Тестирование растений на вирусы
Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.
Что предлагает ВОЗ
Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.
Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.
Как работает ПЦР-тест
Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.
Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.
В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.
Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.
Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.
Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.
Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.
Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.
На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.
По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.
Новые разработки за рубежом
Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.
Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.
Еще более оперативный тест на COVID-19 разработали в Великобритании. Он позволяет выявить COVID-19 всего за 30 минут. Чтобы провести его, достаточно портативного оборудования стоимостью около $120 и набора полосок для мазков из носа и горла по $5 каждая. Одновременно проходить тест могут до шести человек.
FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.
Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.
Метод визуальной диагностики
В большинстве случаев определить вирусную природу болезни не трудно. Обычно ее определяют по внешним признакам, таким как линейные хлоротичные узоры или кольцевые узоры на молодых листьях. Однако, их идентификация часто затруднена, так как вирусы имеют бессимптомный (латентный) характер развития. Симптоматика зависит от состояния организма, агрессивности штамма патогена, внешних условий и продолжительности пребывания вируса или вироида в клетках хозяина. Например, симптомы заболевания отчетливо выражены у растений, росших на ярком свету и при умеренной температуре, при высокой температуре и недостаточном освещении симптоматика заболевания может быть совсем не выражена.
Посветление жилок самых молодых листьев нередко является одним из первых признаков системной вирусной инфекции. Жилки становятся жёлтыми и полупрозрачными. Листья, образующиеся позже, могут быть мозаичными, крапчатыми или совсем жёлтыми (хлоротичными).
Инкубационный период заболевания зависит от вида вируса, растения-хозяина и условий среды, но в любом случае он составляет несколько дней или недель.
Если первые симптомы вироза заметны на рассаде, то источник инфекции находился либо в семенах, либо заражение произошло при посредстве переносчика. Если заражённые растения расположены в культуре совершенно случайно или же только в рядках, посаженных из одной партии, то это говорит о том, что, скорее всего, был заражен посадочный материал. Если на отдельных участках поля обнаруживаются заболевшие растения, причём появление заражённых участков связано с почвенными различиями, имеются все основания предполагать распространение вирусов через почву.
Следует отметить также, что существуют симптомы, свойственные вирозам, но вызванные другими причинами (поражения фитоплазмами, некоторыми бактериями и сосущими вредителями). К появлению симптомов, сходных с вирусной инфекцией, часто приводят нарушения минерального питания, например, связанные с дефицитом железа (рис. 1). Различные деформации органов могут вызывать регуляторы роста и гербициды различной природы (рис. 2).
Таким образом, при помощи метода визуальной диагностики, точной идентификации по внешним признакам поражения вирусами и вироидами невозможна, однозначный ответ может быть получен только с использованием инструментальных методов (иммуноферментный анализ, ПЦР-анализ и т. д. ).
Метод индикаторный растений
Метод индикаторных растений — является очень распространенным методом диагностики вирусных и вироидных болезней и идентификации их возбудителей. В основу метода индикаторных растений положено использование растений-индикаторов, которые, в большинстве случаев дают четкие и специфичные симптомы, характерные для определённого вида патогена. Травянистые растения-индикаторы заражают механической инокуляцией соком, в результате заражение может проявляться в виде местных некрозов, изменением окраски и угнетением роста.
Для вируса аспермии томата в качестве индикатора используют молодые растения табака (Nicotiana glutinosa), для диагностики Х-вируса картофеля — амарант шаровидный (Gomphrena globosa). Для выявления заражённости томата вироидом веретеновидности клубней картофеля в качестве индикаторов используют скополию (Scopolia sinensis) или чувствительные сорта томата. В ряде случаев для заражения можно использовать отдельные изолированные листья растений-индикаторов. Соконепереносимые вирусы прививают на индикаторные растения различными методами. В редких случаях, чтобы для передачи вируса используют насекомых-преносчиков и растение-паразит повилику.
Серологически метод диагностики
Метод основан на реакции преципитации (образование осадка) между специфичными антителами и белками (антигенами) возбудителя заболевания. Метод серологической диагностики неприменим для идентификации вироидов из-за отсутствия белкового компонента, а также для ряда соконепереносимых вирусов со слабыми иммуногенными свойствами. Для идентификации вирусов в растении могут использоваться следующие модификации серологической диагностики:
1) Иммуноферментный анализ (ИФА) — наиболее высокочувствительный метод, который позволяет получать количественные оценки. В его основе лежит специфическое распознавание поверхностных антигенов вируса антителами, в присутствии ферментов. Данный метод широко используется на практике для идентификации вирусов сельскохозяйственных культур, подходит для серийных анализов.
2) Капельный метод. Проводится следующим образом. На предметном стекле каплю сока растения смешивают с каплей антисыворотки. Через пару минут проводят оценку реакции под микроскопом при малом увеличении в темном поле или даже визуально, без микроскопа.
3) Метод двойной диффузии — проводится в агаровом геле, для определения сферических и других мелких вирусов. Проводится по такой методике, в одни лунки, которые вырезаны в слое агаровой среды, добавляют антисыворотку, а в другие – очищенный сок растения. В геле вирусные частицы и антитела дифундируют друг другу на встречу, и в месте встречи образуют отчетливые линии преципитации в случае их комплиментарной специфичности.
4) Метод радиальной иммунодиффузии. При использовании данного метода антисыворотку добавляют непосредственно в агаровую среду, при этом лунки заполняют соком растений. Реакция является положительной, если вокруг лунок образуются преципитаны в форме колец.
5) Метод адсорбции. Метод основан на том, что перед реакцией с антигеном антитела связывают каким-либо инертным материалом с крупными частицами, например, латексом. При реакции с антигеном происходит хорошо заметная агглютинация всего комплекса.
Метод электронной микроскопии
На ультратонких срезах пораженных тканей растений, при помощи электронных микроскопов можно определить строение, форму и даже размеры вирусов или вироидов. Электронный микроскоп нередко используют в сочетании с серологическими методами (иммуноэлектронная микроскопия), при этом можно обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами. Метод электронной микроскопии используется крайне редко из-за высокой стоимости оборудования и реактивов, сложности выделения вирусов и вироидов, окисления срезов растений и ряда других факторов.
Электронный микроскоп фото
Метод электрофореза
Этот метод основан на разделении предварительно очищенных нуклеиновых кислот вируса (вироида) или его белков в геле под действием электрического тока, с последующим окрашиванием зон. Метод электрофореза позволяет определить массу и размеры вирусных или вироидных структур. Метод широко используют для визуального исследования конечного продукта полимеразной цепной реакции. Для регистрации полученных результатов делают фотографии геля в проходящем или отражённом свете.
Молекулярно-биологические методы основаны на знании строения молекулы РНК (ДНК) вируса или вироида. Наиболее распространённым тестом является амплификация (умножение) видоспецифичных последовательностей РНК в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выделенные из исследуемых растений отдельные фрагменты РНК, специфичные только для одного вида или рода вирусов, многократно умножают с помощью ферментов в присутствии праймеров (соответствующих олигонуклеотидов). При этом их количество в конечном продукте реакции превышает исходное число копий выбранного фрагмента РНК в миллионы раз. Далее вирусные РНК (ДНК) обнаруживают методом электрофореза в геле или методом иммунофлуоресценции. Метод получает широкое распространение в практических вирусологических работах.
Метод ДНК-зондов также основан на принципе комплиментарности нуклеиновых кислот. Синтезируют специфичные зонды, которые гибридизуются только с определёнными нуклеотидными последовательностями РНК вируса или вироида. В зависимости от выбора зондов можно дифференцировать группы, виды и даже штаммы вирусов и вироидов.
Электрофорез фото
Метод включений
В последствии развития вирусов, в клетках растений образуются скопления вирусных частиц, (включений), называемых кристаллами Ивановского, которые видны с помощью обычного светового микроскопа. Каждый вирус имеет свою форму вирусных включений, которые образуются, чаще всего, в клетках эпидермиса листьев или в клетках волосков. Например, вирус табачной мозаики имеет гексагональные и игловидные кристалы; Х-вирус картофеля типично образование сферических аморфных тел. Для выявления вируса зелёной крапчатой мозаики огурца, скручивания листьев картофеля и некоторых других применяют химические аналитические методы диагностики.
Разработанные системы позволяют быстро, достоверно и с высокой чувствительностью выявлять наличие патогенов. Все комплекты реагентов прошли испытания в научно-исследовательских учреждениях и на специализированных предприятиях, как в России, так и за рубежом.
| Наименование | Форматы | ||
| Форез | FLASH | Rt | |
| Комплекты реагентов для диагностики болезней картофеля | |||
| Кольцевая гниль картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus) |  | | |
| Бурая бактериальная гниль (Ralstonia solanacearum) | | | |
| Вирус скручивания листьев картофеля (Potato Leafroll Virus) | | | |
| M вирус картофеля (Potato Virus M) | | | |
| S вирус картофеля (Potato Virus S) | | | |
| Х вирус картофеля (Potato Virus X) | | | |
| Вироид веретеновидности клубней картофеля (Potato Spindle Tuber Viroid) | | | |
| Y вирус картофеля (Potato Virus Y) | | | |
| A вирус картофеля (Potato Virus A) | | | |
| Вирус метельчатости клубней картофеля (Potato Mop Top virus) | | | |
| Андийский вирус крапчатости картофеля (Andean potato mottle virus) | | | |
| Андийский латентный вирус картофеля (Andean potato latent virus) | | | |
| Бледная картофельная цистообразующая нематода (Globodera pallida) | | | |
| Золотистая картофельная цистообразующая нематода (Globodera rostochiensis) | | | |
| Рак картофеля (Synchytrium endobioticum) | | ||
| Вирус черной кольцевой пятнистости картофеля (Potato black ringspot virus) | | | |
| T вирус картофеля (Potato virus T) скоро в продаже --> | | ||
| Вирус пожелтения картофеля (Potato yellowing virus) | | ||
| Комплект реагентов для амплификации кДНК гена актина картофеля | | | |
| Комплекты реагентов для диагностики болезней сахарной свеклы | |||
| Ризомания сахарной свеклы (вирус некротического пожелтения жилок сахарной свеклы, beet necrotic yellow vein virus) | | | |
| Гниль сахарной свёклы (Pseudomonas syringae) | | | |
| Комплекты реагентов для диагностики болезней огурцов и томатов, выращиваемых в закрытом грунте | |||
| Черная бактериальная пятнистость томатов (Xanthomonas euvesicatoria, ранее Xanthomonas campestris pv. vesicatoria тип А) | | | |
| Некроз сердцевины стебля томата (Pseudomonas corrugata) | | | |
| Угловатая пятнистость листьев(Pseudomonas syringae pv. Lacrimans, ранее Pseudomonas lacrimans) | | | |
| Бактериальный рак томатов (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) | | | |
| Водянистая гниль плодов (Pectobacterium carotovorum subsp. сarotovorum, син. Erwinia carotovora subsp. carotovora) | | | |
| Аскохитоз огурца (Ascochyta cucumis; Phoma cucurbitacearum; Didymella bryoniae)
Аскохитоз томата (Ascochyta lycopersici, син. Didymella lycopersici) * - данные наборы производятся только по предварительному заказу При механическом переносе вирусы выделяют из зараженных растительных тканей и через искусственные поранения вводят в листья тест-растений, на которых появляются определенные реакции. Наиболее распространенная техника инокуляции — натирание поверхности листа. Инокуляция стеклянным шпателем. Отбор материала для инокуляции. Как правило, материалом, из которого экстрагируют вирус для инокуляции, служат молодые листья, так как в сравнении со старыми они содержат меньше ингибиторов инфекции. У видов растений, богатых ингибиторами вирусов, например у розоцветных, для механического переноса пригодны только самые молодые листья. Для определения вирусов семечковых плодовых, например вируса хлоротической пятнистости яблони, в качестве материала для инокуляции наиболее пригодны лепестки цветков. Некоторые вирусы, встречающиеся на плодовых деревьях, можно выделить из зрелых плодов. Механический перенос других, особенно почвообитающих вирусов (вирус некроза табака), лучше всего удается при использовании мочковатых корней. Среди вирусов, поражающих сахарную свеклу, вирус мозаики изолируют не только из листьев, но и из ткани корня. Отбор материала для инокуляции необходимо проводить тщательно дезинфицированными инструментами. При работе загрязненными руками или недезинфицированными инструментами в инокулюм могут попасть стойкие вирусы, например вирус табачной мозаики, что приведет к ошибочному диагнозу. Поэтому перед отбором материала руки следует вымыть дезинфицирующим средством (эпизан) и после этого уже не прикасаться к недезинфицированным предметам. Пинцет для отбора пробы листьев предварительно погружают в спирт; ступку, пестик, а также инструменты для механического переноса (стеклянный шпатель) тщательно моют, погружают в дезинфицирующий раствор и выдерживают в сушильном шкафу 2 ч при 120 °С. После отбора пробы помещают в чистые этикетированные пленочные пакеты или сразу растирают в ступке. Для длительного хранения пробы необходимо охладить при 4—10 °С. Приготовление инокулюма. При получении инокулюма следует учитывать различную пригодность материалов для экстракции вирусов. Листья тыквенных, злаковых, пасленовых культур более пригодны для этой цели, чем листья гвоздичных, маревых, гераниевых или розоцветных, растения которых содержат ингибиторы. Экстракты из листьев или органов с низкой концентрацией ингибиторов (лепестки, самые молодые листья) готовят в большинстве случаев с добавлением 0,03 М фосфатного буфера (pH 7,5). Для его получения смешивают 852 мл раствора Na2HPO4 (6,9 г/л) и 148 мл раствора КН2РO4 (4,5 г/л), с помощью pH-метра проверяя реакцию смеси. Соотношение растворов при смешивании можно изменить в соответствии с нужным значением pH: для pH 7,0—612 : 388 мл, для pH 6,6 — 313 : 687 мл. В экстракты из листьев или органов, содержащих большое количество ингибиторов (корни, нижние листья), добавляют стабилизирующие вирус вещества. Снижение инфекционности может быть вызвано высокой кислотностью соков, как у гераниевых и розоцветных. В этом случае щелочного фосфатного буфера недостаточно, приходится применять более сильные щелочные соединения. Наилучшими оказались при этом 2%-ные растворы никотин-основания и никотин-сульфата. Аналогичным действием обладает и кофеин. Инфекционность снижают также таннины и полифенолы, часто присутствующие в растительном соке и осаждающие белки. При высокой концентрации вируса в экстракте их действие можно ослабить простым разбавлением (например, 1 часть растительной ткани на 10 частей фосфатного буфера) или же повышением значения pH до 8, поскольку при этом связывание вирусов таннинами ослабевает, а экстрагируемость белков возрастает. Адсорбцию ингибиторов или вирусинактивирующих ферментов обеспечивают дозированные добавки порошка алюминия, активировапного угля или бентонита. Однако они адсорбируют и вирусные частицы, поэтому при низких концентрациях вируса их использование не дает преимуществ. В результате ферментативного окисления в растительных экстрактах могут образовываться о-хиноны и другие продукты окисления с ингибирующим действием. Их нейтрализуют добавками редуцирующих веществ, например сульфита натрия, цистеина солянокислого, аскорбиновой кислоты, а также хелатобразующих соединений, в частности диэтилдитиокарбамата натрия (ДИЭКА-Na). Стабилизирующее действие, особенно на вирусы с удлиненными частицами, оказывают ионы магния, в то время как ионы фосфатов ускоряют деградацию вирусных частиц. Поэтому часто применяют также боратный или трис-буфер с добавкой MgSO4. Поскольку растительные соки оказывают разностороннее влияние на содержащиеся в них вирусы, при экстракции последних из богатых ингибиторами тканей для механической инокуляции травянистых растений-индикаторов рекомендуется применение следующих добавок: 0,2 М боратный буфер, pH 9; 2% никотин-основания или никотин-сульфата; 0,05 М трис-соляный буфер (pH 8) + 0,01 М MgSO4, 0,01 М трис-соляный буфер (pH 7,5) + 0,005 М MgSO4 + 0,l% Na2SO3 + 0,l% аскорбиновой кислоты + 1% никотина; 0,03 М фосфатный буфер (pH 8) + 0,02 М ДИЭКА-Na; 0,015 М, N, N’-дифенилдитиомочевина + 0,03 М кофеин в 0,03 М фосфатном буфере (pH 8,5). Соотношение (растительные ткани : добавки) должно соответствовать виду или органу растения, из которого экстрагируется вирус. Для тканей, бедных ингибиторами и богатых влагой (лепестки цветков, листья огурца), это соотношение может составлять 1:3, для тканей, содержащих ингибиторы и большое количество сухого вещества (листья черешни или пеларгонии), необходимо соотношение от 1 : 5 до 1 : 10. Растительную ткань растирают в ступке до получения однородной суспензии, постепенно вводя буферный раствор со стабилизаторами. Измельчение тканей ускоряется и улучшается при добавлении стерильного прокаленного кварцевого песка. Подбор и выращивание тест-растений. Поскольку для характеристики вирусов большое значение имеет круг их растений-хозяев, выбор подходящих тест-растений для механической инокуляции играет при диагностике решающую роль. Среди многочисленных видов, известных как хозяева определенных вирусов, некоторые особенно чувствительны, поэтому их применяют в биотестах. Это Chenopodium quinoa, Cucumis sativus, Gomphrena globosa, Nicotiana megalosiphon, N. tabacum, Petunia hybrida, Phaseolus vulgaris. Важнейшим и восприимчивым к большинству вирусов тест-растением является Chenopodium quinoa. Этот вид особенно пригоден для выделения вирусов и в меньшей степени — для их дифференциации и идентификации. В последнем случае приходится делать пассажи с одного растения Ch. quinoa на другое (чтобы повысить концентрацию вируса), а также переносить его на дифференцирующего хозяина или применять серологическую диагностику. При необходимости в частых определениях зараженности вирусами или при подозрении на смешанную инфекцию целесообразно поддерживать в готовом к работе состоянии сортимент различных вирофильных растений-индикаторов и использовать их для изолирования вирусов. Тест-растения выращивают следующим образом. Семена раскладывают на влажную фильтровальную бумагу в чашках Петри и проращивают при 25 °С. Всходы пикируют в рассадные ящики с пропаренной или автоклавированной смесью земли, песка и торфа (1:1:1). После образования первых настоящих листьев растения пересаживают в горшки диаметром около 7 см. Горшки перед употреблением тщательно моют мыльной водой (1 часть мыла на 20 частей воды) и ополаскивают, почвенную смесь пропаривают 2 ч при 100 °С и после этого выдерживают не менее недели. Поскольку чувствительность тест-растений к вирусным инфекциям может изменяться под влиянием факторов среды, их нужно выращивать в благоприятных условиях. Растения, выросшие при избытке света, пониженных температурах и недостатке влаги, мало пригодны для диагностики. Затемнение на 24—72 ч перед инокуляцией повышает вероятность заражения. После инокуляции более благоприятны высокая интенсивность света и температуры ниже 25 °С, дальнейшее их повышение (>30°С) ставит под сомнение успех опыта. Инокуляция. При механическом переносе инокуляция проводится путем растирания тканевого экстракта но верхней стороне листа тест-растения. Через возникающие при этом мельчайшие ранки вирусные частицы проникают в еще живые клетки и инфицируют их. Количество очагов инфекции можно существенно увеличить с помощью мелкозернистых абразивов, например карборунда (размер частиц от 500 до 600 меш). Абразив напыляют на поверхность листа перед натиранием или добавляют в инокулюм. Искусственные ранки должны быть очень мелкими, чтобы они быстро заживали и не вызывали гибели клеток, поэтому натирание следует проводить очень осторожно и только с легким нажимом. Для инокуляции применяют дезинфицированный стеклянный шпатель с шероховатой поверхностью. Иногда листья натирают пальцем, однако при этом возрастает опасность загрязнения следующих образцов, особенно при работе с высококонцентрированными и стойкими вирусами. Стеклянный шпатель после каждого употребления очищают и дезинфицируют. Натирание выполняется круговыми движениями смоченного в экстракте стеклянного шпателя по поверхности листа, который поддерживают свободной рукой. После натирания инокулированную поверхность листа обмывают водопроводной водой, чтобы ослабить ингибирующее инфекцию действие инокулюма. Быстрое обсушивание поверхности листа повышает успех заражения. Реакция тест-растений. Постинфекционные реакции тест-растений, в зависимости от комбинации вирус — хозяин, появляются через несколько дней или недель. Это могут быть симптомы на инокулированных листьях или на листьях, развившихся после заражения. ВТМ вызывает через 2—3 дня местные некрозы на N. glutinosa. Примерно через 5—7 дней после инокуляции Х-вирусом картофеля (ХВК) на листьях G. globosa появляются светло-серые пятна с красноватой каймой. На Ch. quinoa вирус огуречной мозаики вызывает через 5—7 дней желтоватые или буроватые местные некрозы, а вирус скручивания листьев вишни через две недели — деформацию и некрозы верхушечных листьев. При заражении вирусом пестростебельности табака на верхних листьях N. tabacum через 2—3 недели появляются светло-зеленые и некротические полосы и кольца. Для биологической диагностики вирусов необходимо не менее шести растений каждого вида индикатора, а при использовании проростков огурца в качестве тест-растений — не менее 20 на каждую пробу. Дифференциальная диагностика на индикаторах. При естественном развитии вирусных болезней чаще всего встречаются смешанные инфекции. Механическое заражение тест-растений вирусами в большинстве случаев не дает ответа на вопрос о компонентах такой инфекции. Поэтому дифференцирующие растения для разделения смесей вирусов и штаммов исключительно важны с точки зрения диагностики. Возможности разделения некоторых часто встречающихся смесей и идентификации вирусов и их штаммов на дифференцирующих растениях можно показать на ряде примеров. На табаке, томате и других культурных растениях ветре даются различные штаммы ВТМ. Дифференциация вируса табачной мозаики (ВТМ) и вируса мозаики томата (ВМТо) возможна с помощью тест-растений. Вирусы М и S картофеля (МВК и SBK) часто встречаются в смешанных инфекциях, и их точная дифференциация по симптомам часто не удается. При механическом переносе смеси на Ch. murale SBK можно отделить от МВК, поскольку первый заражает листья этого индикатора системно, а второй не заражает. Различные розоцветные, в том числе плодовые культуры, а также другие виды культурных растений поражаются смесями непо — и иларвирусов. Для их разделения используют растения-дифференциаторы. Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter. Читайте также:
| |||