Векторы на основе вирусов животных и бактерий

При использовании фаговых векторов жизнеспособным продуктом, содержащим рекомбинантную ДНК, является не популяция клеток, как в случае с плазмидными векторами, а популяция фаговых частиц.

Фаговые векторы более эффективны, чем плазмидные, при клонировании крупных вставок.

Самыми распространенными для кишечной палочки являются векторы, сконструированные на основе фагов l и М13. Бактериофаги (фаги) - вирусы, поражающие клетки бактерий.

Могут существовать вне клетки бактерии.

Для репликации должны инфицировать клетку бактерии.

Содержат ДНК или РНК, в одно- или двуцепочечной форме, линейная или кольцевая.

Геном умеренного фага l представлен двухцепочечной ДНК размером 48,5 т. п. н., которая упакована в головку в виде линейной молекулы с однонитевыми комплементарными концами (липкие концы).

После проникновения в клетку липкие концы взаимно спариваются (в cos-сайтах), молекула замыкается в кольцо и сшивается с помощью ДНК-лигазы.

Профаг l в лизогенных клетках находится в интегрированном с нуклеоидом состоянии.

Важными для конструирования векторов являются:

1) вся центральная часть (более 1/3 генома) несущественна для литического цикла, а нужна только для установления лизогенного состояния. Таким образом, ее можно заместить на чужеродную ДНК, и при этом фаг сохранит способность лизировать клетки.

2) для успешной упаковки ДНК в головки фага требуется, чтобы ее длина была более 38 т. п. н., но менее 52 т. п. н.

В настоящее время сконструировано большое количество разнообразных векторов на основе фага l.

Типичные из них содержат сайты рестрикции для Eco RI, ограничивающие участок генома, не нужный для литического цикла. При воздействии рестриктазой Eco RI на ДНК такого вектора образуется 3 фрагмента, среди которых можно отобрать концевые (содержат гены, необходимые для литического цикла) благодаря их сравнительно большим размерам.Эти фрагменты смешивают с чужеродной ДНК, обработанной Eco RI, и получают гибридные молекулы, у которых центральная часть представлена вставочным фрагментом. Полученные гибридные молекулы упаковывают в головки фага l in vitro. Для этого используют культуры клеток E.coli, инфицированные мутантными штаммами фага l, один из которых имеет повреждение в гене, ответственном за процесс упаковки ДНК в головку, а второй — за синтез отдельных белков головки.Такие фаги не способны обусловить литический цикл, но обеспечивают накопление в клетках большого количества промежуточных продуктов, необходимых для сборки фаговых частиц: пустых головок, хвостовых отростков, ферментов, необходимых для сборки.Если экстракты таких клеток смешать с векторной ДНК, содержащей вставки определенной величины, произойдет их упаковка в головки фага и сформируются зрелые фаговые частицы. На следующем этапе этими частицами инфицируют чувствительные клетки и получают потомство фагов с клонированными ДНК. В составе векторов на основе фага l можно клонировать фрагменты длиной до 15 т. п. н

23. Векторы для клонирования в клетках грамположительных бактерий.

Векторы для клонирования в клетках грамположительных бактерий Bacillus subtilis, стрептомицетов, дрожжей Saccharomyces cerevisiae представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в Е. coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены.

Клонирование осуществляется с помощью так называемых челночных векторов, которые способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев: В. subtilis, Е. coli, Staphylococcus aureus.

Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов плазмид St. aureus, Е. coli и хромосомных фрагментов В. subtilis.

Полученные рекомбинантные штаммы несут признаки устойчивости к антибиотикам

24. Банки генов и клонотеки геномов.

Банком генов, или библиотекой генома(клонотекой), называют совокупность клонов бактерий или фаговых частиц, в которой содержится, по меньшей мере, по одному экземпляру каждой последовательности генома исследуемого организма.

Необходимое количество клонов в клонотеке определяется отношением размера генома и размеров клонируемых фрагментов ДНК.

Наиболее часто используются два типа клонотек: геномные библиотеки и библиотеки кДНК.

Геномные библиотекипредставляют собой собрание генов и последовательностей ДНК какого-то организма. Их получают обычно с помощью векторов, сконструированных на основе бактериофага l или космид. Эти векторы характеризуются большой емкостью, что позволяет уменьшить число клонов в клонотеке.

Библиотека кДНКпредставлена набором клонов, содержащих двухнитевые ДНК-копии всех мРНК клетки. Для создания этих клонотек чаще используют плазмидные или фаговые (на основе фага l) векторы.

Идентификация генов в клонотеке генома.

Идентификация генов в клонотеке генома.

Проводят анализ самой вставочной полинуклеотидной последовательности либо продуктов ее экспрессии в клетках-хозяевах.

1) Использование зондов, комплементарных определенным участкам генов или кДНК.

2) Скрининг основан на изменении фенотипа клеток, воспринявших определенный фрагмент ДНК, вновь синтезированного белка

Дата добавления: 2018-08-06 ; просмотров: 418 ;

Векторы на основе ретровирусов

Это небольшие рнк-содержащие вирусы, способные заражать только делящиеся клетки, в которых они репродуцируются. Вирусный геном (в виде провируса) встраивается в ДНК клетки-мишени. Поэтому ретровирусные векторы теоретически способны обеспечить длительную экспрессию трансгенов в некоторых типах клеток. Большинство ретровирусных векторов получено на основе вируса лейкоза мышей Молони. Геном вируса изменен так, чтобы избежать экспрессии вирусных белков в зараженных клетках, что предотвращает развитие иммунного ответа против этих клеток. Поскольку эти вирусы заражают только делящиеся клетки, ретровирусные векторы используют в основном для трансфекции клеток ex vivo или для экспериментального лечения злокачественных новообразований.

Жизненный цикл. Геном ретровирусов состоит из плюс-цепи РНК. Оболочка ретровирусов образуется из мембраны зараженной клетки и содержит вирусные белки. Для репликации генома и сборки вирусов необходимы три вирусных гена - gag, pol и env. В зараженной клетке путем обратной транскрипции на матрице вирусной РНК происходит образование двухцепочечной ДНК (провируса), которая затем встраивается в клеточный геном. Это обеспечивают вирусные белки - обратная транскриптаза и интеграза. Для проникновения провируса в ядро необходимо разрушение ядерной оболочки клетки, происходящее в ходе митоза. Встроившийся в клеточный геном провирус использует аппарат клетки для транскрипции вирусныхмРНК, их процессинга и трансляции. Жизненный цикл вируса завершается с синтезом новых плюс-цепей РНК на матрице провируса. Специфическая последовательность в молекуле РНК (psi) дает сигнал сборки, после чего новые вирусы отпочковываются от поверхности клетки.

Использование ретровирусного вектора. А. Схема получения ретровирусного вектора. Б. Экспрессия трансгена в клетке-мишени после внедрения РНК-содержащего ретровирусного вектора

Описание к рисунку 1. А. Схема получения ретровирусного вектора. Для получения не способных к репродукции ретровирусных векторов используют специальные линии клеток, способные синтезировать те вирусные белки, гены которых удалены при конструировании вектора. В клетки подходящей линии (например, эмбриональные клетки почки человека) с помощью бактериальных плазмид вводят гены gag (G), pol (Р) и env (Е). Клетки, синтезирующие соответствующие вирусные белки, называют упаковывающими. Затем плазмиду, содержащую рекомбинантную ДНК провируса, в которой вместо генов gag, pol и env находится нужный трансген, используют для трансфекции упаковывающих клеток. Теперь клетки содержат все, что нужно для сборки вирусов, и ретровирусные векторы начинают накапливаться в культуральной среде. Эти векторы содержат трансген, но лишены вирусных генов gag, pol и env, а потому при заражении следующей клетки они не могут репродуцироваться. Б. Экспрессия трансгена в клетке-мишени после внедрения РНК-содержащего ретровирусного вектора.

Конструкция и получение вектора. Ретровирусные векторы получают из соответствующего провируса. Гены gag, pol и env удаляют, чтобы освободить место для нового генетического материала и предотвратить репродукцию вируса (рис. 1). В ретровирусный вектор может быть включено до 8000 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. Поскольку рекомбинантный вирус не может синтезировать вирусные мРНК, то в трансфицированных клетках отсутствует и синтез вирусных белков, которые могли бы вызвать иммунный ответ. Вместе с геном, предназначенным для лечения, в вектор можно ввести промотор и энхан-сер, обеспечивающие эффективную экспрессию трансгена и, в ряде случаев, ее тканеспецифичность. Можно использовать также вирусные промотор и энхансер, расположенные в области длинных концевых повторов (LTR).

После удаления генов, кодирующих вирусные белки и обеспечивающих репродукцию вируса, вирус способен репродуцироваться только в специально созданных линиях упаковывающих клеток, синтезирующих эти белки (рис. 1). В геном этих клеток встраивают вирусные гены (gag, pol и env) таким образом, чтобы они находились на разных хромосомах. Это снижает вероятность обратной рекомбинации этих генов в исходный вирусный геном и образования вирусов, способных к репродукции. После введения рекомбинантной ДНК провируса в упаковывающие клетки последние начинают производить ретровирусный вектор. ДНК провируса вводят в виде плазмиды, в которой между двумя длинными концевыми повторами заключены небольшой участок гена gag с сигналом сборки и чужеродные гены. Трансфекцию упаковывающих клеток осуществляют стандартным методом. Разработано несколько модификаций этого подхода, призванных снизить вероятность рекомбинации с образованием вируса, способного к репродукции.

Клетки-мишени. Способность вируса избирательно заражать определенные типы клеток в значительной степени определяется взаимодействием между белком внешней оболочки вируса (у ретровирусов кодируется геном env) и соответствующим мембранным рецептором клетки. Вирус лейкоза мышей Молони является экотропным, то есть заражает только клетки мышей. Для расширения круга клеток-мишеней используют ген env штамма 4070А вируса лейкоза мышей. Этот штамм является амфотропным и заражает клетки не только мышей, но и других млекопитающих, в том числе - человека. Псевдотипирование, то есть упаковка вирусного генома в оболочку, содержащую белки другого вируса, позволяет расширить круг клеток-мишеней. Например, гликопротеид вируса везикулярного стоматита, называемый G-белком, легко включается в оболочку вируса лейкоза мышей Молони. Наличие этого белка расширяет круг клеток-мишеней и облегчает заражение. Кроме того, включение G-белка повышает стабильность ретровирусного вектора и позволяет при ультрацентрифугировании получить более высокий титр вирусов. Недостаток G-белка - его токсичность по отношению к упаковывающим клеткам. Этот недостаток можно частично преодолеть, используя упаковывающие клетки с индуцируемой экспрессией G-белка. Ретровирусные векторы, содержащие другие вирусные белки, например белки вируса лейкоза гиббонов или вируса лимфоцитарного хориоменингита, менее токсичны по отношению к клеткам млекопитающих.

Применение. С помощью ретровирусных векторов обычно осуществляют трансфекцию клеток больного ex vivo или векторы вводят непосредственно в ткани. Первый подход требует выделения клеток больного и поддержания их в культуре, заражения клеток ретровирусным вектором и последующего введения клеток больному. Так пытались модифицировать лимфоциты и стволовые кроветворные клетки при недостаточности аденозиндезаминазы и семейной гиперхолестеринемии. Аналогичным образом поступали, чтобы вызвать экспрессию иммуномодуляторов в опухолевых клетках. Прямую инъекцию ретровирусных векторов пробуют применять в основном для лечения солидных опухолей.

Безопасность. Поскольку вирус встраивается в клеточный геном (что важно для длительной экспрессии), причем случайным образом, существует риск возникновения мутации (инсер-ционный мутагенез). Например, встраивание вируса может изменить функцию гена, регулирующего деление клеток, что приведет к нежелательным последствиям. Способные к репродукции ретровирусы обладают некоторой канцерогенностью, однако этого не наблюдается у ретровирусных векторов, лишенных такой способности.

Эукариотический вектор представляет собой небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться в клетках животных. Помимо последовательностей нуклеотидов, обеспечивающих репликацию, эукариотические векторы могут содержать гены, используемые в качестве селектируемых маркеров, а также один или несколько уникальных сайтов рестрикции, по которым производится встраивание клонируемых последовательностей нуклеотидов ДНК. Поскольку непосредственное клонирование рекомбинантных ДНК в клетках животных было бы дорогостоящей и малоэффективной процедурой, эукариотические векторы используют, как правило, для получения экспрессии уже клонированных последовательностей нуклеотидов в клетках животных и растений, а сам процесс клонирования проводят в бактериях. Следовательно, эукариотические векторы должны быть челночными векторами . Для экспрессии в клетках рекомбинантные ДНК помещают под контроль регуляторных элементов, узнаваемых и используемых ферментативными системами эукариотических клеток.

В отличие от бактерий в клетках эукариот внехромосомные, автономно реплицирующиеся генетические элементы типа бактериальных плазмид встречаются редко. Поэтому при конструировании векторов, способных реплицироваться и осуществлять экспрессию в клетках животных, чаще всего используют регуляторные генетические элементы вирусов животных или эукариотических генов домашнего хозяйства и генов, для которых характерна тканеспецифическая экспрессия.

Манипуляции с клетками млекопитающих можно разделить на 2 большие группы: эксперименты с соматическим клетками и эксперименты по трансформации половых клеток. В последнем случае конечный результат – получение трансгенных организмов.

Одними из лучших носителей для введения чужеродной информации в животную клетку являются вектора на основе ретровирусов, например, на основе вируса лейкоза мышей. Они обеспечивают высокоэффективный перенос генов и их стабильное встраивание в хромосому клеток-мишеней. В основном трансформации животных клеток осуществляют либо с помощью ретровирусов (около 40% от всех трансформаций), либо путем упаковки ДНК в липосомы (25%), реже используют аденовирусы, так как они могут вызывать сильный иммунный ответ, кроме того, невозможно их повторное введение.

Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем - стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность — все еще нуждаются в серьезных доработках.

Прежде всего это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем, либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительной персистенции внутри ядер).

В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (MAC - mammalian artificial chromosomes). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время. Такие искусственные хромосомы уже созданы для дрожжей (YAK), так как геном дрожжей полностью картирован.

Для идентификации модифицированных клеток, необходимы маркеры. Если трансформируют соматические клетки, то применяют обычно селективные маркеры. Аксель с коллегами из колледжа терапии и хирургии Колумбийского университета исправили таким образом генетический дефект клеток мыши. Они взяли фрагмент ДНК, содержащий ген тимидинкиназы (ТК), который получен из вируса герпеса, смешали эту ДНК с несколькими миллиграммами ДНК-носителя из спермы лосося и осадили ДНК на культуру L-клеток мыши, в которых ген ТК отсутствовал (ТК-). С частотой 1 на 100000 клетки приобретали ген ТК, поэтому на селективной среде, которая не позволяла расти ТК- - клеткам, росли и нормально размножались ТК+ - клетки.

Другой селективный маркер - ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (ДГФР), можно использовать при трансформации немутантных линий клетки. Благодаря экспрессии многих копий этого гена животная клетка вместе с плазмидой приобретает устойчивость к высоким концентрациям ингибитора фермента, и таким образом трансформантов можно отбирать при высоких концентрациях ингибитора.

Разработано еще два универсальных вектора, содержащих генные маркеры, работающие в нормальных клетках. Они построены по одному и тому же принципу: прокариотические гены, определяющие фенотип трансгенных клеток, соединены с эукариотическими регуляторными сигналами.

Один из векторов состоит из прокариотического гена устойчивости к антибиотику неомицину, встроенного в раннюю область генома SV-40. Эукариотические клетки чувствительны к аналогу неомицина G 418, который инактивируется продуктом гена. Таким образом клетки, прошедшие трасфекцию приобретают способность расти на среде, содержащей G 418.

ВОПРОС №37: ОРГАНИЗАЦИЯ ВИРУСА SV40.
Вирус SV40 относится к роду Polyomavirus семейства Polyomaviridae и является мелким вирусом,двухцепочечная кольцевая ДНК которого реплицируется в ядре хозяйсткой клетки.Может размножаться вегетативно или в интегрированном в хромосомы состоянии.
Полная последовательность составляет 5243 п.н ДНК SV40.Кольцевая ДНК вируса SV40 яркий пример использования последовательности нуклеотидов для кодирования различных функций.Гены в значительной степени перекрываются.Область начала репликации перекрывается с промоторными послдовательностями,направляющими раннюю и позднюю транскрипцию.Ранний промотор устроен сложно.Имеет ТАТА-бокс на расстоянии -30 п.н..Дополнительные элементы промотора располагаются на расстоянии 115 п.н. от точки инициации и представляют собой два прямых повтора последовательностей длинной 21 п.н. С этой облстью свзяывается клеточный фактор SP1.Затем SP1 взамиодействует с другими белками,в результате чего формируется комплекс,необходимый для транскрипции,осуществляемый РНК-полимеразой 2.
В результате альтернативного сплайсинга формируются молекулы зрелых мРНК,кодирующие большой(Т) и малый (t) т-антигены.Т-антиген является единственным белком вируса ,который небходим для эффективной репликации вирусной ДНК в инфицированных клетках.Он обладает ДНК-хеликазной активностью.Т-хеликаза входящая в репликативный ферментный омплекс SV40,отличается от клеточной тем что обуславливает эффектную многократную инициацию репликации вирусной ДНК на протяжении одного цикла клетки.Т-антиген осуществляет авторегуляцию экспрессии своего гена.Способен индуцировать и поддерживать состояние онкогенной трансформации широкого спектра культур кеток млекопитающих.Малый t-антиген необходим для неопластической трансформации наряду с Т-антигеном,усиливает его действие или не требуется вовсе.Участок ori является единственным районом генома SV40,который необходим для репликации вирусной ДНК.Имеется энхансерная область которая ускоряет транскрипцию в 200раз.Кроме усилителей были обнаружены сайленсеры,которые подавляяют транскрипцию.Наличие усилителей и глушителей позваляет осуществлять тонкое регулирование транскрипции.Репликация инициируется в единственном участке ori,минимальный размер которого 65 п.н.,и происходит двунаправленно.Данный вирус позволяет изучать регуляцию экспрессии генов,репликацию ДНК,сплайсинг пре-мРНК,ДНК белковые взаимодействия.

ВОПРОС №38. ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ВИРУСА SV40.
Литические векторы на основе SV40(вирусы): Из-за насыщенности генетической структуры вируса SV40 лишь в ограниченном числе мест на его ДНК могут происходить незначительные перестройки типа вставок или делеций без потери жизнеспособности вируса. При встройке в ДНК данного вируса чужеродного фрагмента по любому из уникальных мест гидролиза рестриктазами будет происходить нарушение той или иной функции, т. е. гибридные вирусы SV40 будут дефектны. Чтобы гибридная ДНК могла упаковаться в вирусный капсид, ее размер должен составлять 70-100 % генома вируса. Поэтому для получения гибридного вирусного потомства необходимо чужеродный фрагмент ДНК встраивать в мо­лекулу вирусной ДНК, у которой предварительно с помощью рестриктаз делетирован определенный район. Такие векторы являются векторами замещения. Обязательное условие при конструировании гибридных вирусов — сохра­нение неповрежденной области начала репликации вирусной ДНК. Нарушенные при встройке в векторную ДНК другие вирусные функции необходимо комплементировать с помощью ви- руса-помощника. Молекулярные векторы данного типа на основе ДНК вируса SV40 называют литическими векторами. В большей части выполненных исследований гибридные вирусы SV40 получены замещением участка ДНК из области поздних генов вируса фрагментом чужеродной ДНК. Гибриды данного типа содержат полностью область ранних генов и репликатор вируса SV40 и могут размножаться в виде вирусных частиц при совместной инфекции пермиссивных клеток с вирусом-помощником дикого типа или термочувствительным мутантом по ранним генам (обычно tsA). Для встройки фрагментов ДНК в область поздних генов вируса SV40 можно использовать рестриктазы Нра\\, ЕсоШ, ВатШ, НаеII, Accl, Kpnl, имеющие уникальные места гидролиза на вирусной ДНК, а также Hhal, имеющую два участка гидролиза (см. рис. 14.1). При использовании других рестриктаз обычно проводят неполный гидролиз вирусной ДНК, продукты гидролиза разделяют электрофорезом и векторный фрагмент ДНК SV40 выделяют из геля.
Нелитические векторы на основе генетических элементов SV40(плазмиды): Векторы данного типа являются бифункциональными плазмидами, способными реплицироваться как в клетках Е. coli, так и в клетках млекопитающих. В клетках млекопитающих, не поддерживающих их репликацию, плазмиды могут интегрироваться в геном. Поэтому их называют эписомными векторами. Такие плазмиды конструируют встройкой в бактериальную векторную плазмиду целого генома или фрагмента ДНК вируса SV40. Встраиваемый вирусный фрагмент обычно содержит нативный вирусный репликатор, один или два промотора, а также в некоторых случаях — вирусные сигналы сплайсинга и полиаденилирования мРНК.В первых экспериментах по конструированию челночных плазмид на основе pBR322 и генома SV40 выяснилось, что в бактериальной плазмиде имеется последовательность, значительно снижающая уровень экспрессии эукариотических генов. Данная последовательность расположена в pBR322 между точкой гидролиза рестриктазой Pvull и областью начала репликации плазмиды. Делеция этого района приводит к тому, что челночная плазмида pBR-SV40 реплицируется в клетках COS с такой же эффективностью, что и нативная вирусная ДНК, и ее копийность достигает 105 молекул на клетку. Благодаря эффективной репликации и транскрипции с сигналов вируса SV40 гибридные плазмиды, конструируемые на основе эписомных векторов с делетированным глушителем транскрипции, обеспечивают в клетках COS высокий уровень продукции чужеродных белков. С использованием векторов данного типа продемонстрирована экспрессия в клетках млекопитающих клонированных генов фибробластного и иммунного интерферонов человека, поверхностного антигена вируса гепатита.

Последнее изменение этой страницы: 2016-09-19; Нарушение авторского права страницы

Как клонирующие векторы в генной инженерии используются плазмиды, вирусы и искусственные хромосомы. Самыми первыми векторами стали бактериальные плазмиды - внехромосомные автономно реплицирующиеся кольцевые молекулы ДНК. Следом для молекулярного клонирования стали использовать вирусы (фаги), которые в природе также могут захватывать и передавать ДНК от клетки к следующей клетке (трансдукция ДНК). Появились различного ряда гибридные векторы, например гибриды фагов с плазмидами - фагмиды (phagemid). Для клонирования больших фрагментов ДНК были сконструированы искусственные хромосомы.

С развитием знаний о генетических элементах и совершенствованием методов генной инженерии новые векторы под конкретные задачи начали собирать из отдельных блоков - различных хорошо охарактеризованных генетических элементов (см рис. 2.6). В настоящее время имеется огромное количество коммерчески доступных разнообразных синтетических векторов, сконструированных практически под любые задачи.

Различные типы клонирующих векторов обладают разным лимитом на размер вставок чужеродной ДНК. Основные типы современных векторов рассмотрены ниже.

Плазмидные векторы - кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, имеющие клонирующий лимит до

10 тнп (тысяч пар нуклеотидов). Плазмиды найдены практически у всех исследованных бактерий, у некоторых до

10 видов разных плазмид, каждая из них выполняет свои характерные функции. Плазмиды также обнаружены у некоторых эукариот, например, у дрожжей -три типа различных плазмид. Некоторые плазмиды можно рассматривать как молекулярных паразитов, но многие кодируют важные функции, например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, способность усваивать определенные вещества.

В одной клетке могут сосуществовать только плаз-миды, принадлежащие к разным группам совместимости. Каждая плазмида содержит сайт инициации репликации (ориджин, ori), специфичность которого определяет круг хозяев плазмиды, некоторые могут реплицироваться только в клетках одного вида, другие имеют широкий спектр хозяев. Размеры плазмид варьируют приблизительно от

Каждая плазмида имеет постоянную определенную копийность в клетке - количество молекул на клетку. На основе плазмид сконструировано огромное количество различных векторов, поскольку единственным обязательным элементом плазмиды является небольшой сайт инициации репликации, с остальной последовательностью можно проводить любые манипуляции. Схема типичного плазмидного вектора рассмотрена более подробно далее (см. рис. 2.7).

Основным недостатком плазмидных векторов является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Выраженное делетирование больших вставок чужеродной ДНК в плазмидах связано с тем, что селективное преимущество в бактериях получают плазмиды с минимальным временем репликации.

Вирусные векторы. Рассмотрим основные из них.

Бактериофаг лямбда имеет линейную молекулу ДНК с 48,5 тпн. Емкость клонирующих векторов была существенно повышена с разработкой векторов на основе фага лямбда. Центральную треть вирусного генома можно заменить чужеродной ДНК без нарушения жизненного цикла фага, клонирующий лимит от 8 до 24 тпн, что составляет половину генома лямбды дикого типа (рис. 2.4).

Механизм упаковки бактериофага в зрелые вирионы основан на включении ДНК строго определенного размера, что стабилизирует ДНК-вставки и позволяет легко освобождаться от нерекомбинантных молекул. Упаковку сконструированных in vitro молекул на основе фага лямбда производят в смеси бесклеточных экстрактов двух штаммов Е. coli, лизогенных по бактериофагам с разными дефектами. Объединение бесклеточных лизатов обоих штаммов Е. coli приводит к взаимной комплементации недостающих функций с помощью соответствующих белков дикого типа. Векторы на основе фага лямбда являются одними из самых распространенных для создания библиотек генов.

Космиды - кольцевые молекулы ДНК, объединяющие свойства фага и плазмиды, содержат ориджин репликации и соs-сайты фага лямбда. Сконструированы для клонирования больших фрагментов ДНК в 35-50 тпн. Для упаковки ДНК в фаговую головку вирусный аппарат фага лямбда требует только наличия соя-сайтов на расстоянии 36-51 тпн. Гибридные молекулы космиды с большими вставками в 35-50 тпн между соя-сайтами упаковываются in vitro в виде инфекционных вирионов при использовании экстрактов фагов дикого типа. Естественно, такие фаговые частицы нежизнеспособны, после инфекции космиды существуют в бактериальной клетке как плазмиды.

Нитевидные бактериофаги - М13 (рис. 2.5), fd, f1 бактерии E. coli. Представляют собой одноцепочечную кольцевую ДНК, упакованную в белковую трубочку из одинаковых белковых субъединиц, двухцепочечная репликативная форма похожа на плазмиду. Вставки чужеродной ДНК до 1 тпн очень стабильны. Наиболее широко ранее использовались векторы на основе фага М13. До появления метода ПЦР, который позволяет секвенировать сразу двухцепочечные молекулы ДНК, одноцепочечные матрицы для секвенирования получали клонированием в М13-вектор.

В настоящее время клонирование в векторы на основе М13 и fd преимущественно используют в методе фагового дисплея (получение и анализ пептидных библиотек для различных целей, например, для исследования белок-белковых, белок-пептидных, белок-ДНК взаимодействий, для эволюции белков in vitro, получения иммунологических реагентов нового поколения и др.). При этом чужеродную ДНК встраивают в гены белков вирусной оболочки, затем клонированные последовательности выявляются на поверхности вирусных частиц в виде гибридных белков (фьюжин-белков).

Бакуловирусы - большая и разнообразная группа вирусов. Поражают насекомых и других членистоногих, но абсолютно безвредны для позвоночных. Геном представлен кольцевой двухцепочечной ДНК, варьирующей в размере от 80 до 180 тпн. Замена несущественной для репликации части вирусного генома позволяет клонировать чужеродную ДНК до 15 тпн. Внедрение чужеродной ДНК происходит путем гомологичной рекомбинации (двойной кроссинговер) бакуловируса с небольшим плазмидным транспортным вектором, содержащим клонированный ген.

Данная система экспрессии позволяет осуществлять большинство посттрансляционных модификаций (гликозилирование, ацилирование, протеолитическое расщепление и др.), недоступных в прокариотической системе. В настоящее время векторы на основе бакуловирусов широко используются для продукции различных эукариотичеких белков в клетках насекомых. Также бакуловирусы применяются как биологические инсектициды.

Для клеток высших эукариот эффективные векторы созданы на основе хромосомной ДНК ретровирусов, вирусов SV40, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса осповакцины, вируса герпеса и др. Ретровирус-ные векторы используются особенно часто для переноса генов в клетки животных. Необходимо отметить, что при использовании вирусов в качестве векторов для животных клеток никогда не сохраняется нативный вирус - используются лишь некоторые регуляторные последовательности вируса для конструирования вектора.

Особенности молекулярной организации векторов для доставки рекомбинантной ДНК в растительные клетки рассмотрены далее.

Искусственные хромосомы. Разработка векторов типа искусственных хромосом началась для решения задачи клонирования и стабильного наследования больших фрагментов ДНК, например, для физического картирования генома в проектах расшифровки геномов, для стабильной экспрессии обширных генных комплексов в трансгенных клетках, для внедрения таких комплексов и отдельных генов в клетку-мишень без нарушения ее хромосомных структур и т.д.

Бактериальные искусственные хромосомы (bacterial artificial chromosomes - BAC) сконструированы на основе полового фактора F E. coli со строгим контролем репликации. Его генетическая система обеспечивает правильное распределение фактора F между делящимися клетками и поддерживает его копийность в 1-2 молекулы на клетку. BAC-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК в 75-300 тпн.

Дрожжевые искусственные хромосомы (yeast artificial chromosomes -YAC) - линейная ДНК, которая имеет все необходимое для репликации в дрожжах: теломеры, несколько сайтов инициации репликации (репликонов), дрожжевую центромеру (рис. 2.6). Также дополнительно содержит селективный маркер для идентификации и поддержания популяции рекомбинантных клеток. Клонирующий лимит - 100-1 000 тпн.

Бактериальные и дрожжевые искусственные хромосомы применяют для создания геномных библиотек. Причем, структурная стабильность протяженных вставок ДНК в BAC-системе существенно выше, чем в YAC-системе, чем обусловлено широкое использование BAC-системы при физическом картировании генома человека, по которому затем собиралась его полная последовательность.

Дальнейшее развитие этого направления привело к созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (mammalian artificial chromosomes - MAC). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время.