Фаготипирование стафилококков определение источника инфекции

Определение фаготипа проводится с помощью специальных наборов типовых фагов и является одним из методов внутривидовой дифференциации бактерий.

1. Помощь эпидемиологу в выявлении источников и путей циркуляции инфекции при внутрибольничном заражении;

2. Для идентификации микроба.

Определение фаготипа стафилококка проводят при помощи фагов, разведенных до тест- разведения, обозначенного на этикетке. Каплю 4-х часовой бульонной культуры распределяют на поверхности подсушенного агара в чашке Петри. Дно чашки расчерчивают на 22 квадрата по числу фагов, затем капают фаги по одному в каждый квадрат. Посев инкубируют в термостате 18 часов при температуре 37 о С. На 2-й день проводят учёт результатов; фаготип культуры соответствует тому фагу, который в тест-разведении вызывает её полный лизис. В зависимости от чувствительности культуры к фагу наблюдается разная степень лизиса:

+ + + - сливной лизис с вторичным ростом

+ + - более 50 негативных колоний (стерильных пятен)

+ - единичные негативные колонии (стерильные пятна)

Также проводится фаготипирование брюшнотифозных (44 типа) и паратифозных бактерий (15 типов), энтеропатогенных эшерихий (24 типа).

Реакция фаголизиса.

Реакция фаголизиса ставится для идентификации возбудителя дизентерии.

1) чистая культура шигелл на скошенном агаре;

3) дизентерийный бактериофаг

1) Проверка культуры шигелл на чистоту (окраска по Граму);

2) Посев в 2 пробирки с МПБ

4) Посевы инкубировать в термостате 18-20 часов при темпратуре 37 о С

1) Регистрация результатов посева

Иммуноферментный анализ (ИФА)

1. Полистироловый планшет;

2. Антитела к HbsAg;

3. Конъюгат – мышиные моноклониальные антитела, меченые пероксидазой;

4. Контрольные сыворотки;

5. Фосфатно-солевой буфер;

6. Ортофенилдиамин (ОФД).

Реакция протекает в две фазы. HbsAg связывается с гомологичными антителами, меченными пероксидазой. Затем ставят цветную реакцию с использованием ОФД, происходит желтое окрашивание.

Учет ИФА – по оптической плотности с помощью фотометра, при этом степень оптической плотности будет обратно пропорциональна концентрации HbsAg антигена вируса гепатита В.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция имитирует естественную репликацию ДНК и позволяет обнаружить единственную молекулу ДНК в присутствии других молекул.

Суть метода заключается в размножении в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле вновь синтезированные молекулы копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное удвоение специфических фрагментов ДНК. Термостабильная ДНК-полимераза, полученная из термофильных бактерий, служит катализатором ПЦР.

В ПЦР участвуют праймеры – две искусственно синтезированные молекулы ДНК, которые комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента. Синтез протекает только между праймерами, и количество копий фрагмента удваивается.

Этапы цикла амплификации:

1. Денатурация ДНК при t=95 о С 1 мин.

2. Отжиг (присоединение) праймеров, t=50-65 о С 1-2 мин.

3. Синтез фрагмента ДНК, t=72 о С 1-3 мин.

Продукты синтеза первого цикла амплификации служат матрицей для второго цикла, а продукты синтеза второго цикла – матрицей для третьего цикла амплификации. Цикл амплификации проводится в термо-циклере или амплификаторе. За 30 циклов амплификации образуется 10 копий специфического фрагмента.

1) высокая чувствительность и специфичность;

3) возможность диагностики внутриклеточных паразитов и персистирующих микроорганизмов;

4) использование клинического материала, взятого от больного.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Использование при диагностике гриппа

Реакция относится к серологическим реакциям с участием меченых антигенов или антител.

Проводится прямым и непрямым методами.

При прямом методе обнаруживают антиген в материале от больного. Используется диагностическая флюоресцирующая сыворотка, которая содержит иммуноглобулины, выделенные из иммунных сывороток и меченные флюорохромами.

Специфический антиген обнаруживается в виде ярко-зеленых люминесцирующих конгломератов, а фон препарата окрашивается в оранжево-красный цвет.

Компоненты реакции прямой иммунофлюоресценции:

Для поиска антигена при экспресс-диагностике:

1) исследуемый материал;

2) специфическая люминесцентная сыворотка;

3) люминесцентный микроскоп.

При диагностике гриппа проводят дифференциацию от возбудителей парагриппа и аденовирусной инфекции. Носоглоточный мазок обрабатывают флюоресцирующей гриппозной сывороткой или гриппозным иммуноглобулином.

Компоненты реакции непрямой иммунофлюоресценции

Для поиска антигена при экспресс-диагностике:

1) исследуемый материал (антиген);

2) специфическая сыворотка;

3) антиглобулиновая люминесцентная сыворотка

4) люминесцентный микроскоп.

I фаза специфическая

Сывороточные антитела адсорбируются на антигене.

II фаза неспецифическая

Используется антиглобулиновая сыворотка с антителами, меченными флюорохромами. Образуется комплекс антиген+антитело (I) + антиглобулиновая сыворотка (II), который светится.

32. РПГА для определения напряженности противодифтерийного поствакцинального иммунитета

Антитоксический противодифтерийный иммунитет проверяют с помощью РПГА с дифтерийным эритроцитарным диагностикумом (анатоксином).

Неимунными считаются лица с титром антитоксина менее 0,03 МЕ/мг

1. Испытуемая сыворотка, адсорбированная бараньими эритроцитами;

2. Эритроцтарный диагностикум;

3. Физиологический раствор;

4. Противодифтерийная контрольная сыворотка активностью 10 МЕ.

1) Сыворотку разводят физиологическим раствором в 12 лунках от 1:10 до 1:20480 (1:40-1:5120)

2) В каждую лунку добавляют по 1 капле диагностикума;

3) Противодифтерийную контрольную сыворотку разводят также от 1:10 до 1:20480 и вносят по 1 капле диагностикума;

4) Оставляют на 3 часа при комнатной температуре.

Расчет активности: Х=-----------, где

Х – активность испытуемой сыворотки;

10 – титр контрольной сыворотки;

А – максимальное разведение испытуемой сыворотки с положительным результатом;

В – максимальное разведение контрольной сыворотки с положительным результатом.

Реакция флокуляции

Протекает in vitro (в пробирке) при эквивалентном соотношении антигена и антитела. Сопровождается помутнением и выпадением осадка. Феномен флокуляции используют:

- для определения флоккулирующей активности токсинов;

- для титрования антитоксических сывороток.

Например, при дифтерии используется реакция флокуляции с дифтерийным анатоксином. В пробирке, где количество сыворотки и анатоксина эквивалентно, выпадают нежные хлопья. Количество анатоксина, дающее в смеси 1 АЕ сыворотки инициальную флокуляцию, называется 1 иммуногенной единицей анатоксина (1 ИЕ).

Последнее изменение этой страницы: 2016-08-15; Нарушение авторского права страницы

[youtube.player]

Фаготипирование (синоним: лизотипирование, фаговое маркирование, фаговое типирование) — метод идентификации и подразделения бактерий внутри вида или серотипа (серовара) с помощью набора специфических (типовых) бактериофагов.

Фаготипирование — один из чувствительных методов фагодиагностики (см.) патогенных бактерий. Метод используется в эпидемиологии для расшифровки связей между эпидемическими вспышками и разрозненными заболеваниями, обнаружения источников и путей передачи возбудителей инфекции, длительности носительства, а также в исследованиях для установления идентичности различных штаммов бактерий. Фагами типируют бактерии родов Salmonella, Shigella, Escherichia, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Streptococcus, Staphylococcus, Mycobacterium, Coryneba-cterium и др. Очевидно, возможность фаготипирования существует для всех видов бактерий, ее реализация зависит от вариабельности рецепторов типовых фагов, особенностей генетического фонда штаммов бактерий.

Впервые фаготипирование предложили в 1938 году Крейги и Иен (J. Craigie, С. Yen) для дифференцирования различных штаммов возбудителя брюшного тифа — Salmonella typhi по чувствительности к 11 типовым фагам.

Фаготипирование заключается в посеве газоном испытуемого штамма бактерий на поверхность плотной среды и нанесении на посев капель фага (см. Бактериофаг). Бактерии, чувствительные к фагу, определяются по зоне их лизиса (появление бляшек) на месте нанесенной капли фага. Фаг наносят в рабочем тест-разведении, то есть в максимальном десятикратном разведении, при к-ром на месте контакта фага с засеянными на питательную среду тест-штаммами бактерий образуется сливной (полный) или полусливной (неполный) их лизис.

Бактерии одного вида или серотипа, идентично реагирующие (лизирующиеся) при взаимодействии с фагами стандартного набора типовых фагов в рабочих тест-разведениях, принадлежат к одному и тому же фаготипу (фаговару). Для фаготипирования используют вирулентные и умеренные фаги. Путем изучения спектра их действия на штаммы бактерий различного происхождения составляют схему фаготипирования. Специфичность литической реакции фага зависит от наличия на поверхности клеточной стенки бактерий рецепторов для данного фага, которые могут исчезать или появляться в результате изменений в генетическом аппарате бактерий (хромосом и внехромосомных факторов наследственности). Большое значение имеет наличие в бактерии близко-родственных типовому фагу профагов (см. Лизогения), репрессирующих (подавляющих) его репродукцию в цитоплазме. Устойчивость бактериальной клетки к типовому фагу может быть вызвана ее специфическими ферментами — рестриктазами, разрушающими фаговую ДНК. Рестриктазы бактерий могут быть детерминированы хромосомой, фагами или соответствующими плазмидами (см.).

Взаимодействие фага с бактерией может зависеть от h-мутаций генома фага, обусловливающих изменения в структуре его отростков, что затрудняет или облегчает адсорбцию фага на рецепторах клеточной стенки бактерий.

Существуют различные подходы к построению схем фаготипирования бактерий. Один из таких подходов был применен в 1938 году Крейги и Иеном и модифицирован Андерсоном и Уилльямсом (E. S. Anderson, R. Е. Williams) для построения схемы фаготипирования S. typhi, в которой использованы в качестве типовых фагов производные одного фага Vi-II типа А. Полученные фаги обозначают прописными буквами латинского алфавита или арабскими цифрами. На практике для определения фаготипа результаты типирования штамма бактерий сравнивают с данными стандартной таблицы. Стандартными фагами Международного центра фаготипирования определяют фаготип у 80—100% штаммов S. typhi.

Другой подход применен к построению подавляющего большинства схем фаготипирования других патогенных бактерий. В них используют типовые фаги разного происхождения. Фаготипы бактерий различают по комбинации фагов, лизирующих их в рабочих тест-разведениях. Фаготип бактерий определяют по зафиксированному в таблице спектру его чувствительности к разным типовым фагам и обозначают произвольно цифрами, буквами, названиями населенных пунктов, где впервые выделены бактерии этих фаговаров. Спектры чувствительности бактерий к фагам представлены в таблицах. Число фаготипов бактерий может исчисляться несколькими десятками. В схеме Феликса — Каллоу, предложенной в 1951 году, S. schottmuelleri подразделены с помощью 11 типовых фагов на 10 фаготипов — 1, 2, За, 3al, 3f, Jersey, Beccoles, Taunton, Dundee, BAOR — и 30 субфаготипов. В 1959 году Шолтенс (R. Т. Scholtens) на основе этой схемы создал схему фаготипирования, в к-рой взаимодействие бактерий определенного фаготипа с типовыми фагами связано с его лизогенными свойствами (наличием в бактериях профагов).

Фаготипирование стафилококков важно для эпидемиологического анализа пищевых отравлений стафилококковой этиологии и стафилококковых внутрибольничных инфекций (см. Токсикоинфекции пищевые). Для стационаров эндемичными оказались фаготипы стафилококков 80/81, 52/52А/80, 77, 85/85 и др.

Библиогр.: Акатов А. К. и Зуева В. С. Стафилококки, М., 1983; Крылова М. Д. Фаготипирование бактерий, М., 1963, библиогр.; Крылова М. Д. и Лысенко А. М. Изучение гомологии ДНК групп I, II и III Соrynebacterium diphtheriae v. gravis, Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis (ovis), Журн. микр., эпид. и иммун., No 3, с. 48, 1984; Чиракадзе И. Г. и Чанишвили Т. Г. Типирование S. typhimurium при помощи селекционированных фагов, там же, № 3, с. 72, 1974; Яковлева О. Н., Романова Ю. М. и Петровская В. Г. Влияние R-плазмид штаммов Salmonella typhimurium различного происхождения на вирулентность сальмонелл, там же, № 9, с. 40, 1983; Anderson E. S. a. Williams R. E-Bacteriophage typing of enteric pathogenes and staphylococci and its use in epidemiology, J. din. Path., v. 9, p. 94, 1956; Boven C. P. A. Restriction and modification of phages in staphylococcal phage typing, Ann. N. Y. Acad. Sci., v. 236, p. 376, 1974; Craigie J. a. Yen С. H. The demonstration of types of B. typhosus by means of preparations of type II Vi phage, Canad. pubi. Hlth J., y. 29, p. 448, 1938; Zierdt С. H. a. o. Computer analysis of Staphylococcus aureus phage typing data from 1957 to 1975, citing epidemiological trends and natural evolution within the phage typing system, Appl. environ. Microbiol., v. 39, p. 623, 1980.

[youtube.player]

11.4. Фаготипирование бактерий

Благодаря специфичности действия бактериофаги исполь­зуются для диагностики инфекционных заболеваний, опреде­ления видовой принадлежности возбудителя, идентификации бактерий из объектов внешней среды. Фаготипирование позво­ляет проводить внутривидовую дифференциацию бактерий. Поскольку фаготиповая характеристика бактериальных штам­мов достаточно стабильна, фаготипирование чрезвычайно зна­чимо для проведения эпидемиологического анализа. С помо­щью фагового маркирования представляется возможность ус­тановления связей между отдельными случаями заболевания и выявления источников инфекции, путей ее распространения.

Разработаны различные схемы для фагодиагностики и фаготипирования многих видов бактерий – возбудителей брюш­ного тифа, паратифов А и В, дизентерии, сальмонеллезов, дифтерии, чумы, холеры, бруцеллеза, для энтеропатогенной кишечной палочки, стафилококков, стрептококков, микобактерий и др. Существуют международные схемы фаготипирования для возбудителей брюшного тифа, паратифов А и В, коа-гулазоположительных стафилококков.

Фаготипирование стафилококков. Широкое распространение при изучении стафилококковых инфекций получили диагнос­тические стафилококковые бактериофаги для типирования коагулазопозитивных стафилококков, выделенных от человека (Международный набор – Англия) и от крупного рогатого скота (набор Давидсона). Эти наборы содержат соответственно 23 и 7 типов бактериофагов. Типирование осуществляется всеми фагами набора одновременно.

Лиофилизированное содержимое каждой ампулы с типовым фагом растворяют в 1 мл бульона Хоттингера, Мартена или мясопептонного бульона с 0,4 % глюкозы и 0,02 % хлористого кальция – основное разведение 10 -1 . Далее готовят разведе­ния, соответствующие 1 тест-разведению (ТР) и 100 ТР. Су­точную агаровую культуру испытуемого штамма засевают в пробирку с мясопептонным бульоном (можно использовать бульон Хоттингера или Мартена), рН 7,2–7,4 и выращивают при 37°С до появления заметной мути (3–5 ч). По чашкам Петри разливают 1,2 % агар Хоттингера на свежей мясной воде с добавлением 0,4 % глюкозы и 0,02 % хлористого кальция (последний добавляют непосредственно к готовой расплавлен­ной среде перед розливом по чашкам).

Чашки с застывшим агаром подсушивают 40–60 мин при 37 °С. С помощью пастеровской пипетки бульонной культурой орошают поверхность агара. Избыток культуры удаляют и под­сушивают 30–40 мин при 37 °С. Дно засеянной чашки расчер­чивают в соответствии с количеством используемых фагов и в каждую часть засеянной среды в определенном порядке нано­сят каплю соответствующего фага тонко оттянутой пастеров­ской пипеткой. После подсыхания капель фагов чашку пере­ворачивают и инкубируют 18–20 ч при 30 °С или 5 – 6 ч при 37 °С и оставляют при комнатной температуре на 18–20 ч.

Учет и регистрация результатов. Степень лизиса культуры стафилококка регистрируется по следующей схеме:

– сливной (полный) лизис;

– полусливной (незначительный рост культуры в зоне лизиса);

– наличие в месте нанесения капли фага свыше 50 колоний фага (пятен лизиса);

– от 20 до 50 колоний фага;

– менее 20 колоний фага;

– полное отсутствие лизиса.

Первые три степени лизиса (+ + + +, + + +, + +) называют сильной реакцией. Степень лизиса (+, ±) – слабая реакция.

Штамм стафилококка считается типируемым, если хотя бы один фаг дал сильную реакцию. Если при типировании 1 ТР получены только слабые реакции или лизис отсутствует, то этот штамм исследуют повторно с теми же фагами в разведе­нии 100 ТР.

Стафилококки чаще лизируются несколькими фагами, что позволяет определить характерную для каждого штамма фаго-мозаику. Если штаммы обнаруживают одну фагомозаику или имеется различие на одну или две сильные реакции, то они идентичны.

Фагодиагностика холеры. В нашей стране выпускают бак-териофаги для диагностики возбудителей холеры: а) дифферен­циально-диагностические фаги для дифференциации холерных вибрионов; б) диагностические фаги для дифференциации хо­лерных вибрионов 01 группы биоваров V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor, в) диагностические холерные бактериофаги ТЭПВ – 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 – для фаготипирования и фагодиагностики неагглютинирующих холерной 01 сывороткой энтеро-патогенных вибрионов (Cholerae поп 01), выделенных от людей и из объектов внешней среды; г) диагностические холерные монофаги для определения вирулентности вибрионов Эль-Тор, выделенных от носителей и из объектов внешней среды; д) диа­гностические холерные бактериофаги СТХ + СТХ – для диф­ференциации вирулентных и авирулентных штаммов холерных вибрионов.

[youtube.player]

С целью выявления эпидемической цепочки заболевания, в т. ч. для обнаружения источника инфекции, осуществляют внутривидовую идентификацию бактерий, которая заключается в определении фаготипа (фаговара), изучении антигенных и других свойств выделенных бактерий. Определение фаготипа - фаготипирование производят при стафилококковой инфекции, брюшном тифе, паратифе В.

Фаготипирование — один из методов эпидемиологического маркирования. Применяется для выявления источника инфекции. Выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения. Предварительно фаготируется.

Дно чашки Петри с МПА делят на квадраты, каждый из которых подписывают цифрами, соответствующими номерам типовых стафилофагов. На подготовленную чашку газоном засевают исследуемый штамм S.aureus и в каждый квадрат капают соответствующий типовой стафилофаг. Засеянную чашку с культурой и бактериофагами помещают в термостат. На другой день учитывают результат фаготипирования, отмечая номера типовых стафилофагов, лизировавших культуру (в соответствующих квадратах будут видны "стерильные пятна"). Фаготип - перечень типовых бактериофагов, лизировавших данную культуру. Это - один из приемов внутривидового типирования, позволяющий установить источник инфекции и пути распространения.

Титрование вируса полиомиелита в цветной пробе Солка:

В пробирках находится вируссодержащий материал в соответствующих разведениях и культура клеток в виде взвеси в поддерживающей среде.

В контрольной пробирке содержится только культура клеток в виде взвеси в поддерживающей среде.

Штатив помещают в термостат. Просматривают ежедневно. После того как в контрольной пробирке цвет среды изменится с красного на желтый, что свидетельствует о том, что культура клеток жива, штатив извлекают из термостата и учитывают результат. Титром вируса является наибольшее разведение, в которой произошла гибель клеток и цвет среды поэтому не измененился, остался красным.

7.Геном бактерий. Понятие о генотипе и фенотипе. Виды наследуемой изменчивости. Бактериальный геномсостоит из генетических элементов, способных к самостоятельной репликации, т.е.репликонов. Репликонами являютсябактериальная хромосома иплазмиды.

Наследственная информация хранится у бактерий в форме последовательности нуклеотидов ДНК, которые определяют последовательность аминокислот в белке. Каждому белку соответствует свой ген, т. е. дискретный участок на ДНК, отличающийся числом и специфичностью последовательности нуклеотидов.

Бактериальная хромосомапредставлена одной двухцепочечной молекулой ДНК кольцевой формы. Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей царстваProcaryotae варьируют. Бактериальная хромосома формирует компактный нуклеоид бактериальной клетки. Бактериальная хромосома имеет гаплоидный набор генов. Она кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции.

Плазмидыбактерий представляют собой двухцепочечные молекулы ДНК. Они кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования.

Фенотиппредставляет собой результат взаимодействия между генотипом и окружающей средой, т. е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя и зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом, так как характер и степень возможных для данной клетки стенотипических изменений определяются набором генов, каждый из которых представлен определенным участком молекулы ДНК.

В основе изменчивостилежит либо изменение реакции генотипа на факторы окружающей среды, либо изменение самого генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. В связи с этим фенотипическую изменчивость подразделяют на наследственную и ненаследственную.

Ненаследственная (средовая, модификационная) изменчивостьобусловлена влиянием внутри- и внеклеточных факторов на проявление генотипа. При устранении фактора, вызвавшего модификацию, данные изменения исчезают.

Наследственная (генотипическая) изменчивость, связанная с мутациями, — мутационная изменчивость. Основу мутации составляют изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, полная или частичная их утрата, т. е. происходит структурная перестройка генов, проявляющаяся фенотипически в виде измененного признака.

Наследственная изменчивость, связанная с рекомбинациями, называется рекомбинационной изменчивостью.

Подвижные генетические элементы.

В состав бактериального генома, как в бактериальную хромосому, так и в плазмиды, входят подвижные генетические элементы. К подвижным генетическим элементам относятся вставочные последовательности и транспозоны.

Вставочные (инсерционные) последовательности, IS-элементы— это участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка репликона в другой, а также между репликонами. Они содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения — транспозиции: ген, кодирующий ферменттранспозазу, обеспечивающую процесс исключения IS-элемента из ДНК и его интеграцию в новый локус, и ген, детерминирующий синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения.

Отличительной особенностью IS-элементов является наличие на концах вставочной последовательности инвертированных повторов. Эти инвертированные повторы узнает ферменттранспозаза. Транспозаза осуществляет одноцепочечные разрывы цепей ДНК, расположенных по обе стороны от подвижного элемента. Оригинальная копия IS-элемента остается на прежнем месте, а ее реплицированный дупликат перемещается на новый участок.

Перемещение подвижных генетических элементов принято называть репликативной или незаконной рекомбинацией. Однако в отличие от бактериальной хромосомы и плазмид подвижные генетические элементы не являются самостоятельными репликонами, так как их репликация — составной элемент репликации ДНК репликона, в составе которого они находятся.

Известно несколько разновидностей IS-элементов, которые различаются по размерам и по типам и количеству инвертированных повторов.

Транспозоны — это сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-элементы, но имеющие структурные гены, т. е. гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфическим биологическим свойством, например токсичностью, или обеспечивающих устойчивость к антибиотикам.

Перемещаясь по репликону или между репликонами, подвижные генетические элементы вызывают:

1. Инактивацию генов тех участков ДНК, куда они, переместившись, встраиваются.

2. Образование повреждений генетического материала.

3. Слияние репликонов, т. е. встраивание плазмиды в хромосому.

4. Распространение генов в популяции бактерий, что может приводить к изменению биологических свойств популяции, смене возбудителей инфекционных заболеваний, а также способствует эволюционным процессам среди микробов.

Изменения бактериального генома, а, следовательно, и свойств бактерий могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций.

Наследственная информация клетки заключена в хромосоме и генах, которые передаются из родительской клетки в дочерние. Хромосомы — нуклеопротеиды (нуклеиновые кислоты + белки), они являются носителями генов, определяющих наследственные свойства организма. Гены невидимы, но известно, что они располагаются в линейном порядке в хромосоме. При неполовом способе деления гены в процессе митоза распределяются поровну между двумя клетками. Дочерние клетки получают полный набор генов исходной клетки и являются одинаковыми.

Химическая природа генов — нуклеиновые кислоты. Порядок расположения азотистых оснований в цепи нуклеиновой кислоты определяет различный генетический вид ДНК у разных организмов.

Основной структурой, хранящей информацию о синтезе необходимых клетке разнообразных молекул белка и передающей эту информацию по наследству, является ДНК. У некоторых вирусов эту роль выполняет РНК. Информация, заключенная в молекулах нуклеиновой кислоты и характеризующая каждый вид микроорганизма, может меняться в результате генотипической изменчивости. При этом обязательно происходят изменения генов в хромосоме. Генотипическая изменчивость может возникать в результате мутаций и генетических рекомбинаций: конъюгации, трансформации и трансдукции.

Трансдукция - передача генетической информации умеренными бактериофагами. Трансформация – процесс проникновения чужеродной, донорской ДНК в клетку реципиента. Клетка реципиента должна обладать повышенной проницаемостью – высокая концентрация чужеродной ДНК. Конъюгация – процесс передачи генетической информации от клетки донора к клетке реципиента с помощью секспили. В этом случае между двумя бактериями образуется мостик и хромосома из одной клетки переходит в другую.

[youtube.player]

Стафилококки. Общая характеристика

Стафилококки обычно встречаются в виде скоплений, напоминаю­щих виноградную гроздь. Отдельные кокки, примерно 1 мкм в диа­метре, имеют тенденцию объединяться в скопления, поскольку их деление происходит в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и дочерние клетки сохраняют своеобразное пространственное груп­повое взаиморасположение. При специальных условиях они могут располагаться поодиночке, попарно, или в виде коротких цепочек. Они грамположительны, неподвижны, не образуют спор и активно растут практически на всех искусственных средах, обычно образуя непрозрачные, гладкие, блестящие колонии.

Поскольку стафилококки продуцируют каталазу, перекись водорода, образующаяся как метаболит при аэробных условиях, для них не токсична, и, большей частью, они лучше растут в присутствии ки­слорода. Однако, они легко переносят отсутствие кислорода, а неко­торые из них даже являются строгими анаэробами. Они лучше рас­тут при температуре 25-35°С, но могут расти и при 8° и при темпе­ратуре выше 48°С.

При культивировании на кровяном агаре в аэробных условиях об­разуют пигменты – от золотистого до лимонно желтого и белого цвета. Золотистый пигмент дал название одному из видов стафило­кокка – Staphylococcus aureus. Однако, при этом, некоторые штам­мы золотистого стафилококка могут продуцировать и белый пиг­мент.

Стафилококки устойчивее других бактерий к действию жара, света, высушивания, экстремальных температур и химических агентов. Они выдерживают 60°С в течение часа, а отдельные штаммы даже 80°С в течение 30 минут, хотя большинство вегетативных форм бактерий погибают при воздействии 60°С в течение 30 минут.

Благодаря своей устойчивости к высушиванию стафилококки могут переноситься с частицами пыли, могут недели и месяцы сохранять­ся в высохшем гное или мокроте. Другой особенностью стафило­кокков является их устойчивость в солевой среде (не погибают при концентрации NaCl до 15%). В связи с этим способны сохраняться в консервированных продуктах (пресервах). В продуктах питания, со­храняемых путем соления, стафилококки могут расти и продуциро­вать энтеротоксин.

Эти микробы устойчивы к действию фенола и большинству других дезинфектантов, чувствительны к основным красителям. Имеют тенденцию к формированию резистентности к сульфаниламидам и антибиотикам. Около 80% штаммов Staphylococcus aureus рези­стентны к пенициллину.

Род Staphylococcus представлен тремя видами:

1. Staphylococcus aureus;

2. Staphylococcus epidermidis;

3. Staphylococcus saprophyticus.

Виды различаются преимущественно по биохимическим свойствам и вырабатываемым ферментам. Staphylococcus aureus ферментирует манит в анаэробных условиях и продуцирует коагулазу, тогда как два других вида лишены этих свойств.

Staphylococcus saprophyticus – первично сапрофитический, о чем свидетельствует его название. Он, по-видимому, является потенци­ально патогенным, обладает ограниченной инвазивностью. Способен вызывать инфекцию мочевого тракта.

Стафилококки. Токсические продукты

Стафилококки вырабатывают много продуктов с выраженными ток­сическими свойствами. Вероятно, никакой другой микроб не проду­цирует их в таком количестве. Среди них экстрацеллюлярные ток­сины, гемолизины (стафилолизины), ферменты. Все они, в той или иной степени, обусловливают болезнетворность и вирулентность микроба. Ни один штамм не способен вырабатывать все токсические продукты сразу.

Гемолизины – это экзотоксины, действующие непосредственно на клеточную мембрану, вследствие чего происходит лизис эритроци­тов, лейкоцитов, тромбоцитов макрофагов и развивается поражение многих тканей. Действием гемолизина, вероятно, объясняются фатальные исходы многих случаев стафилококковых инфекций.

При росте культуры стафилококка на кровяном агаре гемолиз про­является в виде зоны просветления (р-гемолиз). В отличие от стрептококка, стафилококк не вызывает частичный гемолиз (а- гемолиз). Следует отметить, что греческие буквы используются для обозначения иммунологически различающихся типов стафилокок­ковых гемолизинов, в то время как у стрептококков эти буквы обо­значают тип гемолиза – полный, или неполный. Например, гемоли­зин, обозначаемый как а-гемолизин (а-лизин, а-токсин) у стафило­кокков означает наличие светлой зоны вокруг колоний на кровяном агаре.

Цитотоксин – один из наиболее важных факторов вирулентности стафилококков, вызывает агрегацию тромбоцитов и избирательно действует на гладкую мускулатуру мелких вен.

Лейкоцидин – негемолитический экзотоксин, разрушающий клетки белой крови. Он вызывает дегрануляцию полиморфонуклеарных нейтрофильных лейкоцитов и макрофагов.

Энтеротоксин – внеклеточный токсин, который вырабатывают око­ло 50% коагулазоположительных штаммов и который вызывает большинство случаев пищевого отравления. Токсин действует непосредственно на рвотный центр центральной нервной системы. Продукция токсина обусловлена фаговой конверсией. Различают 5 ти­пов токсина – А, В, С, D, Е. Накопление энтеротоксина в заражен­ной пище приводит к пищевому отравлению с синдромом гастроэн­терита, который не является инфекцией в обычном понимании это­го термина, это скорее токсемия. Присутствие токсина в подозреваемой пище можно установить иммунологически, например, в ре­акции преципитация.

Коагулаза, важный экстрацеллюлярный фермент, продуцируемый только некоторыми стафилококками (коагулазоположи-тельные), вызывает образование сгустка плазмы крови. В лаборатории опре­деление коагулазы используется как единственное достоверное до­казательство патогенности выделенного штамма. У невирулентных штаммов попытки обнаружить коагулазу обычно заканчиваются не­удачей. Эти штаммы обозначают как коагулазоотрицательные. При наличии данного фермента и проявлении его действия отдельные коккк оказываются покрытыми слоем фибрина и, таким образом, они надежно защищены от атаки фагоцитов.

Способность к продукции коагулазы коррелирует с наличием у этих штаммов и других токсических продуктов. Коагулазо + стафилокок­ки также могут иметь фактор склеивший – это связанная с клет­кой, но антигенно отличающаяся форма коагулазы, вызывающая быстрое склеивание клеток, эмульгированных в капле плазмы.

Липазы стафилококка – эго ферменты, которые разрушают липиды клеточных структур и липопротеины крови. Стафилококки утили­зируют метаболиты кожных структур и потому способны интенсив­но колонизировать (заселять) поверхность кожи. Образование липа­зы дает этому микробу способность к инвазии здоровой кожи н подкожной клетчатки с формированием локальных абсцессов. Штаммы без липазы чаще связаны с генерализованной инфекцией.

Гиалуронидаза (фактор распространения, инвазии), которую выраба­тывают более 90% патогенных стафилококков, повышает проницае­мость тканей для кокков и их токсических субстанций. Вызывает деградацию гиалуроновой кислоты, которая соединяет клетки тканей.

Нуклеаза, имеется у 90-96% S.aureus расщепляет ДНК и РНК. Нуклеаза S.aureus термостабильна, нуклеаза коагулазоотрицательных стафилококков – термолабильна.

Стафилокиназа растворяет сгустки фибрина и, соответственно, спо­собствует распространению местной, вначале ограниченной, инфек­ции.

Стафилококки. Патогенность.

Некоторые стафилококки непатогенны, другие (S.aureus) вызывают тяжелые инфекции, S.epidermidis, хотя иногда и вызывает легкие, ограниченные поражения, в общем, относится к непатогенным, за исключением некоторых необычных медицинских ситуаций, напри­мер, при введении в тело с лечебной целью технических устройств, чужеродных для тканей организма. Обычно S.epidermidis является частой причиной эндокардита, развивающегося при протезировании сердечных клапанов и инфекций, осложняющих ортопедическое протезирование или нейрохирургическое шунтирование.

Стафилококки также способны вызывать заболевания целых систем и поражаться могут практически все органы и ткани. Они могут быть одной из причин пневмонии, гнойного плеврита, эндокардита, менингита, абсцесса мозга, послеродовой лихорадки, флебита, цис­тита и пиелонефрита. Стафилококковая пневмония является фа­тальным осложнением эпидемического гриппа. Стафилококки яв­ляются наиболее распространенной причиной остеомиелита. Стафи­лококковые заболевания часто возникают в больницах, особенно у пациентов, уже серьезно больных. Например, стафилококковая пневмония – это суперинфекция, угрожающая больным, принимав­шим большие дозы антибиотиков.

Стафилококковая септицемия наблюдается в двух формах. Первая – это молниеносная глубокая токсемия, через несколько дней приво­дящая к смерти. Другая, более частая форма, длится дольше, сопро­вождается развитием метастазирующих абсцессов в разных частях тела, но не является необратимой.

Стафилококковая септицемия может быгь первичной, но чаще это результат вторичного проникновения в кровоток микроорганизмов из местного очага инфекции. Часто процесс начинается как триви­альное воспаление волосяного фолликула, Микроб может поступать в кровоток из инфицированной раны, из очага пневмонии, или из инфицированного внутривенного катетера. Катетер внутри вены не должен оставаться дольше 3-4 дней из-за риска возникновения серьезной инфекции. Поверхностные гнойники; фурункулы вокруг носа и губ легко осложняются септицемией, поэтому лучше избегать их травмирования.

Даже при таких манипуляциях как прокалывание ушей (в космети­ческих целях), проводимых без соблюдения необходимой стериль­ности, есть опасность развития вторичной стафилококковой инфек­ции, которая из открытой ранки может проникать в кровоток и ино­гда приводить к развитию сепсиса.

Стафилококки могут быть причиной энтерита и энтероколита, ос­ложняющего антибиотикотерапию. Они являются наиболее частой причиной пищевого отравления, так как в пище может накапливать­ся в большом количестве токсин.

Стафилококки могут вызывать иногда гнойно-воспалительные про­цессы у коров и лошадей. В случае развития мастита микроб может попасть в молоко. Могут возникнуть гнойничковые поражения ко­жи рук доярок. Возможно заражение других животных в стаде.

Стафилококки. Госпитальная инфекция

Человек тесно связан с повсеместно распространенными стафило­кокками (убиквитарный микроорганизм), и поэтому стафилококко­вая инфекция представляет угрозу в любом месте и в любое время. Пример тому – госпитальная инфекция, уже на протяжении многих лет являющаяся серьезной проблемой для больниц во всем мире.

С этой проблемой связан ряд вопросов, требующих обсуждения. Прежде всего, стафилококковая госпитальная инфекция – это ос­ложнение широкого применения антибиотиков. Эти важнейшие ан­тимикробные агенты очень широко и свободно назначаются, но их действие преимущественно бактериостатическое, а не бактерицид­ное. Стафилококки наделены хорошей приспособляемостью и среди них возникают устойчивые к антибиотикам штаммы. Во-вторых, особенности медицинского страхования и медицинской службы спо­собствуют раннему выявлению болезни и ранней госпитализации большего числа больных. В-третьих, расширение объема и числа хирургических вмешательств. Сложная хирургическая техника по­зволяет оставлять ткани открытыми дольше. В-четвертых, отдель­ные виды терапии могут вызывать угнетение иммунной системы (иммунодепрессию). Например, трансплантация тканей и органов на фоне назначения средств, подавляющих отторжение. В этих случаях подавляется резистентность к инфекции.

С наибольшей частотой при госпитальной стафилококковой инфек­ции наблюдаются следующие поражения:

1. Пиодермия – термин, обозначающий гнойные поражения кожи и подкожных тканей. Чаще у новорожденных. Возможны опас­ные осложнения в виде пневмонии, септицемии. От новорож­денного может заразиться мать, у которой развивается абсцесс грудной железы – мастит.

2. Раневая инфекция, особенно хирургической раны.

3. Вторичная стафилококковая инфекция престарелых и лиц, не способных к соблюдению гигиенических норм.

4. Гастроэнтерит у лиц с угнетенной (например, антибиотиками) кишечной микрофлорой.

Стафилококки. Патологическая анатомия

Наиболее заметное проявление стафилококковой инфекции – абс­цесс, основной тип повреждения. В основе образования абсцесса лежит гноеродная активность стафилококка и его довольно ограни­ченная способность к распространению,

Стафилококки. Эпидемиология

Стафилококки в норме обитают на коже человека, а также на сли­зистой ротовой полости, глотки и носа. Они могут находиться здесь постоянно, пока однажды не преодолеют кожный или слизистый барьер и не вызовут развитие болезни. В другом случае они прони­кают через неповрежденную кожу в волосяные фолликулы и прото­ки сальных желез.

В норме способность стафилококка к инвазии и резистентность хо­зяина хорошо сбалансированы, поэтому инфекция не развивается, пока не создастся ситуация, когда встречаются высоковирулентный микроб или макроорганизм со сниженной резистентностью.

Как правило, развивается локальный процесс – абсцесс или фурун­кул, без распространения инфекции. Но в части случаев микроб вы­ходит за пределы локальной инфекции, попадает в кровоток и по­ражает разные ткани и органы тела.

Механизм передачи инфекции преимущественно контактный. На­пример, через руки персонала в больнице. Персонал подвергается риску стать носителями, в этом случае стафилококк может длитель­но находиться у них на слизистой носа. Носители могут стать ис­точниками инфекции.

Стафилококки. Бактериологическая диагностика

Бактериологический диагноз стафилококковой инфекции не пред­ставляет особых сложностей, если исследуют кровь и другие жидко­сти организма, в норме стерильные. Выделенную культуру стафило­кокка необходимо идентифицировать как патогенную, в отличие от обычного микроба, обитающего на коже. Для этого используют ряд тестов. Свежевыделенные культуры стафилококка характеризуются как патогенные по таким признакам как продукция желтого пиг­мента, гемолизина, ферментация маннита, продукция ДНК-азы и коагулазы.

Фаготипирование стафилококков заслуживает специального упоми­нания. Было установлено, что специфические бактериофаги (стафилофаги, табл. 1) реагируют с 60% коагулазо+ стафилококков. Коагулазо- стафилококки не так чувствительны. Поскольку этот процесс специфический, он используется для определения фаговаров выде­ленных стафилококков. Для удобства бактериофагам присвоены оп­ределенные номера, и штаммы стафилококка, лизирующиеся опре­деленным фагом имеют номер этого фага и обозначаются как соот­ветствующий фаговар. Это касается только штаммов S.aureus. Большинство других стафилококков относятся к нетипирующимся.

По решению международного подкомитета по фаготипированию стафилококков, предложена международная классификация фагова­ров S.aureus (табл. 1)

Фаготипирование используется в эпидемиологических целях для выявления источника инфекции, так как фаготипирование высоко­специфичный процесс. В случаях, например, внутрибольничных инфекций, метод может точно указать на носителя патогенного штамма (один и тот же фаговар).

[youtube.player]