Мук 4 2 3065-13 лабораторная диагностика дифтерийной инфекции статус
| Статус документа: | Действует |
| Что заменяет: |
|
| Дата начала действия: | 09 фев. 2012 г. |
| Количество страниц: | 63 стр. |
| Когда и где опубликован: | Роспотребнадзор, 2011 год |
| Разработан: |
|
| Издан: |
|
| Утвержден: |
|
| Содержание: | 1. Область применения 2. Общие положения. Сущность метода 3. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции 4. Требования к взятию и транспортированию материала для бактериологической диагностики дифтерии 5. Организационно-методическая работа 6. Бактериологическое исследование 6.1. Порядок проведения бактериологического исследования 6.2. Бактериологическое заключение 6.3. Схема бактериологического исследования 7. Методики идентификации возбудителя дифтерийной инфекции 7.1. Определение токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с помощью реакции преципитации в геле 7.2. Методики определения биохимических признаков 8. Питательные среды 8.1. Методы приготовления питательных сред и реактивов 8.2. Среды для определения биохимических свойств 9. Хранение контрольных штаммов в лабораторных условиях 10. Методы контроля питательных сред 10.1. Метод бактериологического контроля питательных сред для первичного посева и сред для определения токсигенных и биохимических свойств 10.2. Метод количественного определения аминного азота 11. Методика постановки реакции пассивной гемагглютинации для выявления противодифтерийных антитоксических антител (РПГА) 12. Нормативные и методические ссылки Приложение 1. Рецепты красок Приложение 2. Материалы и оборудование Приложение 3. Таблица и рисунки |
| Ссылки в документе: |
|
| Разделы классификатора: |
|
Отзывы
Нет отзывов, пока еще.
МУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции
Методические указания предназначены для специалистов бактериологических лабораторий санитарно-эпидемиологической службы, лечебно-профилактических организаций независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности и научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику дифтерийной инфекции.
[youtube.player]Материалом для исследования при дифтерии могут быть пленки и слизь из зева и носа, а при редких локализациях дифтеритических воспалений - из глаза, уха, с поверхности раны и кожи. Отделяемое забирают сухим ватным тампоном или смоченным 5% раствором глицерина в физиологическом растворе с рН-8.
До этого уровня его доводят 20% раствором однозамещенного фосфорно-кислого натрия (Na2HPO4).
Исследование осуществляют не позднее 3-4 часов после забора, с поэтапной выдачей ответов о подтверждении диагноза.
I. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД
Морфологические и тинкториальные признаки дифтерийных бактерий настолько своеобразны, что микроскопический метод может примениться как самостоятельный или предварительный к бактериологическому анализу. Кроме того, он дает представление и о сопутствующей микрофлоре.
Для выявления дифтерийных палочек могут быть использованы три метода окраски: Грама, Леффлера, Нейccера.
МЕТОД ГPAМA позволяет выявить способность дифтерийных бактерий вступить во взаимодействие с генцианвиолетом. Дифтерийные бактерии грампозитивиы, но это свойство непостоянно. При контакте с антибиотиками, при длительном пребывании в голодной среде резко изменяется обмен веществ и грамположительность микробов теряется. Поэтому ориентироваться на этот признак нельзя.
МЕТОД НЕЙССЕРА - наиболее ценный дифференциально-диагностический способ, позволяющий не только окрасить микроорганизмы, но и выявить полярно вкрапленные зерна волютина и характерное расположение бактериальных особей под углом.
РЕАКТИВЫ
- УКСУСНОКИСЛАЯ СИНЬКА НЕЙСЕРА: метиленовая синька -0,1 г, спирт 96° -2 мл; 5% раствор ледяной уксусной кислоты в дистиллированной воде - 50 мл.
- РАСТВОР ЛЮГОЛЯ: 2 г йодистого калия растворить в 10 г дистиллированной воды. Затем к этому раствору прибавить; 1 г кристаллического йода и добавить воды до 300 мл.
- РАСТВОР ХРИЗОИДИНА: 2 г хризоидина на 300 мл горячей дистиллированной воды.
Вместо раствора хризоидина можно использовать раствор везувина (краситель бисмаркбраун): везувин-1 г; 96° cпирт-10 мл; кипящая дистиллированная вода-100 мл.
ТЕХНИКА ОКРАСКИ
- Синька Нейссора- 1 минута
- Раствор Люголя - 30 секунд.
- Ополаскивание дистиллированной водой.
- Докраска расвором хризоидина или везувина - 10-15 секунд.
Тело микробной клетки окрашивается в желтый или желто-коричневый цвет, зерна волютина - коричнево-черного цвета.
ОКРАСКА ПО СПОСОБУ ЛЕФФЛЕРА
Метод Леффлера прост, но по своим дифференциально-диагностическим возможностям он не уступает сложному способу Нейссера. Поэтому он применяется значительно чаще.
Для окраски нужен один реактив - щелочная метиленовая синька Леффлера следующего состава: Дистиллированная вода - 99 мл; 1% раствор едкого калия (КОН) - 1 мл; профильтрованный спиртовой раствор метиленовой синьки (0,5 г синьки на 30 мл спирта) - 30 мл.
Окраска осуществляется 1-2 минуты. При этом тело бактерий приобретает бледно-голубой цвет, зерна волютина - синий или cине-черный.
При выполнении микроскопического исследования важно отличить истинные дифтерийные бактерии от дифтериеподобных палочек Гоффмана и бактерий ксерозис.
| Микроскопическая дифференциация дифтерийных бактерий и дифтероидов | ||
| Бактерии | Взаимное расположение особей в препарате | Наличие и количество зерен волютина |
| Дифтерии | Под углом в виде римской цифры V или кисти рук с разведенными пальцами | 2 зерна с полярной локализацией |
| Бактерии Гоффмана | Параллельное, в виде часткола | Зерен нет или единичные без типичной локализации |
| Бактерии Keepоза | Хаотичное | Зерен много, распределение беспорядочное |
II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
Дифтерийные бактерии требовательны к питательным средам. Для их выделения и накопления используется комплекс специальных элективных и дифференциально-диагностических сред.
СВЕРНУТАЯ СЫВОРОТКА РУ: 3 мл стерилыной сыворотки лошади (быка или человека) вносят в пробирку, укладывают с наклоном в 45-50° в свертывателе Коха, предварительно нагретом до +50 °C. Затем температуру доводят до 80° и прогревают в течение 1 часа. Готовую среду охлаждают, ставят в термостат для проверки стерильности. В случае прорастания среды последнюю повторно прогревают при + 80 °C в течение 2 часов.
На этой среде бактерии дают шероховатые R-формы, напоминающие в комплексе шагреневую кожу.
ТЕЛЛУРИТОВЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Дифтерийные бактерии обладают выраженной способностью восстанавливать теллуровокислый калий до металлического теллурита. Для выявления этой способности в среды добавляется дифференцирующий компонент-2% раствор теллурита калия следующего состава: дистиллированная вода-100 мл; теллурит калия (K2FeO4)-2 г. Раствор стерилизуют кипячением 30 минут. Для приготовления сред можно использовать также готовый 2% раствор теллурита калия в 40% глицерине, выпускаемый в ампулах для клинических теллуритовых проб.
СЫВОРОТОЧНО-ТЕЛЛУРИТОВЫИ АГАР: к 80 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2% МПА добавляют 20 мл лошадиной или 30 мл бычьей сыворотки и 1 мл 2% раствора теллурита калия. Готовую среду разливают в стерильные чашки.
КРОВЯНО-ТЕЛЛУРИТОВЫЙ АГАР: к 100 мл расплавленного и охлажденного до +50 °C 2-3% МПА добавляют 5-10% дефибринированной крови человека (донорской, плацентарной) или животного (крупного рогатого окота, кролика, барана, морской свинки) и 1 мл 2% теллурита калия, смешивают и разливают в чашки.
СРЕДА КЛАУБЕРГА: 100 мл 3% МПА расплавляют, добавляют 3 мл 2% теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл лаковой крови. Последнюю готовят следующим образом: к 34 мл дистиллированной стерильной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови (любой). Состав глицериновой смеси: к 40 мл дефибринироваиной крови крупного рогатого скота или человека добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина и выдерживают до употребления в холодильнике 3-6 недель.
По характеру роста на теллуритовых средах удается отдифференцировать дифтерийные бактерии как внутри вида, так и от других микроорганизмов.
| Дифференциация дифтерийных палочек от других микробов на теллуритовых и хинозольной средах | ||
| Бактерии | Характер роста на средах | |
| теллуритовых | хинозольной | |
| Дифтерийные бактерии | серые, розеткообразные | синие |
| тип гравис | с радиальностью | |
| тип митис | черные, матовые, гладкие | |
| тип интермедиус | серо-черные, гладкие | |
| Ложнодифтерийные бактерии Гофмана | серые, блестящие, выпуклые, конусовидные | голубоватые |
| Дифтериоиды Ксероза | серо-черные, как истинные дифтерийные | бесцветные |
| Стафилококки | черные, влажные, блестящие | - |
ХИНОЗОЛЬНУЮ СРЕДУ БУЧИНА готовят по следующей прописи: на 100 мл воды добавляют 3 г хлористого натрия, 1,5 г, глюкозы, 1 мл 3% раствора цистина в 1% растворе соды, 2 мл водного раствора хинозола (1:1000), 0,08 г индикатора водноголубого, 4,0 сухого питательного агара. Смесь растворяют при нагревании. Устанавливают pH = 7,4-7,6. Охлаждают до +50 °C, добавляют 5 мл дефибринированной крови и, соблюдая стерильность, разливают в чашки Петри.
СРЕДА ТИНСДАЛЯ-САДЫКОВОЙ является селективной средой для дифтерийных бактерий. Посторонняя микрофлора на ней не растет или развивается очень скудно. Другим преимуществом среды является то, что она не нуждается в добавлении крови. Ее состав следующий: 100 мл мартеновского или обычного мясопептонного агара, 15-20 мл нормальной лошадиной сыворотки, 12 мл 1% раствора цистина (сначала растворить в 0,1 N р-ре NaOH, потом в воде), 11-12 мл 0,1N HCl (для нейтрализации NaOH); 1,8 мл 2% раствора теллуристого калия и 1,8 мл 2,5% раствора гипосульфита натрия.
Дифтерийные бактерии обладают рядом характерных биохимических признаков. Они хорошо ферментируют глюкозу и крахмал, высвобождают значительные количества активной цистиназы, выявляемой в пробе Пизу. Вместе с тем, названные микроорганизмы инертны в отношении сахарозы и не имеют фермента уреазы, обнаруживая отрицательную пробу Закса. Очень важным видовым признаком этих микробов является токсигенность. С эпидемиологической точки зрения, весьма существенное значение имеет серологическая неоднородность дифтерийных бактерий и наиболее широкое участие в распространении инфекции I и VI серологических типов. Это необходимо учитывать при диагностике дифтерии.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ дифтерийных бактерий производится на комплексе углеводных сред, состоящих из 1% пептонной воды с pH-7,6, в которую добавляют различные углеводы: 0,5% сахарозы, 0,5% глюкозы, 0,2% крахмала. В качестве индикатора используется реактив Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью).
Среды разливают по 2 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд :по 30 минут. До работы они бесцветны, при ферментации углеводов - краснеют.
На углеводных сывороточно-водных средах, основа которых состоит из дистиллированной воды (80 мл) и сыворотки (20 мл), углеводолитические свойства культур проявляются плохо и ферментация углеводов идет очень медленно.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ПРОБА ПИЗУ - ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА ЦИСТИНАЗЫ
К 90 мл расплавленного 2% МПА с pH -7,6 добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1N растворе NaOH). Среду стерилизуют при +112 °C 30 минут. K расплавленной и охлажденной до +50 °C среде добавляют 1 мл 10% уксуснокислого свинца (простерилизованного дважды текучим паром) перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают в маленькие пробирки по 2 мл. Посев производится уколом.
Вместо МПА с цистином можно использовать 2% МПА, приготовленный на переваре Хоттингера, с содержанием аминного азота в 250 мг%.
Дифтерийные бактерии активно перерабатывают белки и цистин с высвобождением сероводорода, который, соединяясь с уксусным свинцом, переходит в сернистый свинец коричнево-черного цвета. Дифтероиды подобных изменений не дают.
ПРОБА ЗАКСА - ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА УРЕAЗЫ
Проба Закса служит для отличия дифтериеподобных бактерий, обладающих уреазной активностью, от истинных дифтерийных палочек, не имеющих этого фермента.
- 1. ВАРИАНТ СРЕДЫ: к 100 мл МПБ или Хоттингеровского бульона добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6% спиртового раствора крезолрот, разливают по 2-3 млв пробирки и стерилизуют текучим паром 10 минут. Результаты учитывают через 20-24 часа после посева. Покраснение среды свидетельствует о наличии уреазы.
- 2. ВАРИАНТ СРЕДЫ: готовят два реактива: А и В.
Реактив А: мочевина - 1 г, спирт 96°- 2 мл, дистиллированная вода - 4 мл.
Реактив В: 0,2% раствор фенолрота-1 мл, однозамещенный фосфат калия (КН2Р04)-0,1 г, двузамещенный фосфат калия (К2НРО4)-0,1 г, хлористый натрий - 0,5 г, дистиллированная вода - 100 мл.
Реактив А стерилизуют фильтрованием и хранят при + 4 °C, реактив В - в автоклаве текучим паром.
Перед работой оба реактива смешивают ex tempore из расчета 1 часть раствора А и 19 частей раствора В, смесь разливают по 0,1 мл в узкие пробирки. Испытуемые культуры вносят в количестве 2-6 капель, помещают в термостат на 30 минут. При положительной реакции смесь краснеет.
Дифференциация дифтерийных бактерий и дифтероидов по биохимическим признакам приведена ниже.
В отдельных случаях после определения биохимических свойств дифтерийных бактерий выясняется серотип штамма. Для этой цели используется ориентировочная агглютинация. Последнюю проводят на стекле с чистыми культурами, которые смывают со среды 1 мл солевого раствора и осторожно набирают стерильной пастеровской пипеткой. Агглютинирующие монотииовые сыворотки (I, II, III, IV, VI серотипы) разводят 1:25 солевым раствором с pH-7,6 (к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 3,0 NaOH и устанавливают pH-7,6, доливая 5% раствор Na2HPO4). Для контроля испытуемой культуры ставят реакцию с выше указанным солевым раствором без сыворотки.
Положительная реакция характеризуется быстрым появлением хлопьев агглютината (2-3 минуты), особенно заметных при учете реакции над вотеутым зеркалом.
Неиспользованную сыворотку запаивают в ампулу или переливают в стерильную пробирку.
Агглютинирующие сыворотки хранятся в сухом месте при температуре от +4° до +10 °C.
При использовании высушенных сывороток последние перед употреблением растворяют в стерильной дистиллированной воде (1 мл на ампулу). Срок годности сухой сыворотки не ограничен.
УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
ТЕЛЛУРНТОВАЯ ПРОБА - КЛИНИЧЕСКАЯ
Тампоном, смоченным 2% раствором теллуровокислого калия в 40% глицерине (выпускается в ампулах), смазывают пораженные миндалины и слизистую. При наличии дифтерийных бактерий тампон чернеет сразу или после 2-4-часовой инкубации в термостате.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИГЕННОСТИ ДИФТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИИ
Определение токсигенности дифтерийных бактерий осуществляется биологическим (в специализированных лабораториях) и диффузионным (на плотных средах) методами.
Рекомендуемая литература:
- Профилактика дифтерии. Методические материалы для практических работников. М., 1961, стр. 37.
- Сборник официальных материалов по лабораторному делу. Книга первая. Медгиз, 1961, стр. 331-337.
- Сборник схем бактериологического исследования при некоторых инфекционных заболеваниях. Методическое пособие для врачей-курсантов заочников, под ред. проф. П. Н. Кашкина, Л., 1965, стр. 17-20.
- Дяченко С. С. Микробиологические методы диагностики инфекционных заболеваний. Киев, 1962, стр. 224,
- Пяткин К. Д., Трофимова Н. Д., Маркова Н. С. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, 1962, стр. 219.
- Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных заболеваний, 1964, т. VI, стр. 375.
- Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней под ред. Матвеева К. И. и Соколова М. И. 1964, стр. 422-430.
Источник: Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973
[youtube.player]Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Лабораторная диагностика
дифтерийной инфекции
Методические указания
МУК 4.2.3065—13
Л12 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции: Методические указания.—М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013.—63 с.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 года № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 14 июля 2013 г.
ББК 51.9
Содержание
1. Область применения. 4
2. Общие положения. Сущность метода. 4
3. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции. 9
4. Требования к взятию и транспортированию материала для бактериологической диагностики дифтерии 13
5. Организационно-методическая работа. 15
6. Бактериологическое исследование. 16
6.1. Порядок проведения бактериологического исследования. 16
6.2. Бактериологическое заключение. 20
6.3. Схема бактериологического исследования. 22
7. Методики идентификации возбудителя дифтерийной инфекции. 23
7.1. Определение токсигенных свойств коринебактерий дифтерии
с помощью реакции преципитации в геле. 23
7.2. Методики определения биохимических признаков. 30
8. Питательные среды.. 32
8.1. Методы приготовления питательных сред и реактивов. 34
8.2. Среды для определения биохимических свойств. 39
9. Хранение контрольных штаммов в лабораторных условиях. 42
10. Методы контроля питательных сред. 43
10.1. Метод бактериологического контроля питательных сред для
первичного посева и сред для определения токсигенных и биохимических свойств 43
10.2. Метод количественного определения аминного азота. 45
11. Методика постановки реакции пассивной гемагглютинации для выявления противодифтерийных антитоксических антител (РПГА) 46
12. Нормативные и методические ссылки. 53
Приложение 1. Рецепты красок. 54
Приложение 2. Материалы и оборудование. 56
Приложение 3. Таблица и рисунки. 59
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции
Методические указания
МУК 4.2.3065—13
1. Область применения
Методические указания (далее – МУ) предназначены для специалистов бактериологических лабораторий санитарно-эпидемиологической службы, лечебно-профилактических организаций независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности и научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику дифтерийной инфекции.
2. Общие положения. Сущность метода
Бактериологическое исследование проводят с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции, подтверждения эпидемиологических связей и наблюдения за распространением токсигенных коринебактерий дифтерии. Цель бактериологического исследования – выявление возбудителя дифтерии с помощью минимального количества диагностических тестов, необходимых, достаточных и специфичных для получения достоверного ответа в максимально сжатые сроки: не менее трёх суток – отрицательный ответ, трёх-четырёх суток – ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии (возбудителя дифтерии), четырёх-пяти суток – ответ о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии или других представителей этого рода.
Возбудитель дифтерии – коринебактерии дифтерии (Corynebacterium diphtheriae), продуцирующие дифтерийный токсин (экзотоксин). Источником инфекции является больной или бактерионоситель токсигенных С. diphtheriae.
Способность С. diphtheriae вырабатывать экзотоксин опосредован феноменом фаговой (или лизогенной) конверсии. Конверсию нетоксигенных штаммов С. diphtheriae в токсигенные и наоборот можно воспроизвести в особых экспериментальных (лабораторных) условиях. В тех случаях, когда при первичном посеве исследуемого материала от больных дифтерией или бактерионосителей выделяют токсигенные, а при повторных обследованиях после лечения антибиотиками – нетоксигенные коринебактерии дифтерии, можно предположить, что токсигенные и нетоксигенные C. diphtheriae колонизировали слизистые ротоглотки и носа одновременно. При лечении антибиотиками в первую очередь исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммы продолжают выделяться. Обнаружение только нетоксигенных штаммов у бактерионосителей при повторных обследованиях после лечения нельзя трактовать, как утрату способности токсигенных штаммов продуцировать экзотоксин.
Таксономически близкими к виду С. diphtheriae являются Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis – природные патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, домашних животных, способные вырабатывать дифтериеподобный экзотоксин, в редких случаях могут вызывать заболевания у человека.
Известны случаи выделения токсигенных C. ulcerans при клинической картине заболевания, сходной с дифтерией, а также токсигенных C. pseudotuberculosis, вызывающих лимфадениты. Инфекции, вызванные этими микроорганизмами, у человека встречаются крайне редко, не имеют эпидемического распространения, а, следовательно, значение этих случаев в медицине невелико.
На слизистых оболочках ротоглотки и носа в норме часто встречается Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана). Умение выделять и идентифицировать данные микроорганизмы, а также нетоксигенные С. diphtheriae служит критерием оценки качества работы бактериологов, особенно в период снижения и спорадической заболеваемости дифтерией.
C. diphthereiae растут на питательных средах, сбалансированных по своему составу, и не растут на простых питательных средах. Требуется кровь любого животного или человека (донора), как источник аминокислот, ростовых факторов, железа и пр. Не всегда коммерческие среды удовлетворяют этим требованиям, поэтому контроль качества питательных сред и всех ингредиентов в лабораториях обязателен.
Кровяные теллуритовые среды (КТА, Клауберг II) остаются лучшими селективными дифференциально-диагностическими средами, обеспечивающими рост колоний через 24 ч, что на одни сутки сокращает сроки выдачи окончательного бактериологического ответа. КТА прост в приготовлении: основой этой среды является коммерческий сухой питательный агар (СПА), в качестве кровяных добавок используют кровь, однако не исключены любые гемолизированные кровяные добавки.
Трудоемкость бактериологического метода и стоимость анализа сокращается при использовании двух половин одной чашки с селективной дифференциально-диагностической питательной средой (далее плотная питательная среда) для посева материала из зева и носа от одного обследуемого. Использование ¼ чашки для посева таких образцов на плотной питательной среде недопустимо, так как не позволяет, в большинстве случаев, получить рост изолированных колоний и провести исследование в установленные сроки.
Посев материала из зева и носа на кровяной агар производить нецелесообразно, так как очень сложно получить рост изолированных колоний C. diphtheriae на данной среде из-за обильного роста другой сопутствующей микрофлоры.
Окрашивание мазков осуществляют по Лёффлеру (щелочной метиленовый синий) или с использованием других синих красителей. Окраску по Граму не применяют, т. к. в процессе окраски клетки грамположительных C.diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть грамотрицательными (розовый оттенок). Чаще всего это явление наблюдают при окрашивании токсигенных C. diphtheriae (клеточная стенка токсигенных C. diphtheriae ближе по организации и структуре к грамотрицательным микроорганизмам).
В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства микробной клетки или колоний при идентификации C. diphtheriae недостаточно. Описаны случаи бактериологической гипо- и гипердиагностики (в 55,0 и 14,5 % случаев соответственно), когда использовали учет только морфологических признаков.
При идентификации C. diphtheriae необходим комплекс идентификационных тестов. Основной специфический тест для выявления возбудителя дифтерии, правильная постановка которого является залогом успешной диагностики дифтерийной инфекции, – определение у выделенной культуры способности к продукции дифтерийного токсина. Определять продукцию токсина следует начинать уже в первый день появления роста изолированных колоний на чашках с плотной питательной средой, исключая этап накопления чистой культуры. Не соблюдение этого правила увеличивает сроки исследования на одни сутки.
Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств коринебактерий необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний (двадцать и более) с чашек первичного посева. При множественном росте подозрительных колоний нельзя ограничиться формированием только одной-двух бляшек. Кроме того, необходимо изучать токсигенные свойства отдельных изолированных колоний, чтобы не потерять нетоксигенные штаммы C. diphtheriae, присутствие которых также возможно при наличии токсигенных С. diphtheriae в патологическом материале.
Используют два способа постановки пробы на токсигенность:
1) модифицированная проба Элека с бумажными полосками, утверждённая для бактериологической практики в нашей стране в 1961 г.;
2) проба Фельдмана Ю. Г. и соавторов с бумажными дисками, разработанная в нашей стране и утвержденная в 1988 г., получившая одобрение Международной рабочей группы ВОЗ по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции к применению в зарубежных лабораториях.
В пробе на токсигенность следует использовать только антитоксин – противодифтерийные антитоксические антитела, очищенные методом специфической сорбции, что позволяет избежать появления неспецифических линий преципитации микробного происхождения. В исключительных случаях при отсутствии антитоксина допускается использование лечебной противодифтерийной антитоксической лошадиной сыворотки. В таком случае возможно появление неспецифических линий преципитации микробного происхождения, которые необходимо отличить от специфических линий токсического происхождения.
3. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции
Род Corynebacterium гетерогенный, как и группа, условно объединившая его и другие роды грамположительных палочек, не образующих споры размером 0,3—0,8 ´ 1,5—8,0 мкм, неподвижных, обладающих различной степенью полиморфизма и плеоморфизма. C. diphtheriae имеют размер 0,2—0,6 ´ 1,0—7,0 мкм. Арабиногалактановый полимер клеточной стенки C. diphtheriae отличает этот вид от всех других видов рода Corynebacterium. Клеточная стенка C. diphtheriae имеет от 3—5 до 7—9 слоёв. Известно, что клеточная стенка токсигенных C.diphtheriae лучше дифференцирована и более тонкая по сравнению с клеточной стенкой нетоксигенных C. diphtheriae и других коринеформных микроорганизмов этого рода, что определяет их отношение к антибиотикам – токсигенные более чувствительны, чем нетоксигенные к пенициллину, эритромицину, тетрациклину и макролидам. Однако появляются штаммы C. diphtheriae устойчивые к некоторым антибиотикам, преимущественно выделенные от бактерионосителей.
Патогенные для животных Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis, некоторые комменсалы кожи со слизистых оболочек человека, например, Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана), Corynebacterium xerosis, Corynebacterium striatum таксономически близки к виду C. diphtheriae.
Большинство видов лучше растет в аэробных условиях, в том числе и микроорганизмы вида C. diphtheriae. Вместе с тем, C. diphtheriae являются факультативными анаэробами (генерируют энергию, используя как молекулярный О2, так и органические соединения), что крайне важно учитывать при изучении их ферментативной активности.
Все коринебактерии, в т. ч. и C. diphtheriae, являются мезофилами и растут при 36—37 °С.
[youtube.player]Читайте также: