Среда для выделения возбудителей инфекций

Для обнаружения возбудителя в материалеот больного применяют следующие методы:

- микроскопические (бактериоскопические, микоскопические, вирусоскопические, направленные соответственно на выявление в исследуемом материале от больного бактерий, грибов, вирусов);

- микробиологические (бактериологические, микологичес­кие, вирусологические), предполагающие выделение чистой культуры микроорганизма;

Микроскопические методы используют для обнаружения возбудителей (бактерий, грибов, простейших, вирусов) в окрашенных мазках или в нативных пре­паратах из исследуемого мате­риала с помощью световой микроскопии. Достоинства этого метода состоят в быстроте, про­стоте и невысокой стоимости, недостатки - в невозможности определения вида микроорганизмов и невысокой чувствительности (не менее 10 6 микробных клеток в 1 мл или 1 г исследуемого материала).

Микроскопический метод имеет, как правило, ори­ентировочное значение. При некоторых инфекциях (например, при гонорее, микозах и заболеваниях, вызванных простейшими) диагностическая ценность микроскопического исследования высокая, являясь основанием для поста­новки окончательного диагноза заболевания.

Вирусоскопические исследования имеют ограничения, связанные с необходимостью использования дорогостоящего прибора - электронного микроскопа. Для диагностики вирусных инфекций могут применяться цитологичес­кие методы, выявляющие внутриклеточные включе­ния в зараженных клетках (например, телец Бабеша-Негри при бешенстве, телец Пашена и Гварниери при оспе или цитомегалических клеток при заболе­ваниях, вызванных цитомегаловирусом).

Для эпидемиологического анализа вспышек инфекционных заболеваний проводят типирование культур возбудителей, вы­деленных от разных больных и носителей патогенных микробов, а также из внешних объектов, являющихся возможными источниками инфицирования (вода, пищевые продукты и т.д.) с целью определения их биовара, хемовара, серовара, фаговара и т.д.

Микологические исследования с целью выделения чистых культур грибов выполняются при диагностике ряда микозов (кандидозы, глубокие микозы и т.д.).

Биологические методы (биопробы)направлены на выделение микроорганизма или на обнаружение его токсинов путем заражения чувствительных лабораторных животных материалом, по­лученным от больного. Этот метод используют для выделения чистой культуры возбудителя в тех случаях, когда микроорга­низмы не растут или плохо культивируются на питательных средах, для дифференциации патогенных микробов или для определения их вирулентности. В настоящее время применение биопроб ограничено из-за соображений гуманности, финансовых трудностей, существованием повышенного риска заражения персонала лаборатории и в ряде случаев – длительностью выполнения биопробы, а также неспособностью современных штаммов микроорганизмов воспроизводить типичную инфекцию у чувствительного лабораторного животного. Наиболее часто биопробу применяют для выделения чистых культур возбудителей зоонозных инфекций (например, туляремии), а также для обнаружения ботулинистического токсина.

Иммунохимические методы диагностики возбудителя или его антигенов в материале от больного

Метод иммунофлюоресценции (ИФ)позволяетобнаружить в материале от больного или в зараженных вирусом клетках антигены бактерий и вирусов с по­мощью специфических антител, меченных флюорохромами.

Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ).Сущность метода заключается в том, что исследуемый материал, содержащий вирусы, обрабатывают специфическими антителами, образовавшиеся иммунные комплексы осаждают высокоскоростным центрифугированием, а затем вирусы в составе иммунных комплексов выявляют с помощью электронной микроскопии. ИЭМ позволяет зна­чительно повысить чувствительность и специфичность вирусоскопического метода. Разработаны твердофазные методы ИЭМ, сущность которых состоит в предварительной фиксации специфических антител (немеченных или меченных частицами золота) на сетках для электронной микроскопии с последующей обработкой сеток исследуемым вируссодержащим материалом и выявлением связанных антителами вирионов с помощью электронной микроскопии.

Другие серологические реакции(РИФ, ИФА, РИА, РНГА, РП) также могут применяться для обнаружения антигенов бактерий и вирусов в материалах от больного.

Биохимические и молекулярно-биологические методы диа­гностики

Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) используют для обнаружения продуктов метаболизма микроорганизмов (летучих жирных кислот, спиртов, нелетучих органических кислот и т.д.) в исследуемом материале.

Методы генодиагностики. Специфические фрагменты ну­клеиновых кислот (НК) различных возбудителей можно обнаружить в исследуемом материале от больного с помощью методов гиб­ридизации нуклеиновых кислот (ДНК-зондов) или чаще - ПЦР, которая широко используется как высокочувствительный экспресс-метод для постановки предварительного диагноза при различных инфекциях. Ограничения ПЦР могут быть обусловлены высокой изменчивостью НК некоторых микроорганизмов, а также неадекватным подбором праймеров для реакции, что обеспечивает ложноотрицательные результаты, или же загрязнением реакционной смеси микроорганизмами или фрагментами их НК, приводя к возникновению ложноположительных реакций.

Серодиагностика и аллергодиагностика

Серодиагностика (serum – сыворотка). Метод основан на обнаружении антител в сыворотке крови больного и определении динамики на­растания их титра в ходе заболевания. Для серодиагностики инфекционных болезней применяют различные иммунологические реакции (РА, РСК, РНГА, ИФА, ИФМ и т.д.), используя в качестве антигенов живые культуры микроорганизмов или диагностикумы (инактивированные взвеси микроорганизмов или антигены из них, полученные химическим путем).

Серологические исследования проводят также для эпидемиологического анализа инфекционной заболеваемости (определение специфических антител у здоровых лиц, свидетельствующее о перенесении ими инфек­ции или о контакте с соответствующим возбудителем), а также для определения уровня специфических антител с целью оценки эффективности вакцинопрофилактики.

При серологических исследованиях учи­тывается диагностический титр выявленных антител (максимальное разведение исследуемой сыворотки, дающее положительный результат). Наиболее информативными являются серологические исследования парных сывороток крови больного, взятых в начале болезни и через разные промежутки времени в процессе ее развития. Диагнос­тическое значение имеет нарастание титра в 4 раза и более.

Методы серодиагностики отличаются высокой специфичностью и чувствительностью. В последние годы широкое распространение получил метод ИФА.

Серологические реакции, несмотря на ряд достоинств, имеют некоторые ограничения, связанные с возможностью возникновения ложноотрицательных и ложноположительных реакций. Ложноотрицательные реакции могут появляться в результате нейтрализации антител избытком микроба или его антигенов в организме больного, а также в результате неоптимальных соотношений антигенов и антител при постановке реакции. Ложноположительные (псевдоиммунологические) реакции могут возникать при использовании гемолизированной или загрязненной микроорганизмами сыворотки крови, при нарушениях соотношения альбуминов и глобулинов, являться результатом перекрестных иммунологических реакций. Ложноположительные реакции могут появляться у беременных женщин, наркоманов, больных тяжелыми хроническими болезнями (красная волчанка, ревматоидный артрит, хронические гепатиты и т.д.) и инфекциями (бруцеллез и др.)

Аллергодиагностика. Наиболее часто при диагностике ряда инфекционных заболеваний (туберкулез, бруцеллез, туляремия и др.) ставят внутрикожные аллергические пробы для выявления гиперчувствительности замедленного типа к аллергенам микробов. Могут использоваться также методы аллергодиагностики in vitro, позволяющие оценить состояние специфической сенсибилиза­ции лейкоцитов крови в отношении определенного антигена, например, реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), реакция лейкоцитолиза (повреждения нейтрофилов) в присутствии специфического микробного антигена.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

В лабораторной диагностике болезней инфекционной природы используются следующие методы:
1) микроскопия препаратов, в том числе с применением реакции иммунофлюоресценции;
2) выделение культуры возбудителя;
3) обнаружение специфических антител (серодиагностика);
4) молекулярно-генетические методы.

Врач должен получить материал для исследования, выбрать необходимый метод диагностики и, если возможно, сообщить о предполагаемом возбудителе микробиологу, что позволяет провести диагностику с минимумом затрат. Микробиолог определяет не только вид возбудителя, но и его чувствительность к антимикробным средствам.

Диагностика бактериальных и грибковых инфекций основывается главным образом на микроскопии, обнаружении антигенов возбудителя и выращивании возбудителя на питательных средах. Для выявления некоторых возбудителей разработан также методы молекулярной диагностики. Микроскопия. В микробиологической диагностике используется целый ряд специальнных окрасок. Тем не менее наиболее важную роль в микроскопической диагностике продолжает играть окраска по Граму, поскольку она дешева и позволяет быстро обнаружить бактерии, грибы, лейкоциты и эпителиальные клетки.

Опытный микробиолог может сделать предапрительные выводы об этиологии заболевания по морфологии микроорганизмов (кокки, палочки и др.), а также по результатам их окраски: грамположительные микроорганизмы имеют синий цвет, грамотрицательные — красный. Например, грамположительные кокки скоплениями — это скорее всего, стафилококки. Однако относиться к таким выводам следует осторожно и подтвердать их данными посева. По наличию лейкоцитов и эпителиальных клеток оценивается качество взятия материала. Так, присутствие в образце мокроты 10 эпителиальных клеток и более на каждое поле зрения микроскопа под малым увеличением — несомненный признак загрязнения слюной. Во многих случаях, например, при исследование СМЖ, благодаря окраске по Граму удается быстро получить ценные данные.
К сожалению, этот метод малочувствителен и обнаруживает микроорганизмы только в количестве не менее 10 000/100 000/мл.

Методы быстрого обнаружения антигенов бактерий. Широко используется метод латекс-агглютинации. Он позволяет выявить стрептококки группы А в отделяемом глотки, Haemophilus influencae типа b, Streptococcus pneumoniae, стрептококки группы В и Neisseria meningitidis в СМЖ. Однако использовать данный метод для исследования всех образцов СМЖ нецелесообразно, поскольку он по диагностической ценности примерно соответствует окраске по Граму. Поэтому латекс-агглютинацию лучше применять при наличии плеоцитотоз в СМЖ у больных, получавших антимикробные препараты.

В США есть быстрый и чувствительный тест на присутствие антигенов Streptococcus pneumoniae в моче — Binax NOW Urinary Antigen Test (Binax Portland, ME). Его также можно применять для обнаружения антигенов Streptococcus pneumoniae в СМЖ у больных менингитом. К серьезным недостаткам данного теста относится то, что он положителен примерно у 50% практически здоровых детей, у которых носоглотка колонизирована Streptococcus pneumoniae.

Для выделения большинства бактерий, вызывающих заболевания у человека, используют селективные питательные среды, такие как кровяной или шоколадный агар. В частности, агар Мак-Конки подавляет рост грамположительных микроорганизмов, а грамотрицательные палочки растут на нем хорошо. Изменение цвета среды вокруг колоний бактерий, ферментирующих лактозу, на розовый позволяет отличить их от колоний других грамотрицательных палочек. Жидкие среды на мясном бульоне применяются для посевов крови, а также для накопления бактерий, находящихся в биологических материалах в небольшом количестве.

Большинство грибов выращивают на среде Сабуро, содержащей глюкозу, агар и антибиотики, подавляющие рост бактерий. Многие возбудители, например Bartonella spp., Bordetella pertussis, Brucella spp., Francisella spp., Legionella spp., анаэробы, микобактерии, отдельные грибы (Malassezia furfur и др.), микоплазмы и хламидии нуждаются в специальных питательных средах и условиях выращивания. При подозрении на инфекцию, вызванную одним из этих микроорганизмов, перед посевом следует проконсультироваться с микробиологом.

После выделения культуры вид возбудителя устанавливают по биохимическим тестам или способности расти в присутствии определенных веществ, которые тормозят рост других микроорганизмов (некоторые антибиотики, соли, желчь и т. п.). Для идентификации возбудителя также исследуют антигенную структуру с помощью олигонуклеотидных зондов.

А. Выявление специфических антител

В. Выявление специфического антигена

С. Выделение чистой культуры возбудителя

D. Выявление иммунной перестройки организма

Е. Выявление инфекционной аллергии

Фузобактерии, наряду с другими микроорганизмами, составляют часть нормальной микрофлоры человека, обитая во рту, в кишечнике. К какому семейству принадлежат фузобактерии?

У больного, находящегося в челюстно-лицевом отделении, из гнойного содержимого высеяны бактероиды. Какой препарат необходимо назначить данному больному наряду с хирургическим лечением?

Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых бактериями рода Bacteroides и Fusobacterium, имеют некоторые особенности. Что необходимо для выделения этих микроорганизмов из патологического материала?

A. Условия анаэробиоза

B. Первичные клеточные культуры

C. Высев из желчного бульона на кровяной агар

D. Заражение лабораторных животных

E. Картофельно-глицериновый агар с кровью

У больного с острым аппендицитом развился перитонит. Какой вид бактероидов является ведущим этиологическим фактором внутрибрюшинных инфекций?

Бактериолог приступил к исследованию гнойного содержимого больного на наличие в нем бактероидов? Какой метод окраски мазков-препаратов должен быть использован в этом случае?

Бактерии рода Bacteroides, являясь условно-патогенными микроорганизмами, вызывают гнойно-воспалительные заболевания различной локализации. Бактерии, какого рода тоже могут являться возбудителями таких заболеваний?

Бактериолог проводил микроскопию мазков-препаратов, приготовленных из колоний бактероидов, выросших на специальной питательной среде. По каким морфологическим признакам можно определить представителей рода Bacteroides?

A. Грамотрицательные неспорообразующие палочки

B. Грамположительные неспорообразующие палочки

C. Грамотрицательные спорообразующие палочки

D. Грамположительные спорообразующие кокковидные палочки

E. Грамположительные неспорообразующие кокки

Выделение, идентификация и видовая дифференциация бактероидов - длительный и трудоемкий процесс. Какая питательная среда используется для культивирования бактероидов?

A. Агар Чистовича

B. Среда Мансура

D. Агар Цейсслера

E. Среда Олькеницкого

При бактериологическом исследовании гноя из раны больного, перенесшего операцию, выделены микроорганизмы, которые дали рост на сахарно-кровяном агаре через 10 дней в анаэробных условиях: колонии черные, блестящие. При микроскопировании обнаружены грамотрицательные палочки. Какие микроорганизмы могли вызвать этот нагноительный процесс?

A. Кишечная палочка

В ответе, присланном из бактериологической лаборатории, не указан вид бактероида, выделенного из гнойного содержимого больного абсцессом легкого. Какой вид бактероидов может быть выделен в данном случае?

23. Для микроорганизмов рода Bacteroides характерно содержание общего термостабильного антигена. Назовите этот антиген.

A. Н-жгутиковый антиген

B. О-соматический антиген

C. К-капсульный антиген

D. Полисахаридный Vi-антиген

E. Протективный антиген

В бактериологической лаборатории исследовали гной из послеоперационной раны больного. На кровяном агаре через 7 дней в условиях анаэробиоза выросли колонии, при микроскопировании которых, обнаружены грамотрицательные палочки, располагающиеся парами или короткими цепочками. Какие колонии образует Bacteroides melaninogenes на кровяном агаре?

A. S-формы, блестящие, темно-коричневого цвета

B. S-формы, серого цвета

C. Красные с металлическим блеском

D. R-формы, кремовые

E. Мелкие, точечные белые

Диагностика бактероидозов представляет большие трудности из-за наличия в патологических материалах разнообразной микрофлоры, к тому же нередко посторонней. Назовите основной метод лабораторной диагностики при бактероидозах.

Для окончательного решения вопроса о причастности выделенных бактероидов к тому или иному заболеванию рекомендовано изучить нарастание титра антител в сыворотках крови больных. Какую серологическую реакцию для этого используют?

C. Связывания комплемента

Наибольшей опасности заболевания бактероидозами подвержены ослабленные лица с низкой степенью иммунологической резистентности. Что является потенциальным фактором патогенности бактероидов?

Род Bacteroides включает более 20 видов бактерий. Бактероиды, какого вида, наряду с Bacteroides fragilis, выделяются при гнойно-воспалительных процессах полости рта, дыхательных путей и т.д.?

На всех этапах исследования при бактероидозах требуется особая осторожность. Какие ситуации могут привести к гибели бактероидов в исследуемом материале?

A. Условия анаэробиоза

B. Температура 37С

C. Наличие диоксида углерода

D. Аэробные условия

E. Прямой солнечный свет

Рост бактероидов активируется введением в питательные среды глюкозы, цистеина и других восстанавливающих веществ. Какие колонии на сахарном кровяном агаре формирует Bacteroides fragilis?

A. Округлые бесцветные

B. Черные, темно-коричневые

C. Крупные кремовые

Способность бактероидов вызывать заболевания связана с токсичностью липополисахаридов и мембранных белков. Что не является фактором патогенности бактероидов?

C. Капсульная субстанция

Бактероиды встречаются чаще в виде мелких палочек, но бывают и бациллярные формы. Какой структурный элемент имеют некоторые виды бактероидов?

A. Зерна волютина

Новорожденным детям против туберкулеза вводят вакцину БЦЖ. Иммунитет длится до тех пор, пока в организме есть живые бактерии вакцинного штамма. Как наиболее правильно назвать такой вид иммунитета?

Исследуя мокроту больного, бактериолог обнаружил туберкулезные палочки. Какой дифференциально-диагностический метод окраски был при этом применен?

Перед ревакцинацией против туберкулеза необходима постановка кожно-аллегрической пробы. Какую из перечисленных проб при этом используют?

С. Пробу с антраксином

Е. Накожную пробу с тулярином

При микроскопии препаратов-мазков мокроты больного с хроническим заболеванием легких, окрашенных по Цилю-Нильсену, обнаружены тонкие красные палочки. Какое свойство туберкулезных палочек позволяет выявить этот метод окраски?

В препаратах-мазках, приготовленных из мокроты больного туберкулезом, микобактерии не были найдены. Каким методом обогащения необходимо воспользоваться для накопления микобактерий в мокроте?

А. Методом гомогенизации

В. Обработкой растворм Люголя

D. Методом серийных разведений

Е. Темнопольной микроскопией

Недостатком бактериологического метода исследования является медленный рост возбудителей туберкулеза на жидких и плотных питательных средах. Какой метод позволяет вырастить микобактерии в более короткие сроки?

А. Метод микрокультур Прайса

С. Метод флотации

D. Проба на токсигенность

Е. Обработка мокроты антибиотиками

Для активной иммунизации человека против туберкулеза используется живая вакцина. Эта вакцина приготовлена путем длительных пассажей микобактерий бычьего типа на картофельно-глицериной среде с желчью. Назовите имена ученых, получивших эту вакцину.

А. Кальметт и Герен

В. Чумаков и Смородинцев

С. Сэбин и Чумаков

D. Жерар и Робик

Е. Борде и Жангу

Последнее изменение этой страницы: 2016-04-21; Нарушение авторского права страницы

1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод ускоренного выявления (посредством П ЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией) в продуктах питания патогенных бактерий - возбудителей острых и хронических инфекционных заболеваний с пищевым путём передачи (родов Salmonella , Shigella (в комплексе с энтерои нвазивными E . coli ), вида Enterobacter ( Cronobacter ) sakazakii , энтерогеморрагических веротоксигенных Escherichia co li , термофильных Campylobacter spp . видов C . jejuni , C . coli , C . lari , а также Listeria monocytogenes).

1.2. Методические указания предназначены для специалистов лабораторий Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также иных организаций и учреждений, занимающихся вопросами оценки качества и безопасности пищевых продуктов, аккредитованных (лицензированных) на проведение соответствующих исследований в установленном порядке.

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

ВКО - внутренний контрольный образец

ОКИ - острые кишечные инфекции

ТСБДЭ - триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом

ТСАДЭ - триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом

ФБР - фосфатный буферный раствор

ЗПВ - забуференная пептонная вода

ЗФР - забуференный физиологический раствор

3.1. Лабораторный контроль загрязнённости пищевых продуктов патогенными бактериями с использованием традиционных культуральных методов анализа сопряжён с трудоемкостью, длительностью. Даже в случае отрицательного результата требуется от 3-х до 7-ми дней для выдачи ответа. Этот срок увеличивается при идентификации изолятов биохимическими и серологическими методами, что обусловливает проблемы при расследовании вспышек ОКИ и других заболеваний с пищевым путём передачи. Так, при вспышках шигеллёза, занимающих ведущее место в структуре ОКИ пищевого происхождения в РФ, из-за низкой эффективности выделения возбудителя в чистой культуре из инкриминированных продуктов возникают значительные трудности при верификации инцидентов.

3.2. Существенно оптимизировать процедуры определения, сократить время исследований и повысить специфичность позволяют новые технологии геномного анализа. Наиболее надёжным в последние годы признаётся анализ микробных нуклеиновых кислот и выявление специфичных участков ДНК путём ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

3.3. Представленный в настоящих указаниях метод является альтернативным классическому бактериологическому посеву и предусматривает ускоренное определение наличия или отсутствия ДНК, и соответственно, бактерий родов Salmonella , Shigella , вида Enterobacter ( Cronobacter ) sakazakii , энтерогеморрагических Escherichia co li , термофильных Campylobacter spp. видов C . jejuni , C . coli , C . lari , Listeria monocytogenes в определенной массе (объеме) пищевого продукта, подвергнутого инкубации в жидких селективных питательных средах (при необходимости дополнительно прединкубации в неселективных средах).

* При наличии эпидемиологических данных о возможности массивного заражения пищевого продукта искомыми возбудителями и только в ходе расследования вспышек пищевых отравлений и инфекций допускается исследовать инкриминированные образцы нативных пищевых продуктов с целью получения предварительных данных о причинном агенте вспышки. При этом положительные результаты ПЦР-анализа нативных пищевых продуктов должны подтверждаться выделением возбудителя в культуре, а отрицательные результаты не должны интерпретироваться и не могут служить основанием для прекращения поиска возбудителя с предварительной инкубацией в питательных средах.

3.5. ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией также подлежит включению в комплексное тестирование подозрительных культур патогенных микроорганизмов, выделенных из пищевых продуктов бактериологическими методами (согласно утвержденным в установленном порядке методам определения), с целью подтверждения их принадлежности к родам Salmonella , Shigella , Campylobacter (видов C . jejuni , C . coli , C . lari ), Listeria (вида L . monocytogenes ), энтерогеморрагическим E . coli и E .( Cr .) sakazakii в качестве дополнительных к биохимическим и серологическим методам идентификации, в т. ч. в обязательном порядке при:

· затруднениях идентификации Salmonella spp. - взамен расширенного набора биохимических тестов в случаях отсутствия агглютинации культуры с поливалентной диагностической сальмонеллезной 0-сывороткой (А, В, С, D, Е) и со смесью 0-сывороток редких групп при положительном результате стандартного набора биохимических тестов; при предположительном результате в случае наличия агглютинации с сыворотками редких групп; при положительных результатах серологического исследования и нетипичных результатах биохимических тестов (отклонения по 2 и более признакам),

· идентификации энтерогеморрагических E . coli (0157 : H7 и другие серотипы) - взамен расширенного набора биохимических тестов одновременно с подтверждением серологической принадлежности к серогруппе 0157,

· идентификации L . monocytogenes - взамен расширенного набора биохимических тестов одновременно с определением наличия лецитиназной и β -гемолитической активности,

· идентификации других вышеперечисленных микроорганизмов при нетипичных результатах биохимических тестов (отклонения по 2 и более признакам).

3.6. Метод применяется для исследования пищевых продуктов при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора (контроля), скрининговых исследований для целей гигиенического мониторинга, санитарно-эпидемиологических экспертиз и оценок, санитарно-эпидемиологических расследований вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи, а также может быть использован для проведения производственного контроля продовольственного сырья и пищевых продуктов.

4.1. Принципом метода является выявление путём ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией последовательностей (фрагментов) ДНК, строго специфических для геномов бактерий родов Salmonella , Shigella , вида Enterobacter ( Cronobacter ) sakazakii , веротоксигенных Escherichia co li , Listeria monocytogenes, термофильных Campylobacter spp. В основе ПЦР лежит многократное увеличение числа копий (амплификация) нуклеотидных фрагментов-мишеней ДНК, ферментом Taq-полимеразой в присутствии синтетических олигонуклеотидных праймеров и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Гибридизация флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов, присутствующих в составе реакционной смеси, с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени сопровождается нарастанием флуоресценции. Измерение интенсивности флуоресцентного сигнала позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации.

4.2. Метод ускоренного выявления предусматривает высев определенных количеств исследуемых образцов пищевых продуктов в соответствующие неселективные и селективные питательные среды, инкубирование посевов для накопления микроорганизмов, экстракцию (выделение) ДНК из культуральной жидкости * , амплификацию участка ДНК целевых бактерий со специфичными праймерами и гибридизационно-флуоресцентную детекцию ампликонов, осуществляемую в одном из двух вариантов: в режиме реального времени в ходе ПЦР (вариант FRT ) либо после завершения амплификации (вариант FEP).

* В случае исследования образцов нативных пищевых продуктов или бактериальных культур, выделенных из пищевых продуктов, - экстракция ДНК осуществляется из соответствующим образом подготовленных проб этих продуктов или чистых культур, выращенных на пластинчатых средах по п. 8.5.1.

Выделение ДНК из каждого исследуемого образца проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО), используемого на всех этапах исследования, начиная с этапа экстракции ДНК.

Детекция амплифицированной ДНК целевого микроорганизма и ВКО проводится по самостоятельным раздельным каналам.

4.3. При положительных результатах обнаружения патогена жизнеспособность присутствующих в исследуемом продукте искомых микроорганизмов должна быть подтверждена бактериологическим посевом с соответствующим биохимическим и серологическим типированием или ПЦР-анализом парных проб (прошедшей и не прошедшей культуральное обогащение) в режиме FRT.

4.4. Анализ осуществляется с применением коммерчески доступных комплектов реагентов, обеспечивающих амплификацию и детекцию ампликонов в одной пробирке, прошедших регистрацию в РФ в установленном порядке после стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.

5.2. Исследование осуществляется с применением описанных в настоящих указаниях методов культурального бактериологического анализа и коммерчески доступных ПЦР тест-систем с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации, предназначенных для применения в данной области и разрешенных к применению на территории РФ в установленном порядке. Для экстракции ДНК и ее детекции методом ПЦР должны применяться наборы реагентов, предусматривающие возможность использования внутреннего контрольного образца, проходящего все этапы исследования и служащего для выявления возможных ошибок при его проведении.

5.3. Условия безопасного проведения работ.

1) не открывать ПЦР-пробирки после амплификации, удалять отходы с продуктами ПЦР только в закрытом виде;

2) перед входом в рабочую зону снимать уже использованные перчатки. Заранее готовить новые перчатки, перед тем как покинуть рабочую зону;

3) сбрасывать наконечники с пипеток в пластиковый пакет и выносить его после каждого использования из рабочей зоны;

4) промывать рабочую зону после каждого использования дезсредством * ;

5) для биологической зашиты рабочей зоны использовать ультрафиолетовые облучатели до и после работы в течение 15 - 30 мин;

6) деконтаминировать пипетки еженедельно согласно рекомендациям производителя (121 °С в течение 30 мин);

7) обрабатывать охлаждающие блоки в следующей последовательности: обработка дезсредством * , ополаскивание водой и протирка сухой салфеткой перед размещением в холодильнике;

8) убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя дезсредства * ;

9) утилизировать неиспользованные образцы и реактивы.

В случае обнаружения контаминации (положительный результат в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией для отрицательного контрольного образца), вся рабочая зона должна быть подвергнута тщательной санитарной обработке. Для этого необходимо следовать перечисленным указаниям:

11) протереть наружные поверхности раствором дезсредства * . Оставить жидкость на поверхности примерно на 10 мин, затем вытереть насухо одноразовыми салфетками. Затем протереть поверхности 70 % этиловым спиртом. Облучить поверхности ультрафиолетом в течение ночи;

12) утилизировать все расходные материалы (наконечники для пипеток, растворы реагентов и т.д.), которые были извлечены из упаковок и частично израсходованы, путем автоклавирования при 121 °С в течение 30 мин;

13) очистить наружные поверхности всех используемых приборов и инструментов (амплификатор, пипетки и т.д.) с применением дезсредства и спирта;

14) простерилизовать пипетки и все использованные инструменты и приспособления, стойкие к автоклавированию, при 121 °С в течение 30 мин или в соответствии с рекомендациями производителей.

При выполнении анализов также необходимо соблюдать требования техники безопасности по ГОСТ 12.0.004-90, в т.ч. при работе с химическими реактивами - по ГОСТ 12.1.007-76, требования пожарной безопасности - ГОСТ 12.1.004-91 и электробезопасности - по ГОСТ 12.1.019-79, а также требования, изложенные в технической документации на амплификатор, сушильный шкаф, центрифуги, в инструкциях по применению наборов реагентов (тест-системы) для экстракции ДНК и для выявления ДНК методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

Необходимо избегать контакта компонентов наборов с кожей, глазами и слизистыми оболочками носа и рта; при попадании немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской помощью.

5.4. Требования к подготовке персонала.

Выполнение измерений могут проводить только специально обученные специалисты, способные после освоения техники ПЦР - анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности.

Персонал должен допускаться к работе в одноразовой лабораторной одежде (халат, шапочка, резиновые или пластиковые перчатки, маска, бахилы).

5.5. Условия выполнения измерений (детекции).

Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях при:

1) температуре окружающего воздуха (20 ± 5) °С,

2) атмосферном давлении (97 ± 10) кПа,

3) относительной влажности (65 ± 15) %.

Наборы реагентов (тест-системы) для экстракции ДНК и для выявления ДНК методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией должны применяться строго по назначению, согласно прилагаемых инструкций, и не использоваться по истечении срока годности.

6.1. Аппаратура и инструменты

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений рН ± 0,01

Шкаф сушильно-стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру в диапазоне от 50 до 200 °С с погрешностью ±2 °С

Термостат суховоздушный с рабочей температурой 37 °С, рабочий диапазон от 20 до 60 °С, точность поддержания температуры ±1 °С

Термостат суховоздушный с рабочей температурой 42 °С, рабочий диапазон от 20 до 60 °С, точность поддержания температуры ±1 °С

Анаэробный инкубатор или настольная система для анаэробного инкубирования

Баня водяная с подогревом, позволяющая поддерживать температуру (37 ± 1) °С

Баня водяная с терморегулятором, позволяющая поддерживать температуру от 0 до 100 °С

Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г

Микроскоп биологический бинокулярный с увеличением 900× - 1000×

Стерилизаторы паровые медицинские

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72

Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) или ламинарный шкаф класса биологической безопасности II тип А

Автоматическая станция для экстракции ДНК типа экстрактора NucliSENS ® easyMAG® в комплекте

Компьютер, совместимый с программным обеспечением амплификатора/детектора, в комплекте с монитором, клавиатурой, мышью, кабелем, компакт-дисками с информацией по эксплуатации и инструкциями по настройке прибора

Автоматические дозаторы с переменным объемом дозирования (от 5 до 20 мм 3 с шагом 0,01 мм 3 , с точностью ±0,8 % и от 20 до 200 мм 3 с шагом 0,1 мм 3 , с точностью ±0,6 %)

Распределительная емкость, объем 1 - 2,5 дм 3

Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости

Насос вакуумный (водоструйный)

Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше -16 °С для хранения выделенных проб

Облучатель бактерицидный настенный ОБН-15 0 или других видов