Что такое иммунодиагностика инфекционных заболеваний

В иммунодиагностике также применяют сложные реакции. Например, реакция связывания комплемента (белки сыворотки крови) (РСК): если данное антитело соединилось со своим гомологичным антигеном, с образовавшимся комплексом связывается комплемент. Затем с помощью индикаторного реактива в смеси определяется количество связанного комплемента. Присутствие в смеси комплемента свидетельствует о том, что в системе нет специфичных антител к данному антителу.

Экспресс-диагностика инфекционных заболеваний основана на реакциях с использованием меченных с помощью различных ферментов, красителей и изотопов антител и антигенов (метод радиоиммунного анализа).

ИММУНОТЕРАПИЯ И ИММУНОПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

В борьбе с инфекционными болезнями особое место отводят специфической профилактике и терапии.

Для этих целей биологическая промышленность выпускает различные биологические препараты, которые подразделяются на следующие группы:

1) ВАКЦИНЫ - средства специфической активной иммунопрофилактики, то есть создание активной специфической невосприимчивости организма к конкретному возбудителю.

Живые вакцины готовят из штаммов микроорганизмов с ослабленной вирулентностью (аттенуированных).

При введении таких штаммов микроорганизмов в организм культура должна приживаться и размножаться, но не вызывать клинических проявлений болезни, что приводит к созданию иммунитета высокой напряженности и длительности.

В настоящее время выпускают живые вакцины против сальмонеллеза, пастереллёза, бруцеллеза, туляремии, листериоза, рожи свиней, сибирской язвы и др.

Инактивированные (убитые) вакцины - в качестве вакцинного штамма используют высоковирулентные и иммуногенные штаммы микроорганизмов, убитые либо термической обработкой, либо воздействием химических веществ (например, формалина или ацетона).

Например, антирабическая вакцина (против бешенства), противочумная вакцина.

Химические вакцины - антигены и антигенные комплексы, извлеченные из микробных культур. Для их выделения используют различные физико-химические методы. Например, препараты против пневмококков (на основе полисахаридов капсул бактерий), сибирской язвы (полисахариды и полипептиды капсул), гриппа (вирусные гемагглютинин и нейраминидазы).

Анатоксины (молекулярные вакцины) - препараты обезвреженного токсина (например, столбнячный анатоксин, анатоксин ботулизма). Источники анатоксинов – промышленно культивируемые естественные штаммы-продуценты (например, возбудители дифтерии, ботулизма, столбняка). Полученные токсины инактивируют термической обработкой или формалином. В результате образуются анатоксины, лишённые токсичных свойств, но сохранившие иммуногенность.

Ассоциированные вакцины – при приготовлении совмещают антигены нескольких микроорганизмов: используют убитые микробы или их компоненты. Например, тетравакцина (против брюшного тифа, паратифов А и В, столбнячный анатоксин) или АДС-вакцины (дифтерийно-столбнячный анатоксин).

Генно-инженерные (рекомбинантные) вакцины – содержат антигены возбудителей, полученных с использованием методов генной инженерии, и включают только высокоиммуногенные компоненты, способные формированию защитного иммунитета.

Например, для активной иммунопрофилактики гепатита В предложена вакцина, представляющая собой поверхностный антиген вируса гепатита В. Его получают из дрожжевых клеток, в которые введён вирусный ген, кодирующий синтез вирусного антигена.

2) ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ –получают из крови искусственно иммунизированных животных и людей-доноров.

Гипериммунизацию осуществляют нарастающими дозами антигенов по утвержденным производственным схемам. По окончании цикла иммунизации, когда в сыворотке крови продуцентов находится максимальное количество специфических антител, у животных берут кровь.

Из крови выделяют сыворотку общепринятыми методами и стерилизуют ее через бактериальные фильтры или методом тиндализации. В качестве консервантов используют, например, растворы фенола.

Гипериммунные сыворотки применяют для лечебных и профилактических целей, так как они создают лишь временный пассивный иммунитет. Иммунитет наступает в ближайшие часы после введения сыворотки (2-3 ч) и не превышает 2-3 недель.

В ветеринарии применяют, например, поливалентную антитоксическую сыворотку против паратифа, колибактериоза, анаэробной дизентерии и ряд других.

3) ИММУНОГЛОБУЛИНЫ (Ig) - белки, синтезирующиеся в организме в ответ на антигенное раздражение и обладающие свойством антител. Их получают осаждением из сыворотки крови. В настоящее время выпускают специфические иммуноглобулины против бешенства, столбняка, сибирской язвы и др.

Практическое использование учения об иммунитете и инфекции может быть в трех направлениях: иммунодиагностика, иммунопрофилактика, иммунотерапия.

Иммунопрофилактика и иммунотерапия занимаются разработкой средств и методов специфической профилактики и лечения инфекционных и неинфекционных болезней, сопровождающихся иммунными нарушениями или возникающих в результате нарушения функций иммунной системы.

Для этих целей применяют иммунобиологические препараты, которые могут:

1.Активировать деятельность иммунной системы;

2.Нормализовать работу отдельных звеньев иммунной системы.

К иммунобиологическим препаратам относят:

1 вакцины, анатоксины;

2. иммунные сыворотки и иммуноглобулины;

5. пробиотики, эубиотики;

Иммунодиагностика: распознавания инфекционных болезней при помощи серологических реакций (РП, РА). Основана на использовании реакции иммунитета. Реакцию иммунитета можно наблюдать визуально (склеивание, осаждение). Исходя из специфичности, результат будет положителен, если антиген и антитело соответствуют друг другу, отрицательный - если несоответствуют. В реакции один компонент всегда известен, второй необходимо узнать. Для определения природы антител необходимо иметь известные антигены. Препараты, содержащие известные антигены - называются диагностикумом. По целевому назначению выделяют: бактериальные, вирусные, эритроцитарные диагностикумы.

Иммунопрофилактика: способ предупреждения инфекционных заболеваний, путем создания искусственного специфического иммунитета, с использованием иммунологических препаратов. Для этого используют вакцины, анатоксины. (история: в 1796 году Дженнер впервые сделал прививку человеку против оспы с помощью вакцин).

Вакцины - препараты для создания активного специфического иммунитета против определенных возбудителей. В этих препаратах действующим началом являются антигены.

В качестве антигена используют:

1.живые или убитые микроорганизмы;

2.антигенные вещества образуемые микроорганизмами - токсины;

3.химически синтезированные антигены, аналогичны природным;

4.антигены, получаемые методом генной инженерии.

По способу получения выделяют живые или неживые (инактивированные).

Живые вакцины - готовят из ослабленных штаммов микроорганизмов, которые потеряли вирулентность, но сохранили антигенные свойства. (бруцеллезная, гриппозная, полиомиелитная).

Живые вакцины способны размножаться в организме и вызывать вакцинальный процесс сходный с естественным процессом при заражении. Иммунитет длительный напряженный. Выпускают в сухом виде, применяют однократно подкожно.

Имеются недостатки: могут вызывать сенсибилизацию организма, содержат большой набор антигенов, могут стать причиной персистентных инфекций.

Неживые вакцины: их получают из инактивированных физическими, УФЛ, химическими способами культур патогенных бактерий. Готовят на основе чистых культур, добавляя консервант. Выпускают в жидком и сухом виде. Иммунитет кратковременный и менее напряженный. Менее иммуногены, также вызывают сенсибилизацию организма, оказывают большую нагрузку на иммунную систему.

Химические вакцины: содержат только отдельные компоненты бактериальных клеток, полученные путем обработки микробной взвеси. Химические вакцины применяют для профилактики брюшного тифа, менингита.

Анатоксины - токсины бактериального происхождения, обработанные специальным образом и вследствие этого утратившие свою токсичность, но сохранившие основные особенности структуры и антигенные свойства. Применяются для иммунопрофилактики заболеваний (дифтерия, столбняк, коклюш).

Вакцины вводят внутримышечно, подкожно, накожно, перорально.

После введения вакцин могут возникнуть общие и местные реакции: повышение температуры, головная боль, недомогание. Существуют противопоказание: лихорадочное состояние, острые инфекционные заболевания, аллергия.

Вакцины используют для проведения плановой иммунизации и для иммунизации по эпидемическим показаниям. Для создания выраженного иммунного ответа, для некоторых вакцин предусматривается ревакцинация через определенные интервалы в 30-45 дней. Поскольку искусственный иммунитет после вакцинации сохраняется недолго, прививки проводят неоднократно в течение жизни человека.

Иммунотерапия: это лечение, при котором осуществляется воздействие на иммунную систему: её стимуляция, восстановление или исправление иммунных структур с помощью иммунных сывороток, иммуноглобулинов.

Иммунные сыворотки - применяют для создания искусственного пассивного иммунитета. К ним относят специфические иммунные сыворотки и иммуноглобулины. Эти препараты содержат готовые антитела.

Антитоксические сыворотки: применяют для лечения дифтерии, столбняка, ботулизма. Получают путем гипериммунизации животных анатоксином, содержат антитела против экзотоксинов. Активность сывороток измеряется в МЕ.

Антибактериальные сыворотки: содержат специфические антитела против соответствующих антигенов. Для получения данных сывороток проводят длительную неоднократную иммунизацию животных, соответствующими микроорганизмами. После последней иммунизации у животных берут кровь и получают сыворотки, которые содержат специфические антитела. Сыворотка должна содержать высокий уровень антител, который выражается титром - это наибольшее разведение сыворотки, которое еще вызывает феномен специфичности действия.

Иммуноглобулины - препараты, содержащие гамма - глобулин, выделенный из сыворотки крови. Их готовят из сыворотки человека и животных. В наше время иммуноглобулины применяют, чаще, чем сыворотки. Используют для профилактики кори, гепатита, краснухи. Целесообразно вводить эти препараты впервые дни после заражения, пока патологический процесс еще не развился. После их введения создается пассивный искусственный иммунитет, его напряженность не велика, а длительность не превышает 1,5-2 недель.

Сыворотки и иммуноглобулины вводят внутримышечно и внутривенно.

Эубиотики - иммунологические препараты, используемые для профилактики и лечения дисбактериоза. Представляют собой живую культуру непатогенных бактерий, относящихся к нормальным представителям микрофлоры человека. Пример бифидумбактерин, лактобактерин.

Дата добавления: 2016-05-25 ; просмотров: 1691 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Иммунодиагностика (лат. immunis свободный, избавленный от чего-либо + диагностика) — использование иммунологических методов для диагностики заболеваний или нарушений защитных функций организма. Методы Иммунодиагностики основаны на специфическом взаимодействии антигена с антителами, иногда в присутствии других (индикаторных) компонентов реакции. Иммунодиагностика наиболее широко применяется в области инфекционной патологии, аллергологии, гематологии, в онкологии и при переливании крови, а также при изучении трансплантационного иммунитета и аутоиммунных заболеваний.

Иммунодиагностика заболеваний часто связана с выявлением и идентификацией антигенов, играющих этиологическую или патогенетическую роль. Выявление антигенов имеет важное значение в Иммунодиагностике инфекционных (бактериальных, вирусных, грибковых, паразитарных) заболеваний. Выделенные из организма больного бактерии часто идентифицируют в реакциях агглютинации (см), и иммунофлюоресценции (см.) со специфическими антисыворотками. Для идентификации вирусов используют реакцию нейтрализации, регистрируемую или по торможению гемагглютинации (см.), вызываемой вирусами, или по нейтрализации их инфекционности. Антигены, находящиеся в растворенном состоянии (напр., австралийский антиген в сыворотке больных гепатитом, антигены дизентерийных или холерных бактерий в испражнениях больных), выявляют в реакциях преципитации (см.), реакции связывания комплемента (см.), торможения пассивной гемагглютинации. В онкологической клинике для Иммунодиагностики рака печени и кишечника используют определение в сыворотке альфа-фетопротеина и других эмбриональных антигенов с помощью метода иммунодиффузии (см.). В современной эндокринологии широко используют радиоиммунол. определение инсулина и других гормонов.

Другое направление И. заключается в исследовании иммунного ответа на инфекционные, аллергические и трансплантационные антигены или собственные антигены при аутоиммунных заболеваниях. Ответ может выражаться в продукции гуморальных антител или в формировании клеточного иммунитета.

Определение сывороточных антител — антибактериальных, антитоксических, противовирусных и других — регистрируют методами классической серологии (см. Серологические исследования): в реакции агглютинации (напр., реакция Видаля при брюшном тифе), пассивной агглютинации с эритроцитами или частицами, нагруженными бактериальными или грибковыми антигенами, РСК, преципитации, нейтрализации вирусов. Неполные антитела, имеющие значение в диагностике хронических инфекций, определяют в пробе Кумбса с антиглобулиновой сывороткой (см. Кумбса реакция). Токсиннейтрализующие антитела выявляют также in vivo путем внутрикожного введения небольших доз токсина (проба Шика при дифтерии, проба Дика при скарлатине). В аллергологии используют кожные пробы с аллергенами (см. Кожные пробы). Возникновение кожной реакции немедленного типа указывает на наличие у больного IgE-антител (реагинов), специфичных к данному аллергену. Иногда кожные пробы с аллергенами ставят в пассивном варианте — проба Прауснитца — Кюстнера (см. Прауснитца-Кюстнера реакция). Методы И., напр, с применением лимфоцитотоксических антител, используют в трансплантационной иммунологии при тканевом типировании донора и реципиента по антигенам гистосовместимости.

Помимо выявления специфических антител, для И. некоторых заболеваний используют определение количества сывороточных иммуноглобулинов как косвенный показатель развития иммунного ответа. Так, увеличение уровня IgA и IgM в сыворотке новорожденного указывает на внутриутробную инфекцию — сифилис, Токсоплазмоз и проч., повышение IgE — на аллергическую природу заболевания. Выявление в сыворотке гомогенного по структуре и антигенным свойствам иммуноглобулина (моноклонового) играет большую роль в И. гаммаглобулинопатий, напр. Вальденстрема болезнь (см.), миеломная болезнь (см.).

В Иммунодиагностике аутоиммунных заболеваний важное место занимает определение сывороточных аутоантител: ревматоидного фактора при ревматоидном артрите и других коллагенозах, антител к ядрам клеток при системной красной волчанке, антиэритроцитарных антител при аутоиммунных анемиях.

Иммунные сдвиги, касающиеся клеточного иммунитета, исследуют или in vivo с помощью кожных проб, выявляющих гиперчувствительность замедленного типа (напр., реакции Пирке и Манту при туберкулезе), или in vitro с помощью тестов на способность лимфоцитов к бластотрансформации при контакте с антигеном; определяют также способность лимфоцитов к продукции фактора, тормозящего миграцию макрофагов (МИФ), что является эквивалентом гиперчувствительности замедленного типа.

Иммунодиагностика нарушения иммунологических функций организма основана на исследовании неспецифических иммунных реакций и функций специфического гуморального и клеточного иммунитета.

Для оценки неспецифических иммунных реакций исследуют способность полиморфно-ядерных фагоцитов (нейтрофилов) к миграции под воздействием хемотаксических факторов, к поглощению корпускулярных антигенов, к их внутриклеточному перевариванию. Важное значение имеет также определение комплемента сыворотки, в том числе отдельных его компонентов.

Снижение неспецифических иммунных реакций может зависеть от генетических дефектов, замедления темпов иммунного созревания, неблагоприятного воздействия заболеваний (диабет), интоксикаций (алкоголизм).

Для оценки функций гуморального специфического иммунитета определяют уровень сывороточных иммуноглобулинов разных классов, уровень нормальных антител — изогемагглютининов, антител к распространенным бактериальными вирусным антигенам или способность к антителообразованию при иммунизации различными вакцинами, используемыми как тест-антигены.

Указанные методы позволяют диагностировать первичные иммунодефицитные состояния (врожденная агаммаглобулинемия, различные дисгаммаглобулинемии) и вторичные иммунодефицитные заболевания, возникающие вследствие нарушения синтеза иммуноглобулинов (напр., при лимфопролиферативных заболеваниях) или усиления их катаболизма (при тиреотоксикозе, нефротическом синдроме). Определение антителообразования на тест-антигены позволяет выявить состояние иммунол, ареактивности при нормальном уровне иммуноглобулинов.

Для оценки функций клеточного иммунитета исследуют реакции гиперчувствительности замедленного типа на внутрикожное или подкожное введение различных антигенов (туберкулина, грибковых антигенов) и способность лимфоцитов к трансформации и пролиферации под влиянием неспецифических митогенных стимуляторов (напр., фитогемагглютинина). Реакцию оценивают по интенсивности бластотрансформации, по величине митотического индекса или по включению радиоактивных предшественников РНК и ДНК.

Исследование клеточного иммунитета необходимо для диагностики иммунодефицитных состояний, связанных с недостаточностью системы Т-лимфоцитов.

Разнообразие задач, решаемых с помощью Иммунодиагностики, высокая чувствительность и специфичность ее методов определяют широкое использование Иммунодиагностики в разных областях клин, медицины.

Библиография: Иоффе В. И. Клиническая и эпидемиологическая иммунология, Л., 1968, библиогр.; Петров Р. В. Иммунология и иммуногенетика, М., 1976, библиогр.; Современные проблемы иммунологии и иммунопатологии, под ред. А. А. Смородинцева и др., Л., 1970; Bellanti J. A. Immunology, Philadelphia, 1971; Rоitt I. M. Essential immunology, Oxford, 1971.

Иммунологическая диагностика инфекционных заболеваний основана на выявлении антител в организме пациента к возбудителю инфекции методами серологических исследований. В их основе - взаимодействие антигена и антитела с образованием иммунных комплексов. Серологические реакции применяются в двух направлениях:

1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого.

2. Установление родовой, видовой и типовой принадлежности микроба или вируса.

Реакция агглютинации (РА). Принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и др. корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок. Различают реакцию микробной агглютинации, гемагглютинации, латексагглютинации, коаглютинации и т.д. (от вида иммунодиагностикума). Различают прямую и непрямую реакции агглютинации.

Реакция прямой агглютинации. В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютиногены). Обычно используется взвесь инактивированных микроорганизмов. Для определения вида микроорганизмов используют специальные диагностические агглютинирующие сыворотки, полученные путем гипериммунизации лаб. животных взвесью бактерий. Титром такой сыворотки является ее наибольшее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглютинация соответствующего антигена.

Реакция связывания комплемента (РСК). Помимо антигена и антител принимает участие третий компонент - комплемент, который способен связываться с комплексом антиген-антитело. Образование комплексов антиген-антитело и фиксация комплемента не сопровождаются видимыми изменениями. Для обнаружения связывания комплемента используют дополнительную индикаторную гемолитичесчкую систему (эритроциты барана, обработанные гемолитической антисывороткой). В присутствии комплемента (сыворотки морской свинки) происходит лизис эритроцитов. Если в опытной системе образовались комплексы антиген-антитело, которые связывают комплемент, то лизис эритроцитов в индикаторной системе не произойдет (реакция положительная). Используется при определении антител к вирусу Коксаки, при лабораторной диагностике сифилиса - реакция Вассермана.

Реакция лизиса. Сущность реакции состоит в том, что при взаимодействии специфических антител с антигенами клеток (эритроцитов, бактерий), на их поверхности образуется комплекс, который активирует комплемент по классическому пути, вследствие этого происходит лизис этих клеток. Эта реакция используется при типировании антигенов системы HLA на лимфоцитах. К типируемым лимфоцитам добавляют антисыворотки против различных HLA-антигенов, затем их отмывают и добавляют комплемент. Присутствие соответствующего антигена приводит к лизису лимфоцитов.

Реакция иммунофлюоресценции. Прямой метод иммунофлуоресценции (по Кунсу) основан на взаимодействии антител, меченных флуорохромом с антигеном, который находится на клетке, в клетке или тканях. В качестве флуорохрома часто используют флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ). Этот краситель дает зеленое свечение в ультрафеолетовых лучах, а тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ) - оранжево-красное свечение. Прямой метод одноэтапный: на фиксированный мазок клеток с антигеном наносят диагностическую сыворотку с мечеными антителами, инкубируют, отмывают и учитывают свечение в люминесцентном микроскопе. Непрямой метод иммунофлуоресценции заключается в том, что антиген обрабатывают обычной диагностической сывороткой, а для обнаружения образовавшегося комплекса антиген-антитело используют антисыворотку, меченную флуорохромом. Непрямой метод позволяет обнаруживать различные комплексы антиген-антитело с помощью одной меченной антиглобулиновой сыворотки. Метод иммунной флуоресценции применяют для идентификации бактерий, вирусов, клеточных рецепторов и антигенов.

Иммуноферментный анализ (ИФА). В методах иммуноферментного анализа используют иммунореагенты, меченные ферментами. Наиболее широко используется твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы используют полистироловые или поливиниловые планшеты или шарики, на которых адсорбированы антигены или антитела. Для выявления антител известный антиген адсорбируют в лунках полистироловой пластины. Затем вносят исследуемую сыворотку, в которой хотят обнаружить антитела к данному антигену. После инкубации лунки промывают для удаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченые ферментом. После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат и хромоген для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. О наличии и количестве антител судят по изменению цвета и интенсивности окраски раствора. Методы ИФА обладают высокой чувствительностью и специфичностью и получили наиболее широкое распространение среди иммунологических методов клинико-лабораторной диагностики.

Радиоиммунологический анализ. Принцип радиоиммунологического анализа (РИА) основан на выявлении комплекса антиген-антитело, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом. Обычно используют изотопы йода (I-125 и I-131). Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию радиоактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специальных счетчиков ионизирующего излучения.

Иммуноблотинг. Вариант ИФА, повышающий чувствительность метода при изучении гетерогенной смеси антигенов. Смесь антигенов подвергают дискэлектрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Полученные таким образом индивидуальные полосы антигенов переносят на нитроцеллюлозные полоски с помощью специального аппарата для переноса. В дальнейшем ход реакции сводится к гетерогенному не конкретному ИФА. Нитроцеллюлозные полоски с перенесенными на них антигенами обрабатывают испытуемой сывороткой. Имеющиеся в ней антитела связываются с индивидуальными антигенами, представленными в виде отдельных полос. Связавшиеся антитела проявляют при обработке конъюгатом фермента с антителами к иммуноглобулинам человека. На последнем этапе определяют активность фермента. Таким образом, можно определить против каких антигенов смеси направлены антитела сыворотки больного. На основе реакции иммуноблотинга созданы диагностические наборы для определения в сыворотке больного антител к вирусу гепатита С и ВИЧ-1-2.

Гибридизационный анализ (ГА). Проводится определение нуклеиновых кислот по связыванию с ДНК- и РНК- зондами. Метод ГА основан на отжиге одноцепочечного фрагмента нуклеиновой кислоты на комплиментарный ему участок другой молекулы анализируемой нуклеиновой кислоты с образованием двух цепочечной гибридной молекулы. Зонд может быть получен либо химическим синтезом олигонуклеотидов. Либо с помощью синтеза ДНК на одной из нитей детектируемой ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы (для РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы). Полученная копия может быть встроена в плазмиду и затем размножена в составе каких-либо бактерий. Зонд должен иметь репортерную группу, выявляемую ферментативно или физическим методом. В настоящее время в медицинской практике успешно применяются ДНК-зонды, в которых в качестве репортерных групп используют биотин, дегоксигенин, комплексы платины и др. Введение меток может производиться с помощью химических, физических, фотохимических и ферментативных реакций. В частности при амплификации. Также разнообразны методы детекции образовавшегося гибрида нуклеиновых кислот: с помощью хромогенных и хемилюминесцентных субстратов высокоактивных ферментов (пероксидаза, щелочная фосфатаза), люминесценции и др. На основе нерадиоизотопного ГА созданы диагностикумы для выделения вируса папилломы, герпеса, хламидий и уреаплазмы.

Билет № 14

Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

Иммунологические методы используются в диагностических исследова­ниях, проводящихся в двух направлениях:

• иммунодиагностика инфекционных заболеваний;

• характеристика функционального состояния иммунной системы.

Для инфекционных заболеваний характерно наряду с неспецифическими проявлениями патологии появление во внутренней среде организма также специ­фических для данного возбудителя (антигены, токсины и т.п.) и иммунного ответа.

Иммунодиагностика инфекционных заболеваний включает в себя: 1) специ­фическое распознавание маркеров возбудителя и реагирующих с микробными продуктами комплементарных структур (антител, рецепторов клеточной поверх­ности, участков молекул нуклеиновых кислот); 2) определение изменения функ­циональной активности различных компонентов иммунной системы (количества и функциональной активности лимфоцитов, соотношения их субпопуляций, актив­ности клеток фагоцитарной системы, концентрации иммуноглобулинов и т.п.).

В основе наиболее часто используемого для выявления антител или анти­генов иммунохимического анализа лежит формирование иммунного комплекса антиген-антитело в результате взаимодействия антигенной детерминанты с ком­плементарной областью иммуноглобулина (активный центр). В процессе реак­ции антиген-антитело происходит возникновение мультимолекулярных комплек­сов при участии огромного числа молекул антигена и антител и формирование воспринимаемого визуально преципитата. Преципитационные методы проводят­ся в растворе (нефелометрия и турбодиметрия, основанные на рассеивании све­та частицами преципитата) или в геле (иммунодиффузия и иммуноэлектрофо-рез). В настоящее время наиболее распространена одиночная радиальная им­мунодиффузия по О.Мапст! для количественного анализа (антиген радиально диффундирует из лунки в гель, содержащий антитела, причем образуется об­ласть преципитации, площадь которой прямо пропорциональная количеству ан­тигена в лунке) и двойная радиальная иммунодиффузия для качественной ха-

рактеристики (антиген из центральной лунки и антитела из радиально располо­женных вокруг лунок диффундируют навстречу друг другу, образуя или нет поло­сы преципитации, что позволяет делать вывод об антигенных свойствах данного антигена). К иммуноэлектрофоретическим методам относятся методики, основан­ные на явлении миграции компонентов иммунных комплексов в электрическом поле. Электрофорети ческое разделение смеси антигенов в геле сочетается с пре-ципитационным выявлением их с помощью двойной ^ммунодиффузии-

Для диагностики инфекций параллельно с методами преципитации, начи­ная с конца 19 века, широко использовались методы, в основе которых лежит взаимодействие корпускулярных антигенов (эритроциты, бактериальные клет­ки) с антителами (прямая агглютинация). Методы пассивной агглютинации ис­пользуют частицы, сенсибилизированные антигенами или антителами, для вы­явления бактериальных и вирусных антигенов или антител к ним.

В настоящее время наиболее широко распространены индикаторные ме­тоды, использующие для выявления реакции антиген-антитело различного рода метки (радиоактивные, флюоресцентные. ферментные).

Методики, при выполнении которых наличие иммунного комплекса выяв­ляется с помощью радиоактивной метки, введенной предварительно в состав одного из компонентов (антитела или антигена), называются радиоиммунноло-гическим анализом (РИА). Наиболее известны 2 разновидности РИА; радиоим-мунопреципитация (РИП) и твердофазный радиоиммунологический анализ (ТФРИА). Количественный анализ преципитата, образовавшегося в процессе РИП, проводится с помощью счетчиков радиоактивности либо с помощью ауто-радиографии. Использование ТФРИА, в котором антиген или антитело изначаль­но иммобилизуется на больших по размерам частицах или пластике, а при про­ведении реакции на иммобилизованный компонент сорбируются остальные, дает возможность удалятьиз реакционной смеси не вошедшие в иммунный комплекс макромолекулы с помощью простой отмывки.

В клинической практике нашли широкое применение иммунофлюоресцен-тные методы, использующие антигены или антитела с введенными в их состав флюоресцентными метками. О наличии или отсутствии иммунного комплекса, сформированного в результате реакции антиген-антитело, судят по интенсив­ности флюоресценции. Наиболее распространенными являются два варианта (прямой и "сэндвич" методы) иммунофлюоресцентной микроскопии (ИФМ). ИФМ позволяет не только удостовериться в наличии антигена вирусов или бактерий в клиническом образце, но и установить локализацию его в определенных клеточ­ных или субклеточных структурах.

В настоящее время интенсивно развиваются более чувствительные мето­дики с использованием для метки антигенов или антител положительно заря­женных ионов редкоземельных элементов — лантанидный иммунофлюоресцен-тный анализ (ЛИФА).

Особенно широко в последние годы в медицине используется твердофаз­ный иммуноферментный анализ (ИФА или Е1-15А). В качестве индикаторной мо­лекулы в ИФА используется молекула фермента. Чувствительность ИФА может быть очень высокой, так как одна молекула фермента может модифицировать большое число молекул субстрата. Один из участников реакции антиген-антите­ло иммобилизуется на твердом носителе. Для обнаружения в клинических об­разцах бактериальных или вирусных антигенов на твердую подложку (полисте-рол) последовательно сорбируются первичные антитела, выявляемый антиген И вторичные антитела с введенной в них ферментной меткой. Для обнаружения

386

антител в биологических жидкостях антиген иммобилизуется на твердом носи­теле, затем исследуемая сыворотка контактирует с иммуносорбентом. Адсорб­ция специфических к данному антигену антител выявляется с помощью меченых антивидовых антител.

Благодаря развитию молекулярной биологии и генетических исследова­ний, разрабатывается направление в диагностике, использующее методы ген­ного зондирования, в основе которых лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации (образованию двухцепочечных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов: А-Т, Г-Ц). Основной принцип генного зондиро­вания (взаимодействие комплементарных структур) методически реализуется способами индикаторных методов иммунодиагностики, при использовании тех же индикаторов (радиоактивные изотопы, флюоросцеины, биотин). На присут­ствие инфекционного агента проводится анализ образцов сыворотки крови, мочи, уретральных соскобов, цельной крови и т.п. Осуществляется лизис клеток, де­натурация ДНК (переход в одноцепочечную форму), затем фиксация на носите­ле (нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране), инкубация в вакууме при 80°С, гибридизация с зондом (участки ДНК или РНК, выдепенные из возбудителя или синтезированные химически олигонуклеотиды), детекция образовавшегося ком­плекса. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет увели­чить концентрацию определенной последовательности ДНК в пробе за счет син­теза многочисленных копий \п уИго. Для этого к исследуемому образцу ДНК до­бавляют препарат ДНК-полимеразы, избыток ол иго нуклеотидов и 2 праймера, соответствующие концевым участкам интересующей последовательности ДНК. Затем производится плавление (денатурация ДНК). ПЦР позволяет существен­но повысить чувствительность анализа, что важно при низком содержании воз­будителя или при исследовании субмикроскопического количества патологичес­кого материала.

Вторым важным направлением использования иммунологических методов является характеристика функционального состояния отдельных звеньев иммун­ной системы и факторов неспецифической защиты, взаимодействующих с ними. Выявление дефицита какого-либо из них позволяет своевременно начать соот­ветствующую и ммун о корригирующую терапию.

Среди большого набора тестов, существующих в настоящее время для оценки любого компонента иммунной системы, выделяют тесты, с помощью ко­торых можно диагностировать наиболее частые нарушения или получить наибо­лее важную информацию о состоянии иммунной системы, так называемые тес­ты 1-го уровня. Они дают возможность выявить грубые поломки в иммунной си­стеме. Тесты 2-го уровня позволяют установить их механизмы.

Для оценки активности системы фагоцитов используют тесты 1 -го уровня:

абсолютное число нейтрофилов и моноцитов, интенсивность поглощения мик­робов фагоцитами, способность фагоцитов убивать микробы.

Нейтрофилы, являясь одним из активных факторов в системе клеточно-гуморальной кооперации, принимают непосредственное участие не только в противомикробной, но и в противовирусной защите через феномен антитело-зависимой клеточной цитотоксичности либо путем прямой адсорбции вирусов на поверхности клетки с последующим фагоцитозом и дезинтеграцией их в фа-гол и зосо мах.

Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов проводится с использова­нием методов, основанных на способности этих клеток к поглощению корпуску­лярных агентов, находящихся всреде, фагоцитарное число (среднее числочас-

тиц, поглощенных одной клеткой) и фагоцитарный индекс (число активнофаго-цитирующих клеток) определяются после инкубирования клеток частицами ла­текса или эритроцитами. Широко используемым чувствительным и информатив­ным способом оценки функционального состояния нейтрофилов является тест восстановления нитросинего тетразолин (НСТ). Восстановление НСТ в фагоци­те прямо зависит от эффективности метаболических путей в клетке, в которой вырабатываются активные формы кислорода с выраженными антимикробными свойствами. Усиленная активация кислородного метаболизма у фагоцитов яв­ляется одним из самых чувствительных индикаторов возбуждения поли- и моно-нуклеарных фагоцитов, хотя и косвенным критерием фагоцитарной активности. Она может регистрироваться также с помощью хемилюминесценции. Важным принципом исследования фагоцитов в клинике является выяснение способнос­ти клеток реагировать на стандартный стимул, что может служить показателем их функционального резерва.

Применяемые для оценки интенсивности хемотаксиса фагоцитов и экс­прессии молекул адгези и (СОИ а, СОПЬ, С011с и др.) на поверхностной мемб­ране нейтрофилов методы относятся ктестам 2-го уровня.

Оценка В-системы иммунитета проводится с использованием следующих методов: 1) определение иммуноглобулинов О, А, М в сыворотке крови; 2) оп­ределение иммуноглобулинов Ев сыворотке крови; 3) определение количества В-лимфоцитов.

Важным параметром служит концентрация иммуноглобулинов, которая оп­ределяется в сыворотке крови методом радиальной иммунодиффузии или мето­дом нефелометрии. Отклонения в уровнях иммуноглобулинов могут быть связаны с инфекцией, поликлональной активацией, аутоиммунным процессом. Иммуно-дефициты, связанные с биосинтезом антител, проявляются прежде всего в виде длительно протекающих рецидивирующих инфекций респираторного тракта, хро­нических синуситов, отитов и др. Дефицит 1дА ассоциируется с аутоиммунными и аллергическими заболеваниями, при которых часто повышен уровень 1дЕ.

Наиболее важными тестами 2-го уровня являются: определение субклас­сов иммуноглобулинов, особенно 1дС, секреторного 1дА, специфических анти­тел к белковым и полисахаридным антигенам, способности лимфоцитов отве­чать пролиферацией на В- (липополисахарид, стафилококк) и Т-В-митогены (ми-тоген лаконоса). Определение дефицита по субклассам !д0 может иметь опре­деленную диагностическую значимость. Например, дефицит !дй2, содержащих преимущественно антитела против полисахаридов инкапсулированных бактерий, ведет к повышенной заболеваемости респираторными инфекциями.

С разработкой гибридомной техники появились уникальные возможности использовать моноклональные антитела как инструмент изучения и идентифи­кации различных популяций и субпопуляций лимфоцитов по наличию на поверх­ности клеток структур с определенными свойствами и тканевой специфичнос­тью (12). Все основные антигенные маркеры лимфоцитов и других клеток им­мунной системы в соответствии с международной классификацией получили название кластеров дифференцировки (СО), Используя меченные флюорохро-мами моноклональные антитела, с помощью флюоресцентной микроскопии или проточной цитофлюорометрии можно определить процент и абсолютное коли­чество В-лимфоцитов (С019, С020) в периферической крови.

Оценку Т-системы иммунитета проводят с применением тестов 1-го уров­ня: общего числа лимфоцитов, процента и абсолютного числа зрелых Т-лимфо-цитов (СОЗ) и двух основных их субпопуляций (С04 и С08), пролиферативного

388

ответа на Т-митогены (ФГА и Кон А). Выявление нарушений в Т-клеточном звене иммунитета имеет диагностическую ценность, так как для них характерны пнев­монии, вызванные Рпеитасузйссаппп, хронический кандидоз, хроническая ди­арея, токсоплазмоз, атипические микобактериальные инфекции, цитомегалови-русная инфекция и т.д., —заболевания, где этиологическим фактором являются факультативно- и обл и гатно-внутри клеточные паразиты.

Оценка функциональной активности Т-системы иммунитета исключитель­но важна, так как она может быть существенно изменена при нормальном коли­честве Т-клеток и их субпопуляций. Наиболее простым методом оценки функци­ональной активности лимфоцитов является реакция бласттрансформации, ко­торую оценивают по способностиклеток отвечать пролиферацией на митогены (фитогем агглютинин, конканавалин А, митоген лаконоса). О пролиферативной активности судят по включению радиоактивной метки в ДНК лимфоцитов, кото­рую определяют по числу сцинтилляций с помощью р-счетчика радиоактивнос­ти. Пролиферативный ответ на митогены понижен практически при всех хрони­ческих инфекционно-воспалительных заболеваниях, при иммунодепрессивной терапии, при СПИДе, первичных Т-клеточных иммунодефицитах.

Определение продукции цитокинов, пролиферативного ответа на специ­фические антигены, кожные тесты с микробными антигенами относят к тестам 2-го уровня. Выявление нарушения синтеза ИЛ-2 сочетается с повышением чув­ствительности организма к внутриклеточным микроорганизмам. Велика роль провоспалительных цитокинов (ФНО, ИЛ-1,у-ИФН) в этиопатогенезе различных острых и хронических воспалительных процессов инфекционной и аутоиммун-ной природы. Провоспалительные иммуноцитокины, секретируемые моноцита­ми и лежащие в основе запуска каскада иммунопогических и острофазовых вос­палительных реакций, связаны с развитием инфекционного заболевания. Повы­шенное образование этих цитокинов определяется в случаях бактериальных ин­фекций. На фоне антибактериальной терапии концентрация их снижается. Со­хранение ги пер продукции провоспалительных цитокинов и выявление высоких их уровней в сыворотке крови и/или ликворе расценивается как неблагоприят­ный прогностический признак, так как часто сопровождается развитием септи­ческого шока и летальным исходом (13).

Наиболее часто исследуемыми в клинике цитокинами являются интерфе-роны, обладающие антивирусной, антипролиферативной и иммуномодулирую-щей активностью. В ответ на стимуляцию вирусами или клеточными активатора­ми лейкоциты и макрофаги продуцируют ИФН-а (лейкоцитарный), фиброблас-ты и эпителиальные клетки ИФН-р (фибробластный), Т-лимфоциты ИфН-у (им­мунный). Определение интерферонового статуса у больных проводят путем ко­личественного измерения титра сывороточного ИФН, уровня спонтанной про­дукции ИфН лейкоцитами, интерфероновой реакции лейкоцитов в ответ на ин­дукторы ИФН: ИФН-а — вирус болезни Ньюкастла (ВБН), — ИФН-а,р — ридос-тин, ИФН-у — фитогемагглютинин. За единицу активности ИФН принимают ве­личину, обратную его разведению, ингибирующую на 50% цитопатическое дей­ствие вируса энцефаломиокардита мышей (ЕМС) на монослой клеток-фиброб-ласговМ-19. Для больных с инфекционными заболеваниями характерно повы­шение уровня сывороточного и спонтанно продуцируемого !п УИто ИФН при сни­женной способности к индуцированному синтезуИФН.

Одной из причин инфекционно-воспалительных заболеваний новорожден­ных является интраамниотическая инфекция (ИАИ). Ранний диагноз ИАИ труден в связи с поздним появлением клинических симптомов. При лабораторном ис­следовании амниотической жидкости также не существует золотого стандарта.

389

В последнее время к таким методам как подсчет лейкоцитов, окраска мазков по Граму, культуральные тесты, определение активности лейкоцитарной эстеразы и концентрации глюкозы, присоединяется идентификация интерлейкинов. Вы­соко предсказательным в отношении микробной инвазии амниотической жид­кости и неонатальной заболеваемости недоношенных новорожденных является определение одного из главных провоспалительных цитокинов, которые опос-редуют ответ хозяина на инфекцию, —ИЛ-6 (14). Определение воспалительных медиаторов ассоциируется с гистологически диагностируемой предродовой инфекцией и церебральными параличами. Найдена высокая связь повреждения белого вещества головного мозга у новорожденных, отнесенных в группу риска по выявлению присутствия гистологических хориоамнионитов и повышенных концентраций ИЛ-6 и ИЛ-1 (15,16).

Даже краткое описание арсенала методов, существующих в настоящее время, позволяет представить себе методические возможности для оценки со­стояния защитных средств организма.

Дата добавления: 2018-02-28 ; просмотров: 647 ;