Титр при диагностике инфекций

Титр антител - это максимальное разведение кровяной сыворотки, содержащее в своем составе специфические антитела. При изучении иммунного статуса делается одно разведение сыворотки, соответственно, прилагаемой к тест-системе (1:50, 1:100), после чего при необходимости рекомендуется ее титрование посредством последовательных двукратных разведений.

Установлено, что при наличии в анализе титров антител до обратного значения 1:600-1:800 существует прямо пропорциональная связь между показателем оптической плотности и значением титра антител данной сыворотки. Выше данной обратной величины подобная зависимость нарушается и при последующем двукратном титровании (1:1600, 1:3200, 1:6400 и т.д.) возникает ошибка, которая тем больше, чем больше разведение.

Рассмотрим подробнее, что это - титр антител.

Разновидности антител

Многим интересно, что значит титры антител. В иммунологических исследованиях выделяется несколько видов антител, действующих строго на конкретные антигены. Их определяют при помощи метода титрования и в их число входят:

1. IgM – первоначальный иммуноглобулин, который начинает продуцироваться при попадании инфекции в организм. Его роль заключается в стимуляции иммунитета на первичную борьбу с патологическим процессом. Наличие IgG в крови наблюдается через 3-5 суток после начала болезни. Эти антитела формируют устойчивый иммунитет к определенным инфекциям, отвечают за результативность вакцинации.
2. IgA – защищают пищеварительный тракт, дыхательные пути и мочевыделительную систему от вредоносных микробов. Они связывают патогенные объекты, не давая им закрепиться на слизистых покровах.
3. IgE – активизируются в целях защиты организма от грибков, паразитов и аллергенов, и локализуются, главным образом, в бронхах, желудке и кишечнике. Данные антитела принимают участие в процессах формирования вторичного иммунитета. В плазме крови в свободном виде их практически нет.
4. IgD – фракция, которая до сих пор недостаточно изучена. Считается, что эти агенты отвечают за местный иммунитет, начинают продуцироваться при обострении миеломной болезни или хронических инфекций. В сыворотке составляют меньше 1% фракции всех существующих иммуноглобулинов.

Все антитела могут свободно присутствовать в плазме крови либо прикрепляться к поверхностям инфицированных клеток. Узнав антиген, специфические белки начинают соединяться с ним с помощью хвоста. Он служит особым сигналом для иммунных клеток, отвечающих за процессы нейтрализации чужеродных объектов.

Типы в зависимости от взаимодействия

С учетом того, как взаимодействуют с антигенами белки, их также подразделяют на несколько типов:

1. Антиинфекционные – связываются с телом болезнетворных микроорганизмов, уничтожая их.
2. Антитоксические – не оказывают влияния на жизнедеятельность чужеродных тел, однако обезвреживают токсины, вырабатываемые ими.
3. Аутоантитела – вещества, которые запускают механизм возникновения аутоиммунных нарушений посредством атаки здоровых клеток организма.
4. Аллореактивные – это иммуноглобулины, выступающие против антигенов клеток и тканей иных организмов одного и того же биологического вида. Исследование на определение антител этой фракции проводится посредством титрования при трансплантации различных органов.
5. Изоантитела – белковые соединения, которые продуцируются против агентов клеток иных биологических видов.
6. Антиидиотипические – соединения, которые предназначены для нейтрализации переизбытка собственных антител.

Как проводится анализ на титры антител? Это очень распространенное исследование.

Исследование крови

Современным методом лабораторной диагностики различных заболеваний считается анализ крови ИФА (иммунофлюоресцентный анализ). Этот тест на антитела позволяет определить титр (функциональность) иммуноглобулинов, их разновидность и установить, на каком этапе развития находится конкретный патологический процесс.

Алгоритм проведения

Методика определения титра антител состоит из нескольких стадий: сначала лаборант получает у человека сыворотку крови. Полученный образец помещается на специализированную пластиковую планшетку с наличием лунок, в которых присутствуют очищенные антигены искомых возбудителей или белка (в случаях если необходимо определить антиген). В лунки добавляется специальное окрашивающее вещество, которое при возникновении положительной ферментной реакции меняет цвет иммунных комплексов. По плотности окрашивания делается вывод о результатах проведенного анализа крови на титр антител.

Сроки

Для проведения данного тестирования исследователям необходимо от одного до трех дней. Сам анализ бывает двух видов: качественный и количественный. В первом случае указывается, что в сыворотке крови будет найден или, наоборот, отсутствовать искомый антиген. Тест количественного типа проводится в соответствии с более сложной цепной реакцией и позволяет сделать вывод о концентрации антител, установить их разновидность, оценить с какой скоростью развивается патологический инфекционный процесс.

Показания к назначению

Полный перечень показаний к проведению ИФА охватить невозможно, однако наиболее распространенными целями осуществления данного анализа является диагностика острых и хронических форм таких инфекционных патологий:

• IgG к ВИЧ;
• IgM и IgG к гепатитам вирусного происхождения А, B, C, E;
• IgM и IgG к цитомегаловирусу;
• IgM и IgG к герпесу;
• IgM и IgG к вирусу Эпштейна-Барр;
• IgG к паразитарным болезням;
• IgM и IgG к токсоплазмозу;
• IgM и IgG - титры антител к кори, краснухе, сальмонеллезу, клещевому энцефалиту, дизентерии и прочим заболеваниям;
• IgM и IgG к инфекциям, которые передаются через половые пути;
• IgG к хеликобактерной инфекции;
• в целях общей оценки показателей иммунитета и маркеров аутоиммунных заболеваний;
• определение онкологических маркеров (фактор некроза опухоли, простатспецифический антиген, раково-эмбриональный антиген и другие);
• определение уровня гормонов крови (прогестерон, пролактин, тестостерон, тиреотропный гормон и другие).

Расшифровка

Анализируемыми показателями при этом считаются:

1. IgM – присутствие данного класса иммуноглобулинов свидетельствует об остром течении инфекционного процесса в организме. Их отсутствие может свидетельствовать об отсутствии возбудителя либо о переходе патологического процесса в хроническую стадию.
2. IgA при отрицательном результате тестирования на IgM в большинстве случаев свидетельствует о скрыто протекающей либо хронической инфекции.
3. Совместное присутствие IgM и IgA - два положительных результата свидетельствуют о разгаре острой фазы имеющейся патологии.
4. IgG - хронизация заболевания либо выздоровление и формирование иммунитета к конкретному инфекционному агенту.

Еще одним важным количественным показателем является индекс авидности антител, который выражается в процентах. Он указывает на то, какой промежуток времени прошел от начала развития инфекционного процесса. Чем такой индекс выше, тем длиннее данный период.

Преимущества методики

Бесспорными преимуществами данной методики исследования считаются ее специфичность и высокая чувствительность. Чувствительность означает возможность распознать искомый элемент, даже если его содержание в образце невысокое. Специфичность подразумевает безошибочность диагностирования: если результаты положительные, значит, обнаружены именно те антитела или антигены, которые предполагались.

Высокая степень технологичности осуществления иммуноферментного анализа методом титрования минимизирует воздействие человеческого фактора, что существенно уменьшает вероятность ошибки. Основная масса используемых в современных клиниках реактивов и тест-систем для ИФА производятся в промышленных условиях, что гарантирует достоверный результат.

Основной недостаток

Основным недостатком данной диагностической методики является то, что для ее проведения необходимо знать, что именно нужно найти. Анализ подразумевает, что врач заранее предполагает, каким патологическим агентом вызвано то или иное заболевание.

Еще один недостаток данного исследования заключается в том, что ИФА на титры антител – это довольно дорогой метод анализа крови, что часто не по карману многим пациентам. А это означает, что к назначению такой диагностики врач должен подходить с умом.

Инфекционные болезни — это заболевания, вызванные проникновением в организм бактерий, грибков или вирусов. Самая важная часть диагностики инфекций — это определение возбудителя и его концентрации. Для этих целей используются разнообразные лабораторные методы, которые позволяют выяснить, чем именно и как давно атакован организм, а в некоторых случаях — спрогнозировать эффективность лечения тем или иным препаратом.

Особенности диагностики инфекционных заболеваний

В клинической практике данный тип заболеваний встречается очень часто. Именно они, по данным Всемирной организации здравоохранения, становятся причиной 26% всех смертей. В список самых распространенных инфекционных заболеваний входят инфекционная пневмония и другие воспалительные заболевания дыхательных путей, гепатит, ВИЧ, туберкулез, малярия, воспаления органов половой системы и мочевыводящих путей, гистоплазмоз, ротавирусные инфекционные заболевания, ветряная оспа, герпес, вирус папилломы человека и еще несколько десятков болезней. Хотя бы раз в жизни каждый из нас сталкивается с инфекционными заболеваниями и необходимостью быстрой постановки диагноза.

Все инфекционные болезни делятся на пять типов — прионные, вирусные, бактериальные, протозойные и грибковые поражения. Далее будут рассмотрены последние четыре типа как наиболее распространенные. Разные возбудители иногда могут вызывать одно и то же заболевание. В частности, пневмония может быть результатом как вирусной, так и бактериальной инфекции. Лечение зависит не от проявлений, а от возбудителя болезни. Противовирусные препараты бесполезны в борьбе с бактериями и грибками, антибиотики не действуют на вирусы. Поэтому основная задача лабораторной диагностики инфекционных заболеваний — выявление типа возбудителя.

Способы лабораторной диагностики инфекционных болезней можно разделить на два типа: неспецифические и специфические методы.

К неспецифическим относятся общий анализ крови и исследование соотношения ее белковых фракций, печеночные пробы, общий анализ мочи и кала. Эти методы не дают информации о виде возбудителя, но позволяют узнать, в какой мере болезнь затронула органы и системы организма, что именно в их работе нарушено и насколько далеко зашел процесс.

Специфические — вирусологический и бактериологический методы, микроскопическое исследование возбудителей, анализы на антигены и антитела — направлены непосредственно на обнаружение возбудителя.

Современная медицина располагает множеством методов выделения возбудителей бактериальной инфекции:

Бактериоскопический . Исследуется окрашенный специальным образом мазок.

Бактериологический . Биоматериал высеивается в питательную среду, и через некоторое время специалист исследует колонию бактерий, выросшую в ней.

Биологический . Направлен на определение патогенности микроорганизмов.

Серологический . Выявляет антитела и антигены в сыворотке крови — особые вещества, которые вырабатываются организмом при контакте с возбудителем определенной болезни.

Чаще всего для исследований используют кровь или сыворотку крови, реже — слюну, мочу, кал, клетки эпителия (мазок и соскоб) и другой биоматериал.

В лабораторной диагностике вирусных заболеваний используются:

Вирусологическое исследование . Световая и электронная микроскопия дает возможность выявить наличие вирусных включений и сами вирусы и идентифицировать их.

Серологическое исследование для обнаружения антител и антигенов. Этот метод дает возможность быстро выявить агрессора, как и в случае с бактериальными инфекциями. Для диагностики используются разнообразные способы исследования материала — реакции гемадсорбции, гемагглютинации или метод непрямой иммунофлюоресценции. Имунноблоттинг, в частности, позволяет выявлять антитела сразу к нескольким инфекциям и считается современным и точным диагностическим методом.

Молекулярно-генетические методы . Последнее слово в лабораторной диагностике. Позволяют обнаружить вирус даже тогда, когда его концентрация ничтожно мала — то есть на самых ранних стадиях. Самым известным из этих методов является ПЦР, при которой фрагмент вируса многократно копируется до тех пор, пока специалист не получит достаточно материала для определения типа вируса и его изначальной концентрации.

Для выявления вирусов обычно требуется сделать анализ крови.

Так называют инфекции, вызванные простейшими паразитами, например, амебами. Малярия, амёбиаз, токсоплазмоз, лямблиоз, трихомониаз, сонная болезнь — вот неполный список самых распространенных протозойных инфекций. Лабораторная диагностика таких заболеваний включает в себя следующие методы:

Микроскопический . Простейшие паразиты выявляются путем исследования под микроскопом окрашенных образцов биоматериала. Самый простой и надежный метод для многих возбудителей.

Культуральный . Посев биоматериала в питательную следу для дальнейшего исследования размножившихся простейших. У этого метода есть существенный недостаток: результатов нужно ждать долго, сам процесс может занять не менее 5-6-ти дней.

Серологический . Используют редко ввиду малой информативности.

Аллергический . Также не является распространенным. Кожные аллергопробы делают для того, чтобы подтвердить лейшманиоз и токсоплазмоз. Это вспомогательный диагностический метод.

В качестве биоматериала для исследований в основном используется кровь, иногда — – кал или моча.

Микроскопическое исследование . Препарат окрашивается и рассматривается под мощным микроскопом. Посредством иммунофлюоресцентной микроскопии исследуется проба, помеченная флюоресцеинами — специальным красителем. Наиболее быстрый способ выявления грибка по сравнению с другими методами.

Культуральный . Происходит посев пробы на питательную среду и дальнейшее исследование полученной в результате колонии грибков.

Серологический . Используется для выявления грибковых поражений, однако для микозов он считается не особенно точным.

Гибридизация нуклеиновых кислот . Самый современный способ выявления грибковых инфекций, его применяют для идентификации основных возбудителей системных микозов. Из культуры извлекается РНК и вносится особым способом помеченная молекула ДНК. Если в пробе наличествует один из основных патогенных грибков, ДНК объединится с его РНК, создав легко различимую структуру. Несомненным преимуществом метода является возможность определить инфекцию на самых ранних стадиях.

Биоматериалом для исследований являются клетки кожи, волос и ногтей, клетки слизистых оболочек (мазок или соскоб), мокрота, моча, секрет простаты, сперма, грудное молоко.

Современные методики диагностики инфекций позволяет выявить их на начальном этапе, Чем раньше болезнь будет обнаружена, тем проще ее вылечить. Поэтому сдавать анализы на инфекции желательно регулярно, даже если вы ни на что не жалуетесь и не замечаете никаких перемен в самочувствии.

Пе­ред сда­чей био­ма­те­ри­а­ла для ис­сле­до­ва­ний иног­да тре­бу­ет­ся опре­де­лен­ная под­го­тов­ка. Так, кровь обыч­но сда­ют с ут­ра, на­то­щак, а пе­ред за­бо­ром маз­ка не ре­ко­мен­ду­ет­ся при­ни­мать душ. Эти тре­бо­ва­ния очень важ­ны: они обес­пе­чи­ва­ют точ­ность ре­зуль­та­та, по­это­му узнай­те у вра­ча за­ра­нее о под­го­то­ви­тель­ных ме­рах и точ­но сле­дуй­те всем его ре­ко­мен­да­ци­ям.

1. Перечислите антигены, участвующие в реакции агглютинации:

*а) взвесь убитых бактерий

2. Перечислите антигены, участвующие в реакции преципитации:

*в) растворимые антигены

3. Механизм реакции агглютинации:

*а) образование иммунного комплекса АГ + AT

*б) образование мелкозернистого осадка

4. Механизм реакции преципитации:

*б) образование иммунного комплекса и выпадение плотного осадка

*в) образование иммунного комплекса и образование помутнения на границе двух прозрачных сред

5. Типы фагоцитирующих клеток:

*б) купферовские клетки

6. Чем заканчивается завершенный фагоцитоз?

*в) лизис антигена с помощью лизосомальных ферментов

7. По какому механизму осуществляется внешний фагоцитоз?

*в) выделение лизосомальных ферментов

8. В какой реакции участвуют опсонины?

*а) образование иммунного комплекса

10. Какие диагностикумы используются в РСК

*г) вирусный диагностикум

11. Что используется в качестве индикаторной системы в РСК

*в) гемолитическая система

12. Механизм реакции лизиса:

*в) активация комплемента на мембранном комплексе аг+ат

13. Реакция нейтрализации на животных обычно используется с целью:

*в) индикации токсинов в исследуемом материале

14. По какому механизму протекает радиальная иммунодиффузия:

15. Какие реакции относятся к реакциям иммунофлюоресценции:

16. Какая иммунная реакция по механизму
относится к реакциям пре­ципитации:

17. В каком случае подтверждается диагноз
бактериальной инфекции, если титр антител:

18. Подтверждаем ли диагноз вирусной инфекции,
если титр антител 1 сыворотки - 1/40,
2 сыворотки - 1/200:

19. Подтверждаем ли диагноз бактериальной
инфекции, если титр анти­тел 1 сыворотки - 1/200,
2 сыворотки - 1/400:

20. Практическое использование реакции флокуляции:

*в) титрование антитоксических единиц сыворотки

21. Практическое использование реакции преципитации:

*а) для определения классов иммуноглобулинов

22. С какой целью используется реакция агглютинации:

*б) для определения титра ат

*в) для определения вида возбудителя

23. Практическое использование реакции Манчини:

*б) для определения концентрации классов иммуноглобулинов

24. С какой целью используются сухие люминисцентные сыворотки против иммуноглобулинов?

*а) для определения возбудителя

25. С какой целью используется агглютинирующая адсорбирующая сы­воротка?

*г) для окончательной идентификации возбудителя

26. С какой целью используется биопрепарат антитоксическая диагнос­тическая сыворотка?

*г) для определения токсигенности выделенной культуры

27. С какой целью используется антиген Вассермана:

*б) для определения титра антител

28. Какой диагностикум используется в реакции преципитации:

29. Какой диагностикум используется в реакции агглютинации:

*в) диагностикум тифа "О"

30. Какой диагностикум используется в РСК:

*б) экстракт бактерий

31. Какой материал используется для серодиагностики:

*в) сыворотка крови

32. В каком случае будет положительный результат РСК:

*б)задержка гемолиза эритроцитов

33. Чему равен опсоно-фагоцитарный индекс:

*б) частному от деления фагоцитарных индексов здорового чело­века и иммунного человека

34. В каком случае реакция преципитации в агаре оценивается положительно:

*а) появление кольца или линии преципитата

35. В каком случае будет положительный результат реакции агглютинации:

*а) проявление осадка в виде мелких зерен

36. Какие компоненты участвуют в РПГА:

*б) эритроцитарный диагностикум

*в) физиологический раствор

*г) иммунная сыворотка

37. Какие компоненты участвуют в реакции нейтрализации:

*б) токсины бактерий

*г) диагностические сыворотки

38. Какие компоненты участвуют в ИФА:

*а) сыворотка иммунная

*д) антитела против иммуноглобулинов меченные ферментом

39. Практическое использование ИФА:

*а) для определения антител в сыворотке

40. Н-антиген бактерий - это антиген:

41. Местный иммунитет на поверхности слизистых ободочек обуслов­лен иммуноглобулинами:

42. 0-антиген бактерии - это антиген:

43. При первичном иммунном ответе первыми появляются иммуноглобулины:

44. Для постановки РИФ двухэтапным методом необходимы:

*а) кроличья сыворотка искомого аг

*в) люминисцентная сыворотка против иммуноглобулина кролика

45. Для постановки РСК в качестве источника комплемента использу­ется:

*б) сыворотка морской свинки

*в) кровь морской свинки

46. К реакциям с использованием меченных AT J -131 относят:

47. В реакции РСК участвуют аг:

48. Титром преципитирующей сыворотки называется:

*в) разведение сыворотки, при котором выпадает наибольшее ко­личество преципитата

49. Больше всего содержится иммуноглобулинов:

50. Секреторные иммуноглобулины А отличаются от циркулирующих иммуноглобулинов А:

*в) наличием S-фрагмента

51. Для постановки реакции агглютинации с целью серодиагностики необходимо иметь:

*з) исследуемую сыворотку

52. Для постановки РПГА с целью серодиагностики необходимо иметь:

*б) эритроцитарный диагнстикум

*д) исследуемую сыворотку

53. Для постановки РСК с целью серодиагностики необходимо иметь:

*г) гемолитическую сыворотку

*ж) эритроциты барана

*з) исследуемую сыворотку

54. Антиген Кана содержит:

г)* белковый коллоидный раствор

55. Выберите операции, необходимые для обнаружения ат иммуноферментным методом и установите их правильную последовательность:

а) внесение исследуемого материла (сыворотки)

б) промывка лунки

в) внесение комплемента

г) внесение сыворотки, меченной ферментом

д) оценка изменения окраски

ж) внесение субстрата (хромогена)

з) адсорбция антител на стенках лунки

к) внесение эритроцитов, нагруженных ферментом

56. Установите конечный результат положительной реакции РПГА:

57. Установите конечный положительный результат реакции ИФА:

*з) изменение окраски

58. Установите соответствие:

Группы антигенов. — Виды антигенов.

1). антигены бактерий а). O-антиген

2). антигены вирусов б). система AB0 1агд 2вз 3бж 4ие 5к

3). изоантигены в). капсид

4). гетероантигены г). Vi-антиген

5). антигены гистосовместимости д). H-антиген

з). гемагглютинин (ГА)

к) HLA (я сама этот вариант добавила)

59. Установите соответствие:

Тип реакции - Положительный результат

1. РА (агглютинации) а) образование хлопьев с просветлением суспензии

2. РП (преципитации) б) задержка гемолиза

3. РСК (связывания комплемента) в) помутнение

4. РПГА (пассивной гемагглютинации) г) зонтик 1а 2в 3б 4г 5д 6е

5. РТГА (торможения гемагглютинации) д) пуговка

6. ИФА (иммуноферментный анализ) е) изменение окраски

60. Установите соответствие:

Тип иммунной реакции - Механизм:

1. РА а) I фаза Аг + Ат (растворимый)

2. РП II фаза - помутнение на границе двух прозрачных сред

3. РН б) I фаза Аг + Ат (клеточный)

4. РСК II фаза - мелкозернистый взвешенный осадок

5. ИФА в) I фаза Аг (токсин) + Ат

6. РИА II фаза - нейтрализация токсина антитоксином

7. РПГА г) I фаза Аг (молекулярный) + Ат + С

8. РТГА II фаза + гемолитическая система результат: задержка гемолиза

8. РН на культуре клеток д) I фаза Аг (молекулярный) + Ат

II фаза + антиглобулин меченый ферментом

III фаза + хромоген результат: окрашивание

II фаза - выпадение осадка в виде зонтика

II фаза Y 131 Результат : щелчки на счетчике

1б 2а 3в 4г 5д 6ж 7е 8и 9з

заражение культуры клеток

цветная проба - цветная проба +

АГ +АТ + эритроциты результат

61. Установите последовательность:

Постановка реакции линейной агглютинации: в → б → а

а) учет результатов

б) внесение диагностикума

в) приготовление разведений сыворотки больного

62. Постановка реакции связывания комплемента (РСК):

а) разведение сыворотки больного

б) добавление комплемента а → в → б → г → д

в) внесение молекулярного антигена

г) добавление гемолитической системы

д) оценка результатов

63. Постановка ИФА для определения антител: в → а → г → б → е → д

а) внесение сыворотки больного

б) промывка пластины и добавление хромогена

в) промывка пластины с адсорбированным антигеном

г) промывка пластины и внесение антиглобулина, меченого ферментом

д) оценка изменений цвета окрашивания

е) добавление серной кислоты

64. Постановка РИА для определения Hbs Ag:

а) добавление антител к Hbs Ag в → а → г → б

б) учет результатов в радиоактивном счетчике

в) внесение материала больного (кровь)

г) внесение Hbs Ag J 131

65. Оцените результаты иммунной реакции:

I. РПГА с дизентерийным диагностикумом положительна в титре 1/400.

II. РПГА с дизентирийным диагностикумом положительна до титра 1/50.

III. РПГА с дизентерийным диагностикумом положительна: на 3 день заболевания в титре 1/50, а на 10 день - 1/200.

IV. РПГА с дизентерийным диагностикумом положительна в титре 1/100 в I сыворотке и через 14 дней - 1/100.

Оценку проводим на основании: __________1а 2в 3б 4б___(1а 2в 3б 4в)______________________________

а) диагностического титра

б) нарастания титра антител

в) определения антител

Результаты свидетельствуют в пользу: _________1-1 2-3 3-1 4-4_(1-1 2-2 3-1 4-3)___________________

Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.

Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов.

1. бактериологические;
2. серологические;
3. метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом материале.

У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.

Бактериологические методы исследования

Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.

Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.

Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.

Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.

Для идентификации вида возбудителя гнойно-воспалительных заболеваний и определения чувствительности к антибактериальным препаратам бактериологические лаборатории используют комплекс методов. Они включают:

• микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала;
• выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
• идентификацию бактерий;
• определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования.

Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.

Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза и т.д.). Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видом микроорганизмов в биологическом материале, а также дает предварительную информации об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение (эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.

Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов. Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды. Посев осуществляют на стерильные чашки Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для роста микроорганизмов.

Микроскопия мазков, окрашенных по Граму

1 - стрептококки; 2 - стафилококки; 3 - диплобактерии Фридленда; 4 - пневмококки

Чашки Петри с посевами инкубируют в термостате при определенных температурных, а для ряда микроорганизмов газовых (например, для выращивания анаэробов создают условия с низким содержанием кислорода) режимах в течение 18-24 ч. Затем чашки Петри просматривают. Количественную обсемененность доставленного биоматериала микрофлорой определяют по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл или 1 мг исследуемого образца. При просмотре чашек Петри выявляют некоторые особенности изменения цвета среды, ее просветления в процессе роста культуры. Многие группы бактерий образуют характерные формы колоний, выделяют пигменты, которые окрашивают колонии или среду вокруг них. Из каждой колонии делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Оценивают однородность бактерий, форму и размер, наличие спор или других включений, капсулы, расположение бактерий, отношение к окраске по Граму. Вся эта информация служит важнейшей составляющей для выбора сред и получения в дальнейшем чистой культуры каждого микроорганизма.

Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.

Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов имеющих этиологическое значение для данного заболевания. Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.

Оценка результатов исследования. Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний. Условно-патогенные микроорганизмы могут представлять нормальную микрофлору исследуемых жидкостей и тканей или контаминировать их из окружающей среды. Поэтому для правильной оценки результатов бактериологических исследований необходимо знать состав естественной микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях, когда исследуемый биоматериал в норме стерилен, как, например, спинномозговая жидкость, экссудаты, все выделенные из него микроорганизмы могут считаться возбудителями заболевания. В тех случаях, когда исследуемый материал имеет собственную микрофлору, как, например, отделяемое влагалища, кал, мокрота, нужно учитывать изменения ее качественного и количественного состава, появление несвойственных ему видов бактерий, количественную обсемененность биоматериала. Так, например, при бактериологическом исследовании мочи степень бактериурии (число бактерий в 1 мл мочи), равная и выше 10 5 , свидетельствует об инфекции мочевых путей. Более низкая степень бактериурии встречается у здоровых людей и является следствием загрязнения мочи естественной микрофлорой мочевых путей.

Установить этиологическую роль условно-патогенной микрофлоры помогают также нарастание количества и повторность выделения бактерий одного вида от больного в процессе заболевания.

Врач-клиницист должен знать, что положительный результат бактериологического исследования в отношении биологического материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий по оказанию медицинской помощи.

Серологические методы исследования

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух направлениях.

С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики. При первичном иммунном ответе, когда иммунная система человека взаимодействует с инфекционным агентов в первый раз, синтезируются преимущественно антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М. Лишь позднее, на 8-12 день после попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться антитела иммуноглобулинов класса G. При иммунном ответе на инфекционные агенты вырабатываются также и антитела класса А (IgA), которые играют важную роль в защите от инфекционных агентов кожи и слизистых оболочек.

2. Установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

Серологические исследования не обладают 100 % чувствительностью и специфич-ностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов.

В последние годы прогресс в области серологических исследований связан с разработкой тест-систем для определения авидности специфических антител к возбудителям различных инфекционных заболеваний.

Авидность - характеристика прочности связи специфических антител с соответствующими антигенами. В ходе иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать сначала специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические IgG-антитела. IgG-антитела обладают поначалу низкой авидностью, то есть достаточно слабо связывают антиген. Затем развитие иммунного процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных) IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими антигенами. На основании этих закономерностей иммунного ответа организма в настоящее время разработаны тест-системы для определения авидности специфических IgG-антител при различных инфекционных заболеваниях. Высокая авидность специфических IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и тем самым с помощью серологических методов установить период инфицирования пациента. В клинической практике наиболее широкое распространение нашло определение авидности антител класса IgG при токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.

Метод полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа - синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы - позволило тестировать РНК-вирусы, например, вирус гепатита С. ПЦР - это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

В ПЦР может быть использован различный биологический материал - сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д. В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.

Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключается в следующем:

• возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в т.ч. и материале, получаемом при биопсии;
• возможна диагностика инфекционных болезней на самых ранних стадиях заболевания;
• возможность количественной оценки результатов исследований (сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
• высокая чувствительность метода; например чувствительность ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В в крови составляет 0,001 пг/мл (приблизительно 4,0 . 10 2 копий/мл), в то время как метода гибридизации ДНК с использованием разветвленных зондов - 2,1 пг/мл (приблизительно 7,0 . 10 5 копий/мл).