Мышечная дистрофия лечение стволовыми клетками

• 
  Антон Чугунов
• 
  Ольга Волкова

• CRISPR/CAS
• Генная инженерия
• Медицина

Мышечная дистрофия Дюшенна — тяжелейшее Х-связанное заболевание, эффективного лечения которого до сих пор нет. В одном из последних номеров Science вышли целых три статьи об успешном тестировании на мышиных моделях технологии CRISPR/Cas9 для лечения этой болезни. Может быть, у этого подхода есть шанс добраться и до клиник?

Мышечная дистрофия Дюшенна, от которой страдает один из 3600-5000 новорожденных мальчиков, вызывается отсутствием дистрофина — белка, который соединяет цитоскелет и внеклеточный матрикс в мышечном волокне и обеспечивает его стабильность при сокращении (рис. 1). Из-за мутаций гена DMD рамка считывания при трансляции его мРНК сдвигается, и синтез белка преждевременно прекращается. Врожденная болезнь очень быстро прогрессирует: ее диагностируют в возрасте около четырех лет, а к 10 годам ребенку обычно уже нужна инвалидная коляска. Это происходит потому, что без дистрофина волокна повреждаются, и как только регенеративная способность мышечных волокон исчерпывается, они заменяются фиброзной и жировой тканями [1]. Как показывают исследования, когнитивные функции у ребенка тоже могут быть нарушены [2]. Больше 30 лет с таким заболеванием, как правило, не живут, а смерть наступает от сердечных и респираторных осложнений. Более мягкий вид миодистрофии, связанной с геном DMD, — это мышечная дистрофия Беккера, когда мутации не приводят к смещению рамки считывания [3].

Дистрофин находится на внутриклеточной поверхности сарколеммы вдоль всей длины мышечных волокон и входит в состав дистрофин-ассоциированного гликопротеинового комплекса (ДАГК, DGC). Он связывается одним концом с F-актином цитоскелета, а другим — с β-дистрогликаном, что стабилизирует волокна во время сокращения. Ген дистрофина — один из самых длинных у человека.

Рисунок 1. Мутации в дистрофине — причина развития миодистрофии Дюшенна. а - Дистрофин связывается с актиновыми филаментами (часть цитоскелета) через домены N-ABD и ABD2) и с ДАГК через домены CR и CT. б — Кристаллическая структура N-ABD дистрофина. Зоны связывания с актином показаны желтым, четыре хорошо изученных мутации, вызывающих заболевание, — красным.

У стратегии удаления экзонов есть даже преимущества перед воссозданием полной длины гена: ее проще разработать, чем восстановить индивидуальные делеции каждого пациента [7].

Конкурирующие лаборатории: кто первым воплотит технологию в терапию для человека?

Ученые трех лабораторий успешно применили технологию пропуска экзонов in vivo на стандартном объекте — мышах — и показали, что их метод помогает восстановить рамку считывания и частично восстановить синтез дистрофина. Поскольку даже невысокий его уровень (3–15% от нормального) приносит терапевтическую пользу, результаты работ можно назвать успешными.

Группа Эрика Олсона уже не в первый раз использует метод CRISPR/Cas9 в своих работах по мышечной дистрофии Дюшенна. В 2014 году ученые исправили мутацию в зародышевой линии мышей и предотвратили развитие болезни. Однако, поскольку пренатальное редактирование генома на человеческих эмбрионах (пока?) запрещено, исследователям пришлось придумать способ постнатального применения технологии.

Группа Эми Уаджерс провела во многом похожий эксперимент [8]. После множества подготовительных этапов работы по редактированию генома и пропуску экзона на клетках и животных их опыт тоже увенчался успехом: программируемые CRISPR-комплексы в составе аденоассоциированного вируса (AAV) были доставлены с помощью локального и системного введения к дифференцированным скелетным волокнам, кардиомиоцитам и сателлитным мышечным клеткам новорожденных и взрослых мышей. Если редактирование направлено только на мышечные волокна, то эффект со временем может сойти на нет. Однако, как отмечает Уаджерс, редактирование генов в сателлитных клетках может обеспечить гораздо более длительный результат. Оно способно привести к созданию пула регенеративных клеток, несущих отредактированный ген дистрофина, и в результате обычной репарации мышц отредактированный ген окажется и в мышечных волокнах.

Терапия миодистрофии Дюшенна: старые и новые подходы

По словам Олсона, главное отличие новой стратегии с использованием вектора, вмещающего в себя компоненты для редактирования генома, от других терапевтических методов в том, что она устраняет причину болезни. А какие еще подходы разрабатывают ученые?

Рисунок 3. Животные модели миодистрофии Дюшенна. а — Проявления миодистрофии Дюшенна у мышей и собак. Вверху: у мышей mdx симптомы проявляются только в старости, и они склонны к образованию рабдомиосарком — опухолей мышечного происхождения. Размер мышей с нокаутами генов атрофина/дистрофина и интегрина/дистрофина значительно меньше, чем их ровесников дикого типа (BL10 и BL6). Внизу: проявления болезни у пятимесячной больной собаки. Различия между здоровой и больной двухлетними собаками. б — Сравнение продолжительности жизни здоровых и больных людей, собак и различных линий мышей.

Один из многообещающих подходов — это клеточная терапия. Хотя опыты с внутримышечной инъекцией миобластов от здоровых доноров провалились, технологии с использованием стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) пока успешно испытываются на моделях не только миодистрофии Дюшенна, но и болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, спинальной мышечной атрофии, бокового амиотрофического склероза, аутизма и шизофрении [14–16]. Например, в 2013 году исследователи из Бостонской детской больницы (Boston Children’s Hospital’s Stem Cell Program) с помощью смеси трех малых молекул (форсколина, основного фактора роста фибробластов bFGF и ингибитора гликогенсинтазы киназы-3) перепрограммировали ИПСК из кожи пациентов с миодистрофией Дюшенна в мышечные клетки, которые затем успешно прижились у мышей. Сейчас из ИПСК получены кардиомиобласты и нейроны [2].

Другие исследования показывают, что восстановление нормального уровня синтеза оксида азота (NO), который снижается у больных из-за нарушения активности NO-синтазы (nNOS), ослабляет воспаление, повышает активность собственных стволовых клеток и реконструирует морфологию и функции скелетных мышц [3].

Уже в фазе II клинических испытаний находится препарат Givinostat — ингибитор гистондеацетилаз, который замедляет прогрессирование болезни в мышиной модели.

Такой массированный экспериментальный удар по миодистрофии Дюшенна вселяет надежду. Станет ли технология CRISPR/Cas9 ведущей в разработке терапии, которую смогут принять на вооружение клиницисты? Возможно, не за горами и публикации похожих работ по другим заболеваниям, где нужно избавиться от мутаций в одном-единственном гене? Это мы узнаем из ближайших выпусков Science (а также других почетных журналов).

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В обзоре обсуждаются современные подходы к лечению мышечных дистрофий - гетерогенной группы нервномышечных заболеваний, которые проявляются в виде прогрессирующей слабости мышц, а также их частичной потери, что во многих случаях приводит к смерти. Эффективных медикаментозных способов лечения дистрофий в настоящее время нет. Однако существует несколько исследуемых терапевтических вариантов лечения мышечных дистрофий, включающих генную терапию и трансплантацию миогенных клеток-предшественников - клеточную терапию. В статье обсуждаются достижения и трудности на пути внедрения генной терапии в клиническую практику лечения мышечных дистрофий. Особое внимание уделено клеточной терапии, перспективному направлению регенеративной медицины, дающему надежду на излечение многих ранее не излечимых как наследственных, так и приобретенных заболеваний. Обсуждаются потенциальные источники соматических и эмбриональных стволовых/прогениторных клеток человека, которые могут использоваться как в качестве объектов приложения генно-инженерных методов, так и для клеточной терапии мышечных дистрофий. Обсуждаются проблемы, стоящие на пути успешного внедрения в клиническую практику лечения мышечных дистрофий стволовых/проге-ниторных клеток человека.

Введение

Мышечная дистрофия - это группа наследственных заболеваний, которые характеризуются прогрессирующей мышечной слабостью и потерей мышечных тканей. В настоящее время все дистрофии считаются заболеваниями неизлечимыми. В некоторых случаях болезнь приводит к смерти. Мышечные дистрофии различаются по группам поврежденных мышц, возрасту, при котором начинается болезнь, и скорости ее прогрессирования. Молекулярной причиной, лежащей в основе многих дистрофий, являются мутации в генах, кодирующих компоненты дистрофин-гликопротеинового комплекса, который связывает миофибрильный цитоскелет с внеклеточным матриксом 1.

Наиболее часто встречается и наиболее тяжело протекает мышечная дистрофия Дюшенна (МДД). МДД поражает мальчиков с частотой, равной 1 на 3500. Она проявляется в 1-2-летнем возрасте и характеризуется потерей независимого передвижения уже к 10 годам. Больные МДД, как правило, умирают в возрасте 15-25 лет от сердечной или легочной недостаточности вследствие атрофии дыхательных и сердечной мышц. Сходными симптомами и причиной возникновения характеризуется мышечная дистрофия Беккера (МДБ), однако протекает это заболевание в менее тяжелой форме. Обе болезни являются следствием мутаций в гене дистрофина, который локализован на коротком плече Х-хромосомы и является самым большим из известных генов человека. Он содержит 79 экзонов и составляет приблизительно 0,1 % всего генома человека 5. Этот ген кодирует мышечный белок дистрофин с молекулярным весом 427 кДа, который является основным структурным белком, стабилизирующим сарколемму мышечного волокна. Своим N-концом он связывается с актином - главным компонентом внутриклеточного цитоскелета, а С-концом - с группой дистрофин ассоциированных дистро- и саркогликанов -белков сарколеммы, и через них - с основным белком внеклеточного матрикса - ламинином (рис. 1).

Мутации в гене дистрофина приводят к полному отсутствию или сильному снижению уровня дистрофина в случае МДД, либо к образованию частично функционального дист-рофина в случае МДБ. Отсутствие или функциональная недостаточность этого белка приводит к нарушению целостности клеточной мембраны и является причиной запуска процессов дегенерации мышечного волокна. Результатом этого процесса является повышение проницаемости мембран и возникновение в них физических разрывов, что приводит к выходу ферментов из мышц в сыворотку крови (повышение в сыворотке крови активности креатинкиназы является биохимическим маркером МДД и МДБ). На начальных стадиях заболевания дегенерация мышечных волокон компенсируется активной регенерацией фибрилл, благодаря делению и слиянию мышечных сателлитных клеток. Однако с возрастом этот процесс становится менее эффективным, что приводит к прогрессирующей мышечной слабости [7].

В настоящее время при отсутствии эффективных медикаментозных способов возлагаются большие надежды на использование для лечения мышечных дистрофий методов генной и клеточной терапий. Задачей этих способов лечения является восстановление синтеза дистрофина в мышечных клетках, что достигается либо путем встраивания в клетки нормального гена дистрофина, либо коррекцией мутаций в самом гене или в иРНК [8].

Генная терапия мышечных дистрофий

Основное различие генной и клеточной терапий заключается в способе доставки нормального гена дистрофина в мышечную клетку. Генно-инженерные подходы доставки гена используют, как правило, вирусные векторы. В экспериментах на мышах была продемонстрирована достаточно эффективная и долговременная трансфекция скелетных и сердечной мышц, а также мышц диафрагмы после введения аденовирусных, ретровирусных или лентивирусных векторов, доставляющих функциональный ген дистрофина или минидистрофина 10.

Вместе с тем, использование вирусных носителей, особенно в экспериментах in vivo, наталкивается на существенные методические трудности. К ним, например, относятся недостаточная пакующая способность ретровирусов и необходимость наличия клеток-хелперов. Наибольшим препятствием использования вирусных векторов для доставки генетических конструкций является выраженный иммунный ответ реципиента на вирусные антигены. Несмотря на огромный объем работ по модификации генома вируса-носителя и сокращению его размера до минимально возможного, иммунный ответ, тем не менее, сохраняется и делает бессмысленным повторное введение генно-инженерных конструкций. В результате оказывается невозможно достичь такого уровня трансфекции, при котором наступает эффект лечения. Большинство исследователей полагает, что достижение терапевтического эффекта возможно при успешной трансфекции не менее 20% [по последним данным - даже 40%) всех мышечных волокон, включая мышцы сердца и диафрагмы. При этом основными критериями эффективности трансфекции являются появление дистрофин-положительных мышечных волокон, нормализация уровня креатинкиназы в сыворотке крови, изменение физиологических параметров [силы мышц и др.).

Существуют также невирусные способы доставки к ДНК гена дистрофина, которые включают в себя баллистическую трансфекцию, методы электропорации [электрошока), введение генетических конструкций в составе липосом, либо упакованных с помощью олигопептидов, молекулярных конъюгатов или полимерных носителей [9, 13, 14]. Эти способы не вызывают такого иммунного ответа, как вирусные векторы, однако способность к трансформации у большинства из них ниже.

Несмотря на довольно интенсивные исследования на животных моделях, до настоящего времени клинические испытания генно-инженерных методов лечения дистрофий на больных людях практически не проводились.

Следует также упомянуть о существовании еще одного подхода к лечению дистрофий - активации синтеза в мышечных клетках репрессированного в процессе онтогенеза аутосомного гомолога гена дистрофина - гена утрофина [15]. Известно, что в эмбриогенезе человека приблизительно до семи недель развития дистрофин не экспрессируется, и его функцию в мышцах выполняет белок утрофин [16]. Между 7 и 19 неделями развития экспрессируются оба белка, после чего происходит замещение мышечного утрофина на дистрофин. Эти белки похожи своими N- и С-концевыми доменами, играющими решающую роль в функции дистрофи-на, тогда как функционально малозначимый центральный rod domain присутствует в утрофине в сильно укороченном виде. Если достичь дерепрессии гена утрофина у больных мышечной дистрофией, то продукт его экспрессии белок утрофин мог бы компенсировать недостаток дистрофина в мышцах [17]. В настоящее время получены данные, свидетельствующие о том, что in vivo трансфекция mdx мышей геном утрофина приводит к экспрессии этого белка в скелетных мышцах и диафрагме 20. Эти результаты указывают на принципиальную возможность коррекции недостатка дистрофина в мышечных волокнах с помощью утрофина.

Клеточная терапия мышечных дистрофий

Перспективным направлением клеточной терапии мышечных дистрофий представляется трансплантация как стволовых клеток [СК), способных к самовозобновлению и дифференциации во множество клеточных линий организма, так и миогенных прогениторных клеток. При этом рассматриваются возможности использования для трансплантации как взрослых, так и эмбриональных стволовых/прогенитор-ных клеток.

Стволовые клетки костного мозга. В КМ, основываясь на адгезивных свойствах in vitro, различают два типа СК: адгезивные стромальные мезенхимальные СК и неадгезивные гемопоэтические СК. Мезенхимальные СК могут дифференцироваться в клетки кости, хряща, жировой ткани и мышц как in vitro, так и in vivo. Миогенные клетки могут быть получены in vitro при действии на адгезивные мезенхимальные клетки 5-азацитидина (5-azacytidine), который активирует мышечный переключатель MyoD [35]. Субпопуляция мезенхимальных СК также была идентифицирована в мо-нонуклеарных клетках КМ - это CD45+/glycophorin+ клетки [36]. После ex vivo экспансии эти мультипотентные взрослые прогениторные клетки могут быть трансплантированы в необлученный организм мышей, где они приживаются и развиваются в гемопоэтические линии, эпителиальные клетки, клетки печени, легких, кишечного эпителия. При введении в раннюю бластоцисту эти клетки дифференцировались в мышечные. И хотя их способность становиться предшественниками скелетной мышцы при внутривенном введении продемонстрирована не была, свойство этих мультипотент-ных взрослых прогениторных клеток активно пролиферировать без очевидного старения и потери мультипотенции делает их привлекательным кандидатом для клеточной терапии.

Более перспективными для клеточной терапии мышечных дистрофий являются неадгезивные гемопоэтические СК, которые, помимо гемопоэза, участвуют в формировании нервной ткани [37, 38], печени [39], сердечной мышцы [29] и скелетных мышц. Было показано, что эти миогенные прогениторы могут мигрировать и участвовать в регенерации поврежденной мышечной ткани после трансплантации КМ [40]. В этом исследовании также было продемонстрировано, что в репарации поврежденных кардиотоксином мышечных клеток могут участвовать не только клетки КМ, введенные непосредственно в мышцу, но также и введенные внутривенно. В обоих случаях донорские клетки сливались с мышечными волокнами реципиента. Эксперименты по внутривенному введению донорских клеток КМ mdx мышам также продемонстрировали, что трансплантированные клетки попадают из кровеносной системы в мышечную ткань и сливаются с волокнами дистрофических мышц mdx мышей [30, 41, 42]. Однако, во всех этих экспериментах репарация дистрофических мышц трансплантированными клетками КМ никогда не превышала 1 %. Это можно объяснить как слабым захватом клеток КМ, так и неспособностью стволовых клеток КМ адекватно реагировать на клеточные сигналы реципиента.

Несмотря на то, что использование клеток КМ для лечения модели МДД у животных оказалось неэффективным, существует мнение некоторых исследователей, что трансплантация КМ для лечения мышечной дистрофии у людей будет более эффективной. Способность СК КМ человека участвовать в репарации мышечных волокон была продемонстрирована Gussoni с соавторами [43]. Они представили иммуногистохимический и FISH анализ мышц мальчика, которому в возрасте 1 года для лечения тяжелого X-связанного иммунодефицита, диагностированного вместе с МДД, была проведена трансплантация КМ. При этом, в 12 лет МДД имела умеренное протекание, а в мышцах больного через 13 лет после трансплантации было обнаружено присутствие диплоидных донорских ядер [0,5-0,9% мышечных волокон), что указывает на способность экзогенных клеток КМ человека сливаться со скелетными мышечными волокнами реципиента и сохраняться на протяжении, по крайней мере, 13 лет.

Таким образом, несмотря на возможность взрослых ге-мопоэтических СК сливаться с дистрофическими скелетными мышечными волокнами, частота таких случаев слишком низка для того, чтобы быть эффективным способом лечения мышечных дистрофий.

Клетки пуповинной крови. Очень близки по свойствам клеткам КМ клетки пуповинной крови. В их составе также присутствуют как кроветворные, так и мезенхимальные СК [44]. Применение этих клеток лишено морально-этических ограничений, их легко получать, количество СК в пуповинной крови значительно больше, пролиферативный потенциал выше, они не отягощены грузом генетических мутаций, накопленных взрослыми соматическими СК КМ. Клетки пуповинной крови менее иммунологически зрелые. Эксперименты, проведенные на мышах [45], продемонстрировали, что миогенные прогениторы [предшественники) присутствуют в пуповинной крови человека и способны мигрировать и дифференцироваться в миоциты. Однако, как и в случае СК КМ, до сих пор отсутствуют доказательства эффективного терапевтического действия клеток пуповинной крови при их использовании для лечения мышечных дистрофий. Как и для всех остальных потенциальных источников клеток для лечения мышечных дистрофий, существуют методические проблемы, связанные с выделением из пуповинной крови популяции миогенных предшественников и их дальнейшей экспансией в условиях in vitro.

СатК были одним из первых типов клеток, используемых в клеточной терапии мышечных дистрофий. СатК, которые выращиваются in vitro, представляют собой мононуклеар-ные клетки, коммитированные по миогенному пути [миоб-ласты). Эксперименты по внутримышечной трансплантации миобластов, изолированных из мышей дикого типа, mdx мышам продемонстрировали экспрессию дистрофина in vivo [55, 56]. Эти исследования послужили основанием проведения клинических испытаний миобластов с целью лечения МДД 56. Для этого донорские СатК были изолированы в результате биопсии мышц у близких родственников больных детей. Затем эти клетки выращивались в условиях in vitro, после чего 80-100 миллионов донорских миобластов было введено в мышцы детей путем множественных инъекций. Контрлатеральные мышцы были инъецированы как контроль плацебо. Однако, иммуногистохимические и RT-PCR исследования мышц больных, которые проводились на протяжении года, показали, что трансплантация миобластов таким способом была неэффективна. Несмотря на то, что пересаженные миобласты действительно сохранялись и продуцировали дистрофин в мышечных волокнах пациентов с МДД, частота, при которой это встречалось, была очень низкой (

Клинический случай

Пациент в возрасте 20 лет с МДБ. Заболевание началось со слабости в ногах и частых падений во время ходьбы в возрасте 9 лет. Постепенно развивалась сильная боль в икрах, стало сложно подниматься с пола. В 14 лет стал испытывать сложности при подъеме по лестнице. Симптомы носили прогрессирующий характер. Пациент был проконсультирован педиатром и неврологом. На основании повышенного уровня креатинфосфокиназы (КФК) и клинических проявлений была диагностирована мышечная дистрофия. Спустя год пациенту стало сложно справляться с повседневной физической нагрузкой: вставать с пола / кресла, подниматься по лестнице, сохранять равновесие при ходьбе (частые падения). Пациент прошел курс физиотерапии и приема комплекса витаминов, что не принесло результата.

По данным неврологического осмотра выявлена мышечная гипотония и гиперрефлексия с проксимальной мышечной слабостью, скованностью в ахилловых сухожилиях, псевдогипертрофией икроножных, дельтовидных, ягодичных мышц и мышц предплечья. У пациента наблюдалась походка вразвалку с желанием опереться, переразгибание коленей, гиперлордоз, быстрая утомляемость и периодически возникающая боль в груди. Для оценки состояния пациента были использованы различные критерии, которые приведены в Таблице 1.

По данным лабораторных исследований уровень КФК был повышен (3180 МЕ/л). МРТ мышц выявило диффузную мышечную атрофию и жировое замещение ягодичной, бедренной мышц и мышц предплечья. Электромиография (ЭМГ) выявила полифазные моторные единицы со сниженной длительностью и амплитудой потенциала действия, что служит причиной миопатического процесса. Эхокардиография(ЭхоКГ) с допплерографией и цветным картированием выявила генерализованную гипокинезию, малую сократимость левого желудочка и его диастолическую дисфункцию третьего типа. Фракция выброса левого желудочка составила 25-30%.

Материалы и методы

Пациент был выбран для медицинского вмешательства в соответствии с Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (ВМА). Протокол лечения разработан Институциональным комитетом исследования стволовых клеток (Institutional Committee for Stem Cell Research, IC-SCR). Перед госпитализацией пациент подписал добровольное информированное согласие на медицинское вмешательство.

Проведена детальная оценка. Мышцы с показателем функциональной независимости меньше 3 (бицепс, трицепс, квадрицепс, разгибатели спины, ягодичная/брюшная/ передняя большеберцовая мышцы, мышцы задней поверхности бедра) выбраны для внутримышечной трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (далее – МСККМ). Двигательные точки (проекции зон внедрения и разветвления нервных волокон в мышцу) были идентифицированы и отмечены опытным физиотерапевтом.

За 48 часов и за 24 часа до введения МСККМ выполнена подкожная инъекция гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ, 300 мкг). Выполнена трансплантация собственных МСККМ пациента в положении лежа. Костный мозг был получен из передней верхней части правой подвздошной кости. Изолированные мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) были проверены на наличие CD34+ маркеров с помощью метода проточной цитометрии, разведены в спинномозговой жидкости и введены внутримышечно в двигательные точки и в полость позвоночного канала. Для уменьшения воспаления внутривенно вводился метилпреднизолон (1мг) разведенный в растворе Рингера (500 мл). После клеточной терапии пациент прошел курс нейрореабилитации. Мультидисциплинарной протокол включал в себя физиотерапию, трудотерапию, консультацию психолога и советы по питанию. Физиотерапия включала в себя упражнения для укрепления слабых мышц, силовые упражнения для неповрежденных мышц, коррекцию походки, поддержание равновесия. Трудотерапия включала в себя функциональную тренировку, реабилитацию рук и их шинирование для предотвращение деформации. Пациенту была рекомендована регулярная терапия на дому и диета с высоким содержанием белков.

Результаты

После клеточной терапии пациент дважды наблюдался в стационаре через 3 и 9 месяцев. Спустя 3 месяца было отмечено улучшение двигательной функции верхних конечностей. Выполнение движений над головой требовало сравнительно меньших усилий. Наблюдалось двустороннее снижение жесткости и псевдогипертрофии икроножных мышц . Отмечались значительные улучшения в положении стоя и сидя, в способности держать равновесие. Баланс в положении стоя и при ходьбе улучшился. Частота падений при ходьбе заметно уменьшилась с 4-5 падений в месяц до 1 падения за 3 месяца. Характеристики дыхательной функции также улучшились: жизненная емкость легких (ЖЕЛ) (с 1250 мл до 1750 мл) и пиковая скорость выдоха (ПСВ) (с 290 мл до 360 мл),.

Спустя 9 месяцев пациент также находился под наблюдением врачей и никаких ухудшений по описанным выше симптомам не было. Его выносливость во время выполнения упражнений и в повседневной активности увеличилась. Вместе с тем снизились и уровни утомляемости и появилась возможность выполнять упражнения с большей легкостью. Модифицированная шкала ручного тестирования мышц Совета по медицинским исследованиям (далее также – mMRC-MMT) показала значительное улучшение почти во всех группах мышц (Таблица 2).

Шкала “Северной Звезды” показала значительное улучшение во время второго наблюдения. Остальные показатели шкал, упомянутые выше, после вмешательства остались неизменными, что может означать прекращение прогрессии заболевания.

О мышечной дистрофии Беккера и клеточной терапии

МДБ медленно приводит к инвалидности вследствие снижения подвижности и способности самостоятельного ухода. Это может выражаться в сердечных проявлениях, таких как: учащенное сердцебиение, головокружение, обморок, одышка в состоянии покоя или во время физической нагрузки.

Ведение МДБ мультидисциплинарное и состоит из медицинского ухода с использования кортикостероидов, которые снижают воспалительный процесс мышечных волокон.
Реабилитация подразумевает продление периода функциональной самостоятельности. Она направлена на симптомы, а не на причину заболевания. В настоящее время нет определенной терапевтической стратегии для контроля прогрессии заболевания и увеличения мышечной силы.

Генная терапия нацелена на введение отсутствующего гена дистрофина, используя различные векторы. Ряд практических трудностей не позволяет генной терапии быть клинически применимым методом в настоящее время. Трансплантация стволовых клеток предлагается в качестве лечения таких заболеваний, как мышечная дистрофия. На основе клеточной терапии предпринимались попытки стимулировать регенерацию мышц с надеждой на то, что стволовые клетки восстановят мышечную функцию и исправят патологию путем повторного синтеза мышц. Стволовые клетки рассматриваются как подходящий вариант для терапевтического применения из-за их способности к самовосстановлению и потенциала дифференцировки. В последние годы были получены обнадеживающие результаты лечения человека с использованием зрелых стволовых клеток.

Alok Sharma при участии соавторов., в 2013 году изучали эффект внутримышечной аутотрансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у 150 пациентов с мышечной дистрофией. Через 12 месяцев наблюдения у пациентов наблюдалось увеличение мышечной силы и улучшение походки. Симптоматические и функциональные улучшения также наблюдались в 86,67% случаев: у шести пациентов снижен уровень жировой инфильтрации и выявлена регенерация мышц на МРТ , а у девяти – выявлены положительные изменения электрической активности мышц на ЭМГ.

Мезанхимальные стволовые клетки состоят из множества клеток, таких как гематопоэтические стволовые клетки, тканеспецифические клетки-предшественники, стромальные клетки и специализированные клетки крови на разных стадиях развития. Эти клетки обладают способностью мобилизовать и оказывать свои репаративные эффекты в месте повреждения. Они способствуют неоваскуляризации и усиливают ангиогенез (образование кровеносных сосудов), продуцируя сигнальные молекулы, такие как факторы роста эндотелия сосудов и факторы роста фибробластов (FGF2). Они также способствуют ремоделированию тканей, предотвращают апоптоз (отмирание клеток), уменьшают воспаление, высвобождают факторы роста и активируют сателлитные клетки. Это паракринные эффекты, которые могут помочь в достижении желаемого результата клеточной терапии. Аутологичные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга были использованы в этом случае, потому что они не имеют этических проблем, и его безопасность была установлена (не требуется донор, это клетки самого пациента).

Трансплантация стволовых клеток в нужное место мышечного тела, как правило, является основной практической трудностью. Внутривенное введение стволовых клеток, полученных из костного мозга, показало успешное возвращение стволовых клеток в поврежденные мышечные ткани на моделях животных; однако это созадет риск разбавления концентрации клеток. Мышечная дистрофия в основном воспринимается как заболевание мышц, с малым количеством свидетельств нервно-мышечных поражений. Дистрофин является частью структурного белка, обнаруженного в миелине, образующего клетки Шванна и нервы. Демиелинизация и дегенерация как изменения в нервах могут происходить с такими нарушениями в клетках. Поэтому были выбраны два различных способа трансплантации клеток: внутримышечный и интратекальный. Мезенхимальные клетки костного мозга вводили в двигательные точки целевых слабых мышц для восстановления иннервирующего нерва, а также мышц. Известно, что спинномозговая жидкость содержит факторы роста, которые помогают росту коркового эпителия и стимулируют васкуляризацию в нервной системе, поэтому она использовалась в качестве разбавляющей среды.

Мышечная сила регистрировалась с помощью ручного тестирования мышц по шкале, разработанной опытными физиотерапевтами исследовательской группы на основе модифицированной шкалы ручного тестирования мышц Совета по медицинским исследованиям (mMRC-MMT). Поскольку mMRC-MMT не подразделяется на 1 и 2 классы на основе частичного диапазона движения (ЧДД), в данном случае в шкалу mMRC MMT – I добавлены 1 и 2 классы. Это позволило исследовательской группе количественно оценить минимальные изменения силы, наблюдаемые у пациентов с МДБ (Таблица 2). Увеличение мышечной силы, которое было зарегистрировано в mMRC-MMT, также наблюдалось в элементах шкалы “Северной звезды”, таких как подъем и сидение. Функционально и баланс в положении стоя и при ходьбе были улучшены. Все объективные показатели не показали ухудшений.

Важной причиной заболеваемости и смертности при мышечной дистрофии может быть нарушение функции дыхания, но в данном исследовании было отмечено улучшение значений максимального объема вдоха и PEFR по сравнению с исходным уровнем, а также было снижение уровня усталости и улучшение выносливости во время действий, которые могут быть связаны с улучшением функции дыхательных мышц.

Для поддержания достигнутых улучшений и для статического прогрессирования может быть полезным повторение процедуры клеточной терапии. Клеточная трансплантация может вызвать регенерацию дегенерированных мышц и может изменить прогрессирование заболевания при МДБ. Несмотря на то, что данный клинический случай является результатом наблюдения за одним пациентом, он может послужить важным шагом в проведении дальнейших исследований. Для установления оптимальной дозировки, источника и частоты трансплантации необходимы тщательный анализ и крупные клинические испытания со сложной методологией. Одно из ограничений исследования заключается в том, что у него нет похожего клинического случая для сравнения, но поскольку у пациента наблюдалась остановка прогрессии после клеточной терапии, можно предположить, что клеточная трансплантация сыграла в этом жизненно важную роль.

В заключение, клеточная терапия в сочетании с реабилитацией может предложить возможность восстановления и регенерации мышечных волокон, снижая при этом скорость прогрессирования Мышечной дистрофии Беккера.

Перевод выполнен: Бережной Д.С., Чернец Е.Н.