Накопление риккетсий и хламидий при производстве вакцин

Риккетсии и хламидии – бактерии, которые, как и вирусы, являются облигатными внутриклеточными паразитами. Поэтому для их культивирования применяются:

Пшеничнов и Райхер разработали метод культивирования риккетсий на личинках вшей, которых кормят дефибринированной кровью с риккетсиями через мембрану кожи трупа.

Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты. Они размножаются в живых клетках и не растут на искусственных питательных средах, поэтому методы культивирования вирусов отличаются от методов культивирования бактерий.

1. На лабораторных животных. Заражают животных (подкожно, внутримышечно, внутрибрюшино), которые чувствительны к определенным вирусам: хорьков - вирусом гриппа, кроликов - вирусом бешенства, обезьян - вирусом полиомиелита. Индикация (обнаружение) вируса проводится по признакам заболевания. Недостаток метода - не все вирусы можно культивировать на животных, например, животные невосприимчивы к вирусам человека.

2. В куриных эмбрионах. Заражают куриный эмбрион (аллонтоисная полость, хорион-аллонтоисная оболочка, амниотическая полость, желточный мешок, сам эмбрион). Куриный эмбрион – очень удобен. Он защищен от попадания других микробов (стерильный), техника работы с ним проста, можно накопить большое количество вирусов. Индикация:

а)по специфическим поражениям на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона,

б)по реакции склеивания эритроцитов – реакции гемагглютинации (РГА).

а)не все вирусы (вирус полиомиелита, вирус ящура) можно вырастить в куриных эмбрионах;

б)невозможно обнаружить микроб без вскрытия эмбриона;

в)в нем много загрязняющих белков и других соединений.

3. В тканевых культурах. Тканевые культуры или клеточные культуры – клетки, выращенные вне организма на искусственных питательных средах. Для их приготовления используют чаще всего эмбриональные и опухолевые ткани. Метод тканевых культур разработан Дж. Эндерсом в 50-е годы. Большинство вирусов способно размножаться в культурах клеток. Для каждого вируса можно подобрать наиболее чувствительную культуру клеток. Способы обнаружения (индикации) вирусов в тканевой культуре. Вирусы можно обнаружить следующим образом.

1. По цитопатическому действию (ЦПД). В результате размножения вирусов в клетках происходят морфологические изменения клеток (вакуолизация цитоплазмы, деструкция митохондрий, округление клеток). Часть клеток погибает и отслаивается от стекла. Вместо сплошного монослоя остаются отдельные клеточные островки. ЦПД обнаруживают под микроскопом (´8). По ЦПД можно не только обнаружить, но и идентифицировать вирусы. Например, вирус полиомиелита вызывает мелкозернистую деструкцию клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений клеток в виде виноградных гроздьев; вирус кори вызывает образование симпластов – многоядерных клеток.

2. По образованию включений. Включения - скопления вирусов в клетках. Они имеют различную форму и размеры. Их окрашивают по Романовскому-Гимзе или флюорохромами и наблюдают под микроскопом.

3. По гемадсорбции. Клетки, зараженные вирусами, могут адсорбировать эритроциты. Вирусы выходят на поверхность клеток и связывают эритроциты. Эритроциты добавляют к культуре и через некоторое время промывают физиологическим раствором. На поверхности клеток под микроскопом видны прилипшие эритроциты в виде разнообразных фигур;.

4. По реакция гемагглютинации. Гемагглютинация - склеивание эритроцитов под влиянием вирусов. Эритроциты добавляют к культуральной жидкости. Если в ней есть вирусы, то эритроциты склеиваются.

5. По "цветной" реакции. Клетки культуры выращиваются на жидкой среде с индикатором (метиленовым красным). Индикатор изменяет цвет (с красного на желтый) под действием кислых продуктов метаболизма при росте нормальных клеток. Если клетки заражены вирусом, то нормальный метаболизм нарушается, кислые продукты не образуются и индикатор не изменяет цвет. Таким образом, признаком размножения вирусов в клетках культуры является сохранение красного цвета среды.

Папиллярные узоры пальцев рук - маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

[youtube.player]

Риккетсии - облигатные внутриклеточные паразиты. Для их культивирования используют культуры клеток, куриный эмбрион и заражение животных.

Культивирование риккетсий проводят на переживающих тканях в жидкой среде Мейтлендов (раствор Тироде и сыворотка) при 37° С 10-14 дней или на Тироде-сывороточном агаре с добавлением на поверхность измельченной эпителиальной ткани при 37° С 6-10 дней.

Широко используется культивирование в 8-12-дневном курином эмбрионе.

Риккетсии культивируют в организме белых мышей, которых заражают интраназально. В легких мышей накапливается большое количество риккетсий.

Риккетсии выращивают по методу Вейгля и Мосинга. Для этого платяных вшей заражают взвесью риккетсий путем введения в кишку через анальное отверстие с помощью специальных капилляров. Пшеничнов и Райхер разработали метод культивирования риккетсий на личинках вшей, которых кормят дефибринированной кровью с риккетсиями через мембрану кожи трупа.

Микоплазмы культивируются на питательных средах с добавлением сыворотки и углеводов. Поскольку микоплазмы лишены клеточной стенки, они растут только в изотонических или гипертонических средах. На плотных питательных средах в течение нескольких суток образуются очень мелкие колонии, напоминающие яичницу-глазунью - с выпуклым центром и плоской полупрозрачной периферией. Микоплазмы можно выращивать также на курином эмбрионе или культуре клеток.

Хламидии, являясь облигатными паразитами, на искусственных питательных средах не размножаются, их можно культивировать только в живых клетках. Они являются энергетическими паразитами, так как не способны самостоятельно аккумулировать энергию и используют АТФ клетки-хозяина. Культивируют хламидий в культуре клеток HeLa, McCoy, в желточных мешках куриных эмбрионов, организме чувствительных животных при температуре 35 °С.

Культивирование вирусов.

Перед культивированием материал больного (кроме крови и ликвора) центрифугируется (2000 оборотов в течение 10 мин). Берут надосадочную жидкость и обрабатывают антибиотиком широкого спектра действия (пенициллин) 500 тыс. ЕД на 1,0 мл. исследуемого материала для подавления бактериальной флоры.

Культура клеток – это клетки, которые способные жить в пробирках на искусственных питательных средах (среда 199).

Разновидности культур клеток:

Название	Сущность	Примеры
1. первично-трипсинизированные	Получают из эмбриональной ткани	Первично-трипсинизированные
2. перевиваемые	Получают из опухолевых клеток	Hela, D-6, Hep-2
3. полуперевиваемые	Имеют двойной набор хромосом	фибробласты

На куриных эмбрионах .

Заражают 7-10 дневные куриные эмбрионы с учетом тропизма:

Тропизм	способ заражения
1. дермотропные	ХАО
2. респираторные	Амнион
3. нейротропные	Желточный мешок
4. энтеровирусы	Не культивируются

На лабораторных животных.

Культивирование проводят на мышах сосунках (до 2-х дней жизни), лабораторных крысах, морских свинках, кроликах. Заражают в зависимости от тропизма вируса:

Тропизм	способ заражения
1. дермотропные	н\к, п\к, в\к
2. респираторные	интронозально
3. нейротропные	интроцеребрально
4. энтеровирусы	внутрибрюшинно

Современные принципы классификации и номенклатура вирусов.

В силу своих особенностей вирусы выделены в отдельныq порядок Viridales.

Порядок делится на семейства, которые подразделяются на подсемейства и роды. Вид – совокупность вирусов, имеющих почти идентичные геном (ДНК или РНК), свойства и способность вызывать определенный патологический процесс. Названия семейства имеют окончание viridae, подсемейство – virinae, рода – virus.

Признаки, используемые для классификации вирусов:

1) тип нуклеиновой кислоты – ДНК или РНК;

2) их структура (однонитевая, двунитевая, линейная, кольцевая, фрагментированная, нефрагментированная с повторяющимися и инвертированными последовательностями);

3) структура, размеры, тип симметрии, число капсомеров;

4) наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида);

5) антигенная структура;

6) феномены генетических взаимодействий;

7) круг восприимчивых хозяев;

8) географическое распространение;

9) внутриядерная или цитоплазматическая локализация;

10) чувствительность к эфиру и детергентам;

11) путь передачи инфекции.

Современная классификация ICTV (2015 года) включает 7 порядков вирусов: Caudovirales, Herpesvirales, Ligamenvirales, Mononegavirales, Nidovirales, Picornavirales и Tymovirales. Существование восьмого порядка (Megavirales) пока ещё было только предположено. Классификация не выделяет подвиды, штаммы и изоляты. Всего насчитывается 7 порядков, 109 семейств, 27 подсемейств, 601 род, 3672 вида и свыше 3000 ещё неклассифицированных вирусов.

Классификация вирусов по Балтимору — классификация вирусов в группы в зависимости от типа геномной нуклеиновой кислоты (ДНК, РНК, одноцепочечная, двуцепочечная) и способа её репликации.

Класс I: вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК

Класс II: вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК

[youtube.player]

Микоплазмы- мелкие прокариоты, нет КС, только ЦПМ, не способны к синтезу пептидогликана неподвижны, Гр-, могут расти на синтет.пит.ср., больш-во факультотивные анаэробы, образуют колонии в виде яичной глазуньи. Микоплазмы пневмонии: патогенны для человека M.pneumoniae, (а у/п явл-ся M.hominis, fermentans, orale, arthritidis и др). клетка окружены 3-х слойной мембраной, для роста нужд-ся в стеролах, на твердых средах определенного состава образует колонии в виде яичницы, хемоорганотрофы, в качестве источника Е использует глюкозу или аргинин Ag: видоспец.

Хламидии- размножаются только в/и связан с мембрной вакуолей в ЦП клеток. Кс не содерж мурамовую к-ту. Культ-ют в желточном мешке куриных эмбрионов и в культуре клеток. Сферические клетки, Гр-.

Риккетсии-Это палочковидные или кокковидные, Гр-, неподвижные, в клетке образуют капсулу. Не растут на искуственых средах, культивируется в желточном мешке куриного эмбриона, разм-ся бинарно.

2. Биопрепараты, используемые для специфической профилактики и терапии инфекционных заболеваний: вакцины.

Вакцины – взвесь бактерий или микроо-мов или компонентов, искуственный активный им-т. 1) живая 2) инактивир. – корпускуляр. 3) искуственая 4) рекомбинант. – генно-инженер. 5) убитые 6) ассоциирован. Для профилактики.

Живые вакцины – невирулентные, но иммуногенные штаммы, размнажаются в организме, получаются при хим., физич. обработкой, долгим культивированием. Преимущ.: создают напряженный им-т, однократное введение. Недостки: сложно хранить, нельзя с дезинфицирующеми средствами, побочное действия. Для профилактики вирусов и бактерий. (грипп, корь, паротит)

Неживые вакцины – корпускуляр. (типич. штаммы, инактивир. физико-хим. фак-торами) – брюшнотифоз., холер. Хим. (иммуноген. компоненты бактерий, извлечен. хим. методами, - Аг защитные без балластных б-ков) – Тавte-тиф, паратиф, столбняк.

Искус. вакцины – Аг-детерминанты, соед. с полимерами. Липосомаль. вакцины – Аг в составе липосом, прикрепл. к иммунокомпетент. кл. Субединич. вакцины – наиб. иммуноген. Аг. Генно-инж. (рекомбинант.) – ген синтеза протективного Аг вводят в кл. б., идет синтез Аг à выработка Ат. Ассоциирован. вакцины – неск. Аг (Таbte – Аг адсорбированы на Al(OH)₃).

Клостридии ботулизма, таксономия, характеристика биологических свойств микроба, факторы патогенности, механизм их действия. Эпидемиология и патогенез ботулизма, лабораторная диагностика. Специфическая профилактика и терапия ботулизма.

разные размеры, перитрихи, споры-тенниснисная ракетка, капсулы нет, размн-ся на сах-кров агаре, прозрачные колонии с зоной гемолиза, на жидких средах-помутнение и осадок. Сах,протеолит-нет. антиген:специфичностьтоксинов-сероварыА,В,С. Токсины- сильный яд. Экзотоксин явл-ся нейротоксином: Сост из 2 субъединиц блок-ся передача нерв.импульса ч/з синапсы, пораж-ся бульбарные нервные центры -нарушается походка, зрения, летальность до 60%. При попадании на рану-ботулизм ран. Вегетативн кл. продуцируют нейротоксин-картина пищевых интоксикации. Им-т отсутствует. Естные среды обитания-киш-крупных травоядных. Фекалии попадают в почву, воду – заражают, алиментарным путем (устойч к высокой температура). Диагн-ка: выдел-е возб-ля и опред-е налич-я токсина в иссл. материале, обяз. опред-ют серовар токсина..Для обнаруж токсина-биопробы-на мышах.Проф нет,Леч-е: противоботул. сыв поливалентная (к разн токс),с целью позд проф, подозреваемым в употр зараж продуктов

Дата добавления: 2015-04-18 ; просмотров: 23 ; Нарушение авторских прав

[youtube.player]

мелкие сферические или овоидные клетки размером 0,2 мкм (элементарные тельца) которые фильтруются через бактериальные фильтры;
более крупные шаровидные, размером до 1,5 мкм;
нитевидные, ветвящиеся клетки размером до 150 мкм.

Микоплазмы не образуют спор, жгутиков, некоторые виды обладают скользящей подвижностью.
Размножаются путем бинарного деления шаровидных и нитевидных клеток, почкования и высвобождения множества элементарных телец, образующихся в нитях.

Большинство микоплазм являются безвредными комменсалами слизистых оболочек глаз, дыхательных, пищеварительных и мочеполовых путей человека.
В патологии человека наибольшую роль играют несколько представителей рода Mycoplasma : M . pneumoniae , M . hominis , M . anthritidis и единственный вид рода Ureaplasma - U . urealyticum (названный так из-за уреазной активности). Патогенные микоплазмы вызывают заболевания (микоплазмозы) дыхательных, мочеполовых путей и суставов с разнообразными клиническими проявлениями. При лечении этих заболеваний следует помнить, что микоплазмы не чувствительны к бета-лактамным антибиотикам и другим лекарственным препаратам, угнетающим синтез клеточной стенки (из-за ее отсутствия у возбудителя).
Методы исследования . В световом микроскопе обнаруживаются лишь самые крупные формы микоплазм. В живом состоянии их изучают в темнопольном и фазово-контрастном микроскопе, ультраструктурные компоненты выявляют при помощи электронной микроскопии.

Риккетсии- мелкие (0,35-1.0 мкм) грамотрицательные, полиморфные бактерии, являющиеся облигатными внутриклеточными паразитами.
Риккетсии разнообразны по форме и выделяют следующие типы:

кокковидные однозернистые (до 0,5 мкм);
палочковидные двухзернистые (1-1,5 мкм);
бациллярные трех-четырехзернистые (3-4 мкм);
нитевидные многозернистые (10-40 мкм).

Тонкие фиксированные мазки окрашиваются водным карболфуксином (из расчета 10 капель карболового фуксина Циля на 10 мл фосфатного буфера рН - 7,4) в течение 5 мин.
Мазок промывают водой и обрабатывают 0,5% раствором лимонной кислоты (1-3 сек).
Хорошо промывают водой и докрашивают 10 сек, 0,5% водным раствором метиленового синего.
Промывают водой и высушивают.

Риккетсии окрашиваются в рубиново-красный цвет и легко обнаруживаются на фоне голубой цитоплазмы и синего ядра клеток.

Хламидии- неподвижные, облигатно паразитические, кокковидные бактерии. Размножаются только внутри связанных с мембраной вакуолей в цитоплазме клеток человека, млекопитающих, птиц. Членистоногие не служат хозяевами или переносчиками. Размножение происходит в ходе уникального цикла развития. Основными стадиями жизненного цикла хламидий являются:

Международная классификация и характеристика ферментов бактерий. Методы определения гликолитических и протеолитических ферментов бактерий. Идентификация бактерий по ферментативной активности.

Питание микроорганизмов осуществляется благодаря наличию в клетке различных ферментов, катализирующих все жизненно необходимые реакции. Ферменты - это биологические катализаторы белковой природы. Микробная клетка, подобно клеткам высших организмов, оснащена достаточно активным ферментативным аппаратом. Ферменты микроорганизмов обладают теми же свойствами и функциями, что и ферменты высших организмов. В соответствии с катализирующими реакциями все ферменты разделяют на шесть классов:

Оксидоредуктазы - катализируют реакции окисления-восстановления.
Трансферазы - катализируют реакции переноса различных групп от донора к акцептору.
Гидролазы - катализируют разрыв связей в субстратах с присоединением воды.
Лиазы - катализируют реакции разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления.
Изомеразы - катализируют превращения в пределах одной молекулы (внутримолекулярные перестройки).
Лигазы ( синтетазы ) - катализируют присоединение двух молекул с использованием энергии фосфатных связей.

Несмотря на малые размеры микробной клетки, распределение в ней ферментов строго упорядоченно. Ферменты энергетического обмена и транспорта питательных веществ локализованы в цитоплазматической мембране и ее производных. Ферменты белкового синтеза связаны с рибосомами. Многие ферменты не связаны с определенными структурами клетки, а находятся в цитоплазме в растворенном виде.
Ферменты бактерий подразделяются на экз о- и эндоферменты . Эндоферменты функционируют только внутри клетки. Они катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена. Экзоферменты выделяются клеткой в среду и катализируют реакции гидролиза сложных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции микробной клеткой. К ним относятся гидролитические ферменты, играющие исключительно важную роль в питании микроорганизмов.
В зависимости от условий образования ферментов их разделяют на конститутивные и индуцибельные . Конститутивными называют ферменты, синтезируемые клеткой вне зависимости от субстрата, на котором развиваются бактерии. Например, ферменты гликолиза. Индуцибельные ферменты синтезируются только в ответ на присутствие в среде необходимого для клетки субстрата-индуктора. Он взаимодействует с репрессором, инактивирует его, в результате чего включается генетический аппарат клетки и начинается синтез соответствующего фермента. Индуцированный синтез ферментов идет, пока в среде присутствует индуктор. При этом ферменты синтезируются заново во всех клетках одновременно. Индукторами биосинтеза являются многие питательные вещества. К индуцибельным относится большинство гидролитических ферментов.

Известны также ферменты, которые получили название аллостерических . Кроме активного центра у них имеется регуляторный или аллостерический центр, который в молекуле фермента пространственно разделен с активным центром. Аллостерическим (от греч. allos - иной, чужой) он называется потому, что молекулы, связывающиеся с этим центром, по строению ( стерически ) не похожи на субстрат, но оказывают влияние на связывание и превращение субстрата в активном центре, изменяя его конфигурацию. Молекула фермента может иметь несколько аллостерических центров. Вещества, связывающиеся с аллостерическим центром, называют аллостерическими эффекторами. Они влияют через аллостерический центр на функцию активного центра: или облегчают ее, или затрудняют. Соответственно аллостерические эффекторы называются положительными (активаторы) или отрицательными (ингибиторы). Аллостерические ферменты играют важную роль в тонкой регуляции метаболизма бактерий. Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций.
Некоторые ферменты, так называемые ферменты агрессии, разрушают ткани и клетки макроорганизма , обуславливая тем самым распространение патогенных микроорганизмов и их токсинов в инфицированных тканях. К таким ферментам относятся плазмокоагулаза , нейраминидаза, коллагеназа , лецитиназа , гиалуронидаза и некоторые другие ферменты. Гиалуронидаза стрептококков, например, расщепляет гиалуроновую кислоту в мембранах клеток соединительных тканей макроорганизма , что способствует распространению возбудителей и их токсинов в организме, обуславливая высокую инвазивность этих бактерий.
Плазмокоагулаза является главным фактором патогенности стафилококков, так как участвует в превращении протромбина в тромбин, который вызывает образование фибриногена, в результате чего каждая бактерия покрывается пленкой, предохраняющей ее от фагоцитоза. Ферменты микроорганизмов, такие как лигазы и рестриктазы , нашли широкое применение в биотехнологии, в том числе в генетической инженерии , для получения различных биологически активных веществ, гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, а также ряда продуктов в легкой и пищевой промышленности.
Ферменты микроорганизмов характеризуют их биологические свойства и поэтому их исследуют с целью идентификации бактерий. В зависимости от субстрата гидролитические ферменты принято делить на две большие группы:

гидролитические или сахаролитические ферменты, субстратом для которых являются различные сахара, а продуктами их расщепления - кислоты, спирты, альдегиды, Н₂О и СО₂ ;
протеолитические ферменты, расщепляющие белки с образованием полипептидов, аминокислот, аммиака, индола, сероводорода.

Дата публикования: 2015-11-01 ; Прочитано: 10724 | Нарушение авторского права страницы

studopedia.org - Студопедия.Орг - 2014-2020 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.002 с) .

[youtube.player]

Изобретение касается специфической профилактики и терапии хламидиоза (орнитоза) птиц. Вакцина содержит в качестве антигена штамм Chlamydia psittaci var. avis "ДЖ-87" ВГНКИ 23-ДЕП, выращенный на монослое первичной культуры кле-ток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) с титром не ниже 10 -7,0 ТЦД_50/мл.. Вакцина также содержит инактиватор-фенол и адъювант - поливинилпирролидон. Вакцина специфична, высокоиммуногенна и имеет низкую реактивность. 6 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, в частности к производству вакцин, применяемых для специфической профилактики и терапии сельскохозяйственных животных, например птиц от заболевания хламидиозом.

Известна вакцина против энзоотического аборта овец инактивированная изготовленная из зараженных хламидиями куриных эмбрионов (Franc et al. Am. J. Vet. Pec. , Vol. 29, p. 1441, 1968). Недостатком данной вакцины являются ее высокая стоимость, ее изготовление требует больших затрат времени, высокое содержание баластных белков, снижающее ее иммуногенность и повышающее реактогенность. Эта вакцина не содержит специфического антигена и поэтому неиммуногенна для птиц. Данная вакцина выбрана нами в качестве прототипа.

Наиболее близким по технической сущности является патент США N 4386065 A 61 K 39/118, 1983. "Вакцина против энзоотического аборта овец", которая включает в себя смеси водной суспензии, инактивированных формалином хламидийных элементарных телец, полученных из организмов chlamydia SP в пределах от 2 10 6 до 10 9 ELD _50/мл, размноженных в клеточной культуре и равного количества масляного адъюванта представляющего собой смесь светлого минерального масла и ланолина.

Недостатком этой вакцины является то, что штамм хламидий, как продуцент, не обладает цитопатическим действием. Вследствие этого для контроля накопления хламидий необходимо ежедневно готовить мазки, производить их окраску и подсчет зараженных клеток, а при сборе сырья требуется инфицированный монослой отделить от ростовой поверхности с помощью трипсина с верстном. Для создания нужной концентрации хламидий в вакцине культуральную суспензию подвергают центрифугированию. К тому же один стационарный монослой используется как посевной материал только для пяти чистых монослоев или их эквивалентов. Все эти операции усложняют технологический процесс производства и снижают производительность при изготовлении вакцины, что делает ее дороже. К тому же вакцина профилактирует только энзоотические аборты хламидиозной природы у овец и не профилактирует хламидиоз птиц.

Поставленная задача достигнута благодаря тому, что вакцина культуральная инактивированная против хламидиоза (орнитоза) птиц в качестве антигена, содержит штамм CHLAMYDIA PSITTACI (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, выращенный на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур с титром не ниже 10 -7 ТЦД_50/мл,в качестве адъюванта - поливинилпирролидон, а также фенол при следующих процентных соотношениях: 1. Суспензия клеток ФЭК (фибробластов эмбрионов кур), инфицированных хламидиями штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП с титром не ниже 10 -7,0 ТЦД_50/мл - 99-99,5.

3. Полифинилпирролидон - 0,4-0,6.

Существенным отличием данной вакцины от ее прототипа является то, что в качестве антигена берут штамм chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87", депонированный в коллекцию ВГНКИ ветпрепаратов, N 23 ДЭП. Выращивание его ведется на монослое первичной культуры ФЭК.

Штамм chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23 - ДЭП выделен в 1987 году из печени и селезенки больного орнитозом индюшонка птицефабрики "Мрзытайская" Джамбулской области. Выделение производилось на развивающихся 6-7-дневных куриных эмбрионах путем их заражения в полость желточного мешка. Затем штамм был адаптирован к первичной культуре клеток ФЭК. Штамм прошел 52 пассажа в культуре клеток ФЭК в условиях роллера и в результате приобрел способность оказывать высокое цитопатогенное действие на монослой культуры клеток ФЭК. Наряду с этим устойчиво повысилась его иммуногенная активность и снизилась реактогенность.

Штамм chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП входит в коллекцию ВГНКИ ветпрепаратов и хранится в музее живых культур СКЗНИВИ.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. Элементарные (зрелые) тельца хламидий округлой формы, диаметром 180 - 200 нм, (инициальные-промежуточные формы - до 500 - 600 нм) окрашиваются по методу Романовского-Гимза в темно-синий цвет. При окраске акредином оранжевым хламидии приобретают оранжевый и желто-зеленый цвет. Расположены хламидии в цитоплазме клеток и в межклеточном пространстве в виде одиночных форм или скоплений.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА. Хламидии культивируются в желточных оболочках 6-7 дневных куриных эмбрионов. Штамм "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП адаптирован к культуре клеток ФЭК, вызывает образование цитоплазматических включений через 48 часов культивирования, проявляет цитопатическое действие.

ПАТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Штамм патогенен для индюшат, морских свинок и белых мышей - вызывает у них заболевание и гибель. В мазках-отпечатках из органов (печень, селезенка, мозг) павших и больных животных обнаружены цитоплазматические включения и элементарные частицы хламидий при парентеральном (для птиц), интраназальном, внутрибрюшинном, внутримозговом (для мышей) и внутрибрюшинном (для морских свинок) заражении.

АДАПТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Штамм chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП - возбудитель хламидиоза (орнитоза) птиц адаптирован к 6-7 дневным куриным эмбрионам и культуре клеток ФЭК, при этом сохраняет патогенность и иммуногенность. Титр хламидий выращенных на куриных эмбрионах составляет 10 -6 - 10 -7 ЭЛД_50/0,3_мл на культуре клеток ФЭК - 10 -7 - 10 -8 ТЦД_50/мл.

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА. В постановке перекрестной реакции связывания комплемента (РСК) с гомологичным антигенами установлено высокое антигенное родство к гомологичному антигену в титре 1:80 - 1:160. Антигенное родство к другим антигенам хламидий стоит на четыре разведения дальше.

ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. Согласно решению Юридической комиссии Международной Ассоциации Микробиологических обществ (МАМО), с 1 января 1980 года определение рассматриваемых микроорганизмов, как Chlamydia, стало обязательным. В соответствии с "The Shorter Bergey's manual of determinative" (1980), хламидии отнесены к царств Procaryotae, отделу 2 прокариотов, индифферентных к свету, т.е. "скотобактериям", классу 2 Rickettsia. В класс Rickettsia включены порядки 1 Rickettsiales и 2 Chlamydiales. Семейство Chlamydia, род Chlamydia, в который включает четыре вида: Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia pecorum. Все виды хламидий гетерогенны.

ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. В опыт было взято 48 индюшат 3-недельного возраста весом 250-300 граммов. 24 индюшонка было завакцинировано культуральной инактивированной вакциной, изготовленной из штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, подкожно в дозе 0,5 мл. Остальные 24 индюшонка составило контрольную (не вакцинированную группу.

Через 14 дней после введения вакцины приготовленной из подтитрованного контрольного штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП с титром 10 -7,0 ТЦД_50/мл заразили 12 опытных и 12 контрольных индюшат подкожно в дозе 1 мл. Затем, через 20 дней после введения вакцины, также заразили 12 вакцинированных и 12 не вакцинированных индюшат. Результаты представлены в табл. 1.

Примечание в графах 4,5 числитель обозначает число павших индюшат, знаменатель - число выживших.

Таким образом, как видно из описания и таблицы, штамм chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП специфичен по отношению к птицам и обладает высокими иммуногенными свойствами, что позволяет осуществить поставленную задачу.

Вторым существенным отличием является то, что в качестве адъюванта в вакцину вводят поливинилпирролидон (ПВП). Поливинилпиролидон-белый порошок, хорошо растворимый в воде, применяется как пролонгатор лекарственных средств. Ему присуще дезинтоксическое и противовоспалительное действие. В нашем препарате ПВП существенно повышает иммуногенность вакцины за счет того, что связывает (адсорбирует) антипенные белки.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав вакцины отличается от известного введением новых компонентов, а именно нового штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП с титром не менее 10 -7,0 ТЦД_50/мл и поливинилпирролидона в качестве адъюванта, а также соотношением компонентов.

Таким образом, заявляемое технологическое решение является новым. Введение в качестве адъюванта поливинилпирролидона существенно повышает иммуногенноть вакцины. По сравнению с вакциной, содержащей в качестве адъюванта вазелиновое масло. Для доказательства был проведен следующий опыт восьми голубят вводилась культуральная инактивированная вакцина, изготовленная из штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, содержащая в качестве адъюванта вазелиновое масло, и восьми - вакцина, содержащая в качестве адъюванта поливинилпирролидон. Вакцина вводилась подкожно, трехкратно с интервалом 7 дней в дозе 0,2 мл. Иммуногенность вакцины оценивалась по результатам РСК (с сывороткой крови опытных голубей, взятой через 20 дней после последнего введения вакцины). Результаты представлены в таблице 2.

Из таблицы следует, что иммуногенность вакцины с поливинилпирролидоном, используемым в качестве адъюванта, значительно выше, чем вакцины с вазелиновым маслом использованным в качестве адъюванта.

Таким образом, данный состав компонентов придает вакцине новые свойства, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технологического решения критерию "изобретательский уровень".

Пример 1. (Оптимальный вариант).

Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями производили по общепринятой методике (Л.П.Дьяконов и др. Культивирование клеток и тканей животных. Часть 1, Ставрополь, 1986). Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, подвергали контрольным высевам на бактериальную и грибковую контаминацию. После этого чистую, не контаминированную, суспензию брали для определения титра ТЦД_50/мл. Титр определяли по общепринятой методике и подсчитывали по методу Рида и Менча. В данном примере он равен 10 -7,0 ТЦД_50/мл.

Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями - 99,1%, фенол - 0,35 мас.%, поливинилпирролидона - 0,55 мас.%. Полученную смесь выдерживали в течение 96 часов при температуре +10 o C.

Далее проводили выборочный контроль на иммуногенность. Для этого брали восемь голубей и вводили им вакцину по следующей схеме: 1-е введение - подкожно 0,2 мл; 2-е введение - подкожно через 7 суток 0,2 мл; 3-е введение - подкожно через 14 суток 0,2 мл.

Контролем служили четыре голубя, которым вакцина не вводилась. Через три недели после последнего введения вакцины определяли уровень накопления антител в сыворотке крови голубей в реакции связывания комплемента (РСК). Результат: четыре креста в разведении 1:5, четыре - в разведении 1:10, два - в разведении 1:20.

Аналогично делали для титра 7,5; 7,75; 6,5; 6,0; 5,5 ТЦД_50/мл. Сведения приведены в табл. 3.

Таким образом, титр хламидийного штамма от 7,0 и ниже обеспечивает высокое накопление антител в сыворотке крови голубей. Вакцина с качествами, приведенными в примерах 1, 4, 5, считается пригодной для применения на птице. В целях экономии штаммного материала при получении титра выше 7,8 ТЦД_50/мл суспензия разводится питательной средой ГЛА до титра, приведенного в примерах 1, 4, 5. Титр штамма ниже 6,5 ТЦД_50/мл (пр.6) не обеспечивает нужного накопления хламидий ниже применяется для иммунизации птиц.

В данном опыте отчетливо видна зависимость титра антител в сыворотке крови голубей от титра штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП. Этот тест взят нами в качестве контроля иммуногенности вакцины при ее изготовлении.

Пример N 7. Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями, выращивание и накопление их производили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК инфицированных хламидиями штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию и одновременно определяли усредненный титр ТЦД_50/мл, который в данном примере равен 10 -7,2 ТЦД_50/мл. Чистую, неконтаминированную бактериальной и грибковой флорой клеточную хламидийную суспензию, объединяли в общую стерильную емкость и проводили инактивацию хламидий фенолом. Для этого в емкости смешивали компоненты в следующем соотношении: суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями, брали 99,2 мас. %, а инактиватор (фенола) добавляли 0,4 мас.%. Полученную смесь выдерживали в течение 98 часов при температуре +10 o C. Затем добавляли 0,4 мас. % адъюванта (поливинилпирролидона). Затем проводили выборочный контроль на полноту инактивации. Для этого 10 развивающимся куриным эмбрионам 7-суточной инкубации стерильно вводили в полость желточного мешка 0,3 мл вакцины и инкубировали их при 37,0-37,5 o в течение 12 суток. В качестве контроля использовали 10 эмбрионов, которым вводили не инактивированную клеточную взвесь, содержащую хламидий штамма "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП. Условия инкубации такие же. Опытные эмбрионы оставались живыми в течение 12 суток. В мазках-отпечатках, изготовленных из оболочек желточного мешка, окрашенных по методу Романовского-Гимза, хламидии не обнаруживались. Контрольные эмбрионы пали на 5-7 сутки. Этот результат соответствует установленному контролю вакцины на полноту инактивации.

Аналогично делали для следующих количеств фенола: 0,3 мас.%; 0,2 мас.%; 0,5 мас.%; 0,6 мас.%. Результаты приведены в таблице 4.

Исходя из данных приведенных в таблице, видно, что количество инактиватора в интервале от 0,3 мас.% до 0,5 мас.% обеспечивает полноту инактивации хламидий в суспензии. Свыше 0,5 мас.% фенол не добавляют с целью его экономии, т.к. качества вакцины этого не улучшает. Концентрацию инактиватора ниже 0,3 мас. % не допускают, т.к. это не обеспечивает полной инактивации хламидий.

Пример N 12. Приготовление культуры ФЭК, заражение ее хламидиями, их выращивание и накопление производили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма chlamydia psittasi (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию. Если тест оказывался отрицательным, то выборочно определяли титр ТЦД_50/мл, который в этом примере равен 7,3 ТЦД_50/мл. Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях: суспензия клеток, инфицированных хламидиями, брали 99,3 мас.%, фенола-0,3 мас.% (смесь выдерживали 10 часов при -6 o C). Поливинилпирролидона вводили 0,4 мас.%. Процесс вели следующим образом: навеску адъюванта и инактивированную суспензию клеток содержащую антиген штамм хламидий "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП и составляли при комнатной температуре до его полного растворения - 24 часа. Затем проводили контроль на иммуногенность, так же как в примере N1. Результат следующий: в разведении 1:5 - ++++; в разведении 1:10 - ++++; в разведении 1: 20 - ++. Аналогично делали для 0,3 мас.%. Результаты приведены в таблице 5.

Как указано в таблице содержание адъюванта в интервале значений от 0,4 мас. % до 0,6 мас. % обеспечивает иммуногенность вакцины в соответствии с установленным контролем. Количество адъюванта, превышающее 0,6 мас.%, не применяется с целью его экономии. Существенного улучшения качества вакцины при увеличении содержания в ней адъюванта свыше 0,6 мас.% не происходит.

Содержание адъюванта ниже 0,4 мас.% не допускается, т.к. иммуногенность такой вакцины ниже установленного контроля вакцины и она не вызывает надежного иммунного ответа у птицы.

Пример 17. Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями их выращивание и накопление производили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма chlamydia psittasi (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию. При отрицательном результате теста определяли средней титр ТЦД_50/мл, который в этом примере равен 7,4 ТЦД_50/мл. Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях: суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями, брали 99,25 мас.%; фенола - 0,35 мас.%, поливинилпирролидона - 0,4 мас.%. Затем проводили контроль на иммуногенность как в примере 1. Результаты РСК следующие: в разведении 1:5 - ++++; в разведении 1: 10 - ++++; в разведении 1:20 - +++. Аналогично делали для 99 мас.%; 98 мас. %; 99,5 мас.%; 99,7 мас.% суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП. Результат представлен в таблице 6.

Как указано в таблице, содержание суспензии клеток ФЭК инфицированных хламидиями штамма "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП в пределах от 99,0 мас.% до 99,5 мас. %, обеспечивает иммуногенность вакцины в соответствии с ее контролем. Количество культуральной клеточной суспензии выше 99,5 мас.% не применяется, т.к. это не улучшает качество вакцины, а увеличивает расход ее дорогостоящих компонентов. Использование культуральной клеточной суспензии в количестве ниже 99,0 мас.% также не допускается, т.к. вакцина при этом не обладает иммуногенностью, соответствующей установленному контролю вакцины и не вызывает развитие надежного иммунитета у птицы.

Вакцина профилактирует возникновение у птиц на почве хламидиоза: пневмонии, артрита, аэросаккулита. Повышает процесс выводимости птенцов на 10-12%, увеличивает сохранность молодняка на 18-24%. Увеличивается яйценоскость, возрастают привесы. Кроме того, вакцина сокращает загрязнение окружающей среды хламидиями, являющимися антропозоонозами, а также снижает затраты неблагополучного хозяйства на проведение малоэффективных лечебно-профилактических мероприятий с применением антибиотиков и других лечебных средств. Вакцина безвредна. В целом эффективность вакцины составляет 90-93%.

Источники информации 1. Л.П.Дьяконов, В.Ф.Глухов и др. Культивирование клеток и тканей животных. Учебно-методическое пособие (часть 1), Ставрополь, 1986 г.

2. Описание к патенту США N 4386065 МКИ A 61 K 39/, 1983.

3. А.с. N 645369 з. N 2528058 МКИ C 12 K 5/00.

4. А.с. N 660390 з. N 2528670 МКИ C 12 K 5/00.

5. А.с. N 661017 з. N 2528672 МКИ C 12 K 5/00.

6. А.с. N 666203 з. N 2528672 МКИ C 12 K 5/00.

7. А.с. N 666202 з. N 2528669 МКИ C 12 K 5/00.

8. А.с. N 655160 з. N 2528668 МКИ C 12 K 5/00.

Вакцина культуральная инактивированная против хламидиоза (орнитоза) птиц, содержащая антиген хламидий, адъювант и инактиватор, отличающаяся тем, что в качестве антигена она содержит штамм Chlamydia psittaci var, avis "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП, выращенный на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур с титром не ниже 10 -7,0 ТЦД_50/мл, в качестве адъюванта - поливинилпирролидон, а в качестве инактиватора - фенол при следующем соотношении их, мас.%: Суспензия клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci var, avis "ДЖ-87" ВГНКИ N 23-ДЭП с титром не ниже 10 -7,0 ТЦД_50/мл - 99,0 - 99,5 Фенол - 0,3 - 0,5 Поливинилпирролидон - 0,4 - 0,6п

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6

[youtube.player]

Читайте также: