивных органов) свиней (Parvovirus disease) ПВСИ –контагиозная вирусная болезнь клинически проявляющаяся только у супоросных свиноматок нарушением функции органов воспроизодства (прохолостами, малоплодием, гибелью эмбрионов, рождением малоплодных по-метов, мумифицированных плодов, мертвых и слабых поросят и реже абортами). У хряков-производителей заболевание протекает субклинически.

Историческая справка. Возбудителя парвовирусной инфекции впервые выделили в 1966 году Майери соавтор, связь между вирусом и заболеванием свиней была обнаружена в 1967г в Англии.

В СССР наличие инфекции было установлено в 1982 году при исследовании абортированных плодов. На сегодняшний день парвовирусная инфекция зарегистрирована в 37 странах мира.

Экономический ущерб обусловлен потерями от выбраковки свиней из-за тяжелых, длительных (до 3 суток) патологических родов, после которых у свиноматок возникают заболевания родовых путей (метриты) и молочной железы (маститы, агалактия).

Дополнительные потери хозяйства несут от снижения оплодотворяемости свиноматок, абортов и мерворожденности приплода и последующего отставания в росте полученных поросят.

Этиология. Возбудитель болезни-Parvovirus suis ДНК содержащий вирус (размер 20-25нм, молекулярная масса 5,3 Д, плавучая плотность 1,38-1,395 г/см³, коэффициент седиментации 109 S). Содержит 3 структурных полипептида с молекулярной массой 83,64 и 60 кД. Размножается в культурах клеток почек плода свиньи и др. для успешного накопления вируса необходимо большое количество активно делящихся клеток. Вирус устойчив к физико-химическим факторам. Нагревание при 70° С в течение 2ч не снижает его инфекционности, но он разрушается при 37°С в среде с рН 2,0 за 2 ч. В нативном состоянии не изменяется активность при -20…70°С 12 мес. Устойчив к обычно употребляемым детергентам.

Эпизоотологические данные. Естественный хозяин вируса – свиньи и хряки, которые могут выделять его с вагинальной слизью, спермой. Как правило, заражаются серонегативные свиноматки в первой половине супоросности. Вирус, проникший в благополучное хозяйство, в течение 2-3 месяцев поражает практически всех животных. Источником возбудителя ПВСИ являются: больные животные, выделяющие вирус во внешнюю среду с фекалиями (до 2 недель), мочой, носовыми и вагинальными секретами, абортированными и мертворожденными плодами, а также плацента. Основным путем заражения является половой т.к. вирус в сперме хряков сохраняется в течение 1-4 недель после заражения. Заражение происходит: оральным и аэрогенным путями с последующим поражением эмбрионов через плаценту. Свиней можно заразить внутримышечно и внутривенно при массовых ветеринарных обработках, проводимых с нарушением правил асептики и антисептики. Заражение может происходит в родильных отделениях при травмировании родовых путей, при кастрации поросят. Болезнь сопровождается виремией. Чаще всего поражаются пометы первоопоросок. Вирус проходит через плаценту и поражает часть или все плоды. При этом эмбрионы моложе 36 дней рассасываются, а зараженные между 36-м-70-м днями погибают и мумифицируются. У зараженных свиноматок в более поздние сроки супоросности образуются антитела.

Помещения, в которых содержат свиней, являются резервуаром вируса, так как он устойчив к распространенным дезсредствам, термостабилен и длительное время может сохраняться в экскретах свиней. В станках вирус сохраняется до 135 дней. Вирус может быть занесен в хозяйство введением в восприимчивое стадо зараженных свиноматок и хряков, обслуживающим персоналом и загрязненным вирусом инвентарем. Введение большого количества подсвинков в неблагополучное стадо сопровождается острой вспышкой болезни.

В стационарно неблагополучных свиноводческих хозяйствах нарушение воспроизводительной функции чаще наблюдается у ремонтных свинок, осеменение которых, как правило, заканчивается безрезультатно. Поросята, родившиеся живыми от таких свиноматок, отличаются малой массой тела (500-700г), анемичны, не принимают молозиво и погибают на 2-3-й день жизни.

В результате неоднократного естественного инфицирования парвовирусом основные свиноматки становятся иммунными.

Супоросность у таких свиноматок обычно протекает без патологии и в большинстве случаев от них можно получить нормально развитых поросят.

В то же время, количество родившихся живых поросят, от свиноматок снижается на 10-20%, а у родившихся встречаются различные уродства.

На мелких и средних (фермерских, подсобных) хозяйствах ПВСИ является стационарной инфекцией и часто протекает в бессимптомной форме, а ее отдельные клинические проявления (прохолосты, редкие ранние аборты и малочисленные гнезда) для владельцев ферм обычно не служат поводом для выяснения данных явлений и соответственно не проводятся мероприятия с этой инфекцией.

Оплодотворяемость свиноматок снижается на 25-30 %, а мертворожденность может доходить до 100%.

Патогенез. Считают, что гибель эмбрионов является результатом прямого воздействия вируса, хотя это может быть и результатом вирусиндуцированных изменений в матке, несовместимых с беременностью, вследствие нарушения циркуляции крови и размягчения тканей.

Попав в организм свиноматки, вирус в первую неделю после заражения накапливается в крови и тканях паренхиматозных органов с резко выраженной пролиферативной активностью. В период вирусемии парвовирус проходит через плаценты и инфицирует эмбрионы или плоды.

Инфицирование развивающихся эмбрионов у свиноматок происходит через 8-12 дней после оплодотворения, когда они имплантируются в слизистую оболочку матки, в результате эмбрионы погибают и рассасываются.

При этом полное рассасывание эмбрионов у свиноматок происходит в том случае, если они погибли в первые 30-36 дней беременности, в так называемую эмбриональную стадию развития. После этого свиноматки приходят повторно в охоту (прохолост). Следующая супоросность протекает нормально. При заражении и гибели части эмбрионов беременность протекает обычно без осложнений, но число поросят в помете уменьшается.

Если заражение происходит в плодную фазу развития плода, то уже происходит кальцификация и рассасывание плода становиться невозможным. Заражение и гибель всех плодов в этот период приводит к их мумификации и, как следствие, к ранним абортам (когда абортированные плоды имеют длину тела до 15 см.) или же к отсутствию родов у свиноматок.

Заражение парвовирусом через плаценту в более поздние сроки супоросности (70-101-й день) не приводит к гибели плодов ввиду того, что организм плодов становится к этому моменту иммуннокомпетентным и способен вырабатывать защитные антитела.

Однако такие серопозитивные в помете поросята, как и переболевшие, длительное время остаются вирусносителями. На практике бывает так, что не все плоды у свиноматок поражаются вирусом, отсюда в стаде, неблагополучном по ПВИС, в гнезде инфицированных свиноматок могут быть как живые, так и нежизнеспособные и мертвые поросята, а также мумифицированные плоды.

Клинические признаки. ПВСИ у свиноматок протекает бессимптомно. Иногда в первую неделю после заражения парвовирусом, мы можем у таких свиноматок регистрировать кратковременное повышение температуры тела. Клиническое проявление заболевания у свиноматок сопровождается нарушением функции органов воспроизводства и характеризуется:

гибелью эмбрионов;
после осеменения свиноматки повторно приходят в охоту, происходит увеличение количества осеменений, смещением сроков ожидаемых опоросов;
свиноматки рождают мертвых, мумифицированных и слабых поросят в помете.

Аборты у зараженных свиноматок наблюдаются крайне редко и не являются для ветспециалистов характерным признаком ПВСИ.

В свиноводческих хозяйствах стационарно неблагополучных по ПВСИ нарушение в воспроизводительной функции специалисты наблюдают в основном у ремонтных свинок. У основных свиноматок в результате неоднократного естественного инфицирования парвовирусом приплод становится иммунным и беременность у них протекает нормально.

В первично инфицированных хозяйствах нарушение воспроизводительной функции наблюдаем как у ремонтных, так и у основных свиноматок. У хряков-производителей ПВСИ протекает бессимптомно.

Патологоанатомические изменения обнаруживаются у серонегативных свиней, зараженных до 70-го дня супоросности и убитых спустя 12-21 день. При патвскрытие инфицированных плодов находим:

задержка роста и развития плода;
из-за переполнения кровью рельефность кровеносных сосудов;
отеки, геморраргии;
мумификацию и скопление серозно-кровянистой жидкости в естественных полостях;
отечность плаценты;
кровенаполнение сосудов.

Микроскопически отмечаем накопление мононуклеотидов в эндометрии, периваскулитов из плазматических клеток и лимфоцитов в головном и спинном мозге. При более раннем заражении эти явления выражены сильнее.

У супоросных свиноматок, зараженных в различные сроки беременности, регистрируем:

Фокальные скопления мононуклеарных клеток в эндо- и миометрии;
периваскулярные муфты из лимфоидных и плазматических клеток в головном и спинном мозге.

У отдельных мертворожденных поросят и живых плодов, инфицированных вирусом, на поздних стадиях супоросности отмечаем менингоэнцефалиты.

Диагноз. Диагноз на ПВСИ ставится комплексно с учетом эпизоотологических и клинических данных, массового нарушения функций органов воспроизводства у свиноматок. Для окончательного диагноза необходимо исследовать плоды, пораженные в ранние сроки супоросности, для выявления вируса (в более поздние сроки имеющиеся антитела мешают выявлению вируса).

Для лабораторного исследования необходимо направлять сыворотку крови от новорожденных поросят до приема ими молозива, жидкость из грудной и брюшной полостей мертворожденных поросят, а также сыворотку крови от свиноматок с нарушенной репродукцией через 1 месяц после опороса (не менее 5-10 проб каждого материала).

Для вирусологических (обнаружение вируса в РГА, МФА) и молекулярно-генетических (определение генома вируса при помощи ПЦР) исследований абортированные плоды или их легкие нужно доставлять свежим или в замороженном виде.

Диагноз на ПВСИ считается установленным:

если в транссудате мертворожденных или сыворотке крови поросят, не принимавших молозиво, обнаруживают специфические антитела в диагностических титрах в РДП,ELJSA,РН, а также в РТГА;
в патматериале выявлен вирус (геном) ПВСИ.

Наличие антител в сыворотке крови свиноматок и хряков, ранее не вакцинированных против ПВСИ, говорит о их раннем переболевании, а также о циркулировании парвовируса среди восприимчивых животных.

Дифференциальный диагноз. Необходимо исключить энтеровирус свиней, рео-и аденовирусные инфекции, классическую чуму свиней, грипп.

Иммунитет. Парвовирус индуцирует у инфицированных свиноматок высокий уровень антител, которые в большом количестве содержатся в молозиве свиноматок. Принимая такое молозиво, поросята приобретают пассивный (лактогенный) иммунитет, который держится у них до 5-9 месяцев, что в свою очередь препятствует формированию у них активного иммунитета. Активный иммунитет у свиней не образуется до тех пор, пока у них не исчезнет пассивный. Для полной защиты животных от заражения требуется сравнительно высокий уровень антител, не менее 1:160. После переболевания у животных развивается пожизненный иммунитет. У большинства основных свиноматок, имеющих антитела к парновирусному антигену супоросность протекает нормально.

Парвовирусную инфекцию свиней можно предупредить вакцинацией подсвинков до осеменения. Установлено, что вакцинация предохраняет от трансплацентарной передачи вируса плодам при нарушении репродукции у свиноматок после заражения. В США используют комбинированные вакцины против парвовирусной инфекции и лептоспироза, а также против парвовирусной инфекции и болезни Ауески. Инактивированные вакцины применяют два раза за 7 и 3 недели до первой случки по 5мл, а затем однократно перед каждой случкой.

В России для специфической профилактики ПВСИ применяют эмульсионную инактивированную вакцину против ПВСИ (производство ВНИИЗЖ) и ассоциированные вакцины против ПВСИ и других инфекций, которые применяются в соответствии с наставлениями фирм-производителей.

Профилактика. Профилактика болезни в хозяйствах, свободных от ПВСИ, строится на предотвращении заноса возбудителя. Свиней закупаемых в других хозяйствах необходимо предварительно исследовать на ПВСИ, а также в течение 30 дневного профилактического карантинирования в своем хозяйстве. Необходимо организовать раздельные опоросы основных и ремонтных свиноматок, систематически проводить профилактическую дезинфекцию с предварительной тщательной механической очисткой помещения, инвентаря и оборудования.

После каждого цикла опоросов помещение необходимо полностью освободить от животных и в течение профилактического перерыва (5-7 дней) проводят его санитарную обработку.

В благополучных по ПВСИ хозяйствах необходимо систематически (1 раз в год) выборочно исследовать сыворотку крови поросят, не принимавших молозива, и свиноматок на наличие специфических антител к парвовирусу. Комплектование животными проводят в зависимости от эпизоотической обстановки по ПВСИ в хозяйствах поставщиках.

В хозяйствах, имеющих положительно реагирующих при серологическом исследовании животных, иммунизируют все маточное поголовье и хряков-производителей. В случае появления на ферме мертвых и слабых поросят, мумифицированных плодов, малоплодных пометов, прохолостов и абортов в ветеринарную лабораторию направляют материал на исключение ПВСИ.

запрещают вывоз свиней из неблагополучных групп в благополучные по ПВСИ хозяйства;
ограничивают доступ на неблагополучные фермы посторонних людей;
организуют раздельный опорос основных и проверяемых свиноматок;
проводят тщательную механическую очистку станков для опороса, предметов ухода, оборудования, транспортных средств, с последующей дезинфекцией растворами гипохлорита натрия или гидроксида натрия;
абортированные, мертвые и мумифицированные плоды, плаценты подвергаются сжиганию;
при проведении массовых обработок ветспециалисты и зоотехники хозяйств должны соблюдать правила асептики и антисептики и другие меры направленные на предотвращение распространения инфекции среди восприимчивых животных.

Специальные мероприятия по борьбе с ПВСИ в неблагополучных хозяйствах предусматривают: иммунизацию ремонтных свинок, их вакцинацию начинают в возрасте 5-7 месяцев с ревакцинацией за 3-5 месяцев до осеменения; основных свиноматок вакцинируют первый раз за 2 недели до отъема, а в последующем после каждого отъема поросят, поросят с 2-2,5-месячного возраста; хряков-производителей каждые 6 месяцев (лучше за 2 недели до случки).

Вакцинации подвергаются поросята на доращивании и откорме согласно наставлению по применению вакцины. Вакцинируют свиней в период карантинирования. Подобная схема обеспечивает восстановление функции воспроизводства у свиноматок и напряженный иммунитет на весь период жизни.

Ветспециалисты хозяйства проводят вакцинацию всех свиней, за исключением ремонтных свинок и хряков (вакцинируют 2 года), прекращают через 1 год после последнего случая появления у свиноматок признаков ПВСИ и при отсутствии антител к вирусу у новорожденных поросят до приема молозива.

Свиноводческое хозяйство объявляют благополучным через 30 дней после последнего случая заболевания свиноматок с признаками парвовирусной инфекции и выполнения всего комплекса ветеринарно-санитарных мероприятий.

Читайте также: