Вирусологические исследования на клещевой энцефалит

Специфическая диагностика клещевого энцефалита проводится вирусологическими и серологическими методами.

Целью вирусологического исследования является выделение вируса из организма больного или умершего человека. При обследовании материала от умерших в раннем периоде болезни, когда нет возможности выявить динамику специфических антител, выделение возбудителя остаётся единственным методом диагностики. Однако отрицательный результат вирусологического исследования не исключает диагноза, так как успех во многом зависит от того, в какой стадии заболевания получен материал для выделения вируса, а также от соблюдения условий транспортировки. Длительность периода вирусемии не превышает 7 дней от начала заболевания. При обследовании в первые 4 дня заболевания частота выделения вируса из крови и спинномозговой жидкости достигает 40%.

Для проведения вирусологических исследований отбирают пробы сыворотки крови (или плазму), сгусток крови, ликвор. Ликвор берется в стационаре в количестве 2-3 мл в сухую стерильную пробирку. В случае летального исхода с давностью болезни не более 7 дней исследуется секционный материал: головной мозг, спинной мозг из грудного и шейного отделов по 1 см.куб. Исследуемый материал иссекают из органа стерильными инструментами и помещают в стерильную стеклянную посуду. Вскрытие трупа необходимо провести в возможно ранние сроки после смерти больного, желательно в день смерти. До вскрытия труп хранить при низкой температуре. Доставляется материал для исследования в лабораторию в день отбора проб в термоконтейнере со льдом. Если нет возможности доставить в этот же день, то материал замораживают и хранят в морозильнике.

При вирусологических исследованиях проводят реакцию нейтрализации на новорожденных мышах или культуре клеток с гомологичной иммунной сывороткой.

В культуральной жидкости инфицированных клеточных культур и мозга мышей антиген вируса клещевого энцефалита выявляется с помощью прямого или непрямого метода флуоресцирующих антител (МФА), по цитопатогенному действию (ЦПД), с помощью феномена бляшкообразования, в результате выявления специфических антигенов в реакции подавления гемагглютинации (РПГА), реакции диффузной преципитации в агаре (РДПА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Прямой и непрямой методы флюоресцирующих антител позволяют осуществлять экспресс-индикацию вируса клещевого энцефалита в инфицированных клеточных культурах.

Высоко чувствительной и специфичной является реакция непрямой гемагглютинации с эритроцитарным диагностикумом. Её достоинством также является то, что она технически проста. РНГА позволяет обнаружить наличие вируса непосредственно в исследуемом материале, не прибегая к его предварительному накоплению. Принцип РНГА заключается в том, что происходит взаимодействие антител, адсорбированных на поверхности эритроцитов, с гомологичным антигеном, в результате чего происходит агглютинация сенсибилизированных эритроцитов.

Целью серологических методов исследования является обнаружение в крови антител к вирусу клещевого энцефалита. Первыми появляются специфические иммуноглобулины класса М, которые затем постепенно заменяются иммуноглобулинами класса G. Обнаружение в крови человека Ig M всегда свидетельствует о наличии острого инфекционного процесса.

Максимальный титр тормозящих гемагглютинацию антител определяется на 2-3 неделе от начала заболевания, но в отдельных случаях их формирование несколько замедляется и они появляются на 6-7 неделе. Обычно эти антитела определяются в крови реконвалесцентов в течение нескольких лет. Комплементсвязывающие антитела редко появляются на 1 неделе от начала заболевания, а наивысшая их концентрация определяется на 6-8 неделе. Сохраняются они в крови переболевших не так долго: у 40% уже через год титры не определяются, у остальных могут быть выявлены в течение разного срока, вплоть до нескольких лет. Вируснейтрализующие антитела появляются на 2 неделе, титр их повышается на протяжении 3-4 недель и затем сохраняется в течение многих лет жизни переболевшего. При определении антител иммуноферментным методом специфические антитела обнаруживают несколько раньше, чем подавляющие гемагглютинацию, и в более высоких разведениях сывороток. При быстром формировании иммунного ответа высокие показатели можно получить уже в начале заболевания. В случаях замедленной продукции антител в иммуноферментном тесте можно выявить антитела при отрицательных показателях РТГА.

Известны случаи заболевания клещевым энцефалитом лиц вакцинированных, а также единичные случаи повторного заболевания. Недостаточная для полного предотвращения заболевания напряженность иммунитета может быть обусловлена свойствами вирусного штамма, количеством вируса, попавшего в организм, временным ослаблением резистентности организма или совокупностью этих факторов. Заболевания на фоне грундиммунитета, как правило, протекают в более лёгкой форме, специфические антитела выявляются уже в первые дни заболевания.

Серологическими методами исследуются парные сыворотки. Первую пробу крови забирают в первые дни болезни, до начала специфического лечения, вторую – на третьей неделе от начала заболевания. В случае отсутствия антител в первых двух пробах и при лечении гаммаглобулином рекомендуется исследовать третью сыворотку через полтора-два месяца. При двух волновом течении клещевого энцефалита целесообразно обследовать пробы крови, взятые во время 1 и 11 волны лихорадочного периода. Для определения состояния иммунитета исследуется единичная сыворотка. Пробу крови необходимо забирать через 4-5 недель после вакцинации или введения гаммаглобулина.

Серологический диагноз основывается на четырехкратном и более увеличении титра специфических антител. Снижение титра в четыре и более раз также считается диагностической сероконверсией. Стабильные титры антител во всех пробах сывороток не являются основанием для подтверждения или исключения диагноза. Необходимо помнить, что жители эндемичных районов могут иметь специфические антитела, сформировавшиеся в процессе естественной иммунизации. Постоянные титры антител могут выявляться у вакцинированных лиц. Отрицательные результаты исследования проб крови в начале заболевания и через 5-6 недель после выздоровления свидетельствуют против клещевого энцефалита.

Для серологических исследований кровь забирают из вены в количестве не менее 5 мл. в сухую стерильную пробирку. Для лучшего образования сгустка пробирку выдерживают в термостате 30 мин. или при комнатной температуре 1-2 ч., затем стерильной петлей отделяют сгусток от стенок пробирки и центрифугируют. Полученную сыворотку переносят в стерильную пробирку, закрывают резиновой пробкой и транспортируют в лабораторию в термоконтейнере. Нельзя допускать гемолиза эритроцитов. Если нет возможности направить сыворотку в лабораторию в тот же день, то пробирку оставляют в холодильнике при температуре +4С и доставляют через сутки. Если возникает необходимость длительного (несколько недель) хранения материала, его можно сохранять при отрицательных температурах, но при этом нужно иметь в виду, что в результате многократного замораживания и оттаивания происходит снижение титров вируса и антител, что приводит к искажению результатов исследования.

Для обследования больных с подозрением на клещевой энцефалит могут быть использованы многие серологические реакции, но в практической работе используются наиболее доступные и технически простые реакции: РТГА, РСК, ИФА. В основе реакции торможения гемагглютинации лежит способность антител подавлять вызываемую вирусами гемагглютинацию, что связано с блокировкой специфических антигенов поверхностной оболочки вирионов. Вирус клещевого энцефалита агглютинирует эритроциты гуся. Принцип реакции связывания комлемента (РСК) состоит в том, что образование комплекса антиген-антитело происходит в присутствии комплемента. Индикатором наличия комплемента в свободном состоянии служит гемолитическая система, состоящая из антител, лизирующих эритроциты, и эритроцитов. В основе иммуноферментного метода лежит принцип сорбции на твердой фазе антител или антигенов и специфических антител, меченых ферментом. В настоящее время промышленность выпускает иммуноферментные тест-системы для определения антител класса М и G.

При оценке результатов лабораторного исследования на клещевой энцефалит необходимо принимать во внимание следующее: сроки отбора проб, особенности клинического течения заболевания, особенности иммунитета пациента, метод, которым проводилось лабораторное исследование проб.

Все пробы, поступающие в лабораторию для вирусологического и серологического исследования должны быть промаркированы, иметь четко заполненные сопроводительные документы. В сопроводительных документах должна содержаться необходимая характеристика материала, цель исследования, сведения о больном, данные о времени и месте сбора образцов.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 1115 | Нарушение авторских прав

Исследование направлено на выявление антигенов и генетического материала возбудителей клещевого энцефалита и системного клещевого боррелиоза (болезни Лайма) в исследуемых клещах. Применяется в целях своевременной диагностики заболеваний, экстренной специфической профилактики и проведения целенаправленного патогенетического лечения.

Какие тесты входят в данный комплекс:

• Клещевой энцефалит (ВКЭ), антиген
• Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), определение РНК

Иксодовый клещ; клещевой энцефалит; вирус клещевого энцефалита; системный клещевой боррелиоз (болезнь Лайма), клещевой менингополиневрит, клещевой боррелиоз, иксодовый боррелиоз, хроническая мигрирующая эритема, эритемный спирохетоз, синдром Банноварта.

Синонимы английские

Ixodes tick; tick-borne encephalitis; tick-borne encephalitis virus; tick-borne borreliosis (Lyme borreliosis); Borrelia burgdorferi.

• Иммуноферментный анализ: Клещевой энцефалит (ВКЭ), антиген
• Полимеразная цепная реакция (ПЦР): Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), определение РНК

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Общая информация об исследовании:

Клещевой энцефалит – это вирусное природно-очаговое трансмиссивное заболевание, характеризующееся преимущественным поражением центральной нервной системы. Возбудителем заболевания является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Flavivirus семейства Togaviridae, группы Arboviruses. Инфекция носит сезонный (весенне-летний) характер и передается преимущественно с укусом клещей, при раздавливании внедрившегося насекомого, также возможен алиментарный путь передачи через инфицированное сырое молоко коров и коз. Основным резервуаром и переносчиком вируса являются клещи Ixodes persulcatus, Ixodes ricinus. Дополнительным резервуаром вируса являются грызуны, дикие животные и птицы. Заражение клеща происходит при укусе и кровососании инфицированных животных. При этом вирус проникает в органы и ткани клеща, преимущественно в слюнной аппарат, кишечник, половой аппарат, и сохраняется в течение всего периода жизни насекомых. Возбудитель клещевого энцефалита подразделяется на три подвида: дальневосточный, центрально-европейский и сибирский.

Инкубационный период заболевания длится от 3 до 21 дней, в среднем 10-14 дней. Клинические проявления носят разнообразный характер. Начальная фаза заболевания характеризуется лихорадкой, головной болью, миалгиями, возможно присоединение тошноты, рвоты, светобоязни. Далее развивается фаза неврологических расстройств, при которой происходит поражение центральной и периферической нервных систем. В зависимости от выраженности неврологических расстройств выделяют следующие формы заболевания: лихорадочную, менингеальную, менингоэнцефалитическую, менингоэнцефалополиомиелитическую и полирадикулоневритическую, двухволновый менингоэнцефалит. По степени тяжести инфекция может протекать в легкой, средней или тяжелой форме, что влияет на длительность заболевания, выраженность клинической симптоматики и варианты исхода болезни. В завершающую фазу заболевания может отмечаться выздоровление с угасанием неврологической симптоматики, хронизация патологического процесса или гибель больных. Возможно длительное латентное вирусоносительство, персистенция или хроническая форма инфекции.

Системный клещевой боррелиоз, или болезнь Лайма, – природно-очаговое трансмиссивное заболевание, возбудителем которого является грамотрицательная бактерия Borrelia burgdorferi семейства Spirochaetaceae. Заражение человека может происходить после укусов иксодовых клещей, инокуляции боррелий со слюной клеща, при раздавливании внедрившегося насекомого, также возможна трансплацентарная передача возбудителя от матери к плоду. Основным "резервуаром" и переносчиком вируса являются клещи Ixodes persulcatus, Ixodes ricinus, Ixodes scapularis. Чаще всего заражение происходит в весенне-летний период активности клещей.

Инкубационный период заболевания может длиться от 3 до 32 дней, по данным некоторых авторов до 60 дней. Клещевой боррелиоз имеет разнообразные клинические проявления. В первую фазу заболевания, фазу локальной инфекции, отмечаются лихорадка, интоксикация, головные боли, распространенная "мигрирующая" эритема на месте контакта клеща с кожей больного, регионарный лимфаденит. В фазу гематогенного и лимфогенного диссеминирования боррелий отмечается поражение органов и систем с развитием разнообразной клинической картины заболевания. Отмечается поражение опорно-двигательной, нервной, сердечно-сосудистой систем, глаз, печени, почек, кожи. При этом развивается клиническая картина невритов, радикулитов, энцефалитов, артритов, конъюнктивитов, миокардитов, появляется сыпь вне места укуса клеща. При прогрессировании заболевания, его осложнении и несвоевременном применении лечения могут развиться следующие процессы: неврологические нарушения в виде менингита, менингоэнцефалита, энцефалита и энцефаломиелита, тяжелые поражения сердца, рецидивирующие и/или хронические артриты. Возможно развитие непрерывного или рецидивирующего течения болезни, хронических форм поражения нервной системы.

В связи с тем что основным "резервуаром" и переносчиком клещевого энцефалита и системного клещевого боррелиоза являются иксодовые клещи, в лабораторной диагностике и выявлении возбудителей данных заболеваний используется непосредственное исследование клещей. Возможно обследование экземпляров клещей из природных очагов их распространения в целях выявления наличия возбудителей, определения процента инфицированных клещей на обследуемых территориях, количественного содержания вируса в случае клещевого энцефалита. Необходимым является исследование отдельных экземпляров клещей при их укусе человека, инокуляции вируса или боррелий со слюной клеща, при раздавливании внедрившегося насекомого. Это важно для определения возможного инфицирования клеща, своевременной диагностики заболеваний, экстренной специфической профилактике и проведении целенаправленного патогенетического лечения.

К современным методам диагностики возбудителей относятся методы твердофазного иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Они позволяют определить антиген возбудителя даже в минимальном объеме исследуемого биоматериала, характеризуются быстротой получения результата и обладают высокими показателями диагностической чувствительности и специфичности. Особенностью ПЦР-метода является возможность выявления генетического материала даже при малом его содержании в исследуемом биологическом материале. Данные методы позволяют в кратчайшие сроки определить наличие или отсутствие инфицированности клещей вирусом клещевого энцефалита и/или возбудителем клещевого боррелиоза. Но при отрицательных результатах исследований и сохранении подозрения на заболевания, а также при развитии клинической симптоматики рекомендуется исследование крови пациентов. При этом возможно определение антител классов IgM и/или IgG к антигенам возбудителей, а также выявление генетического материала возбудителей методом ПЦР.

Для чего используется исследование?

• Для комплексной лабораторной диагностики клещевого энцефалита и/или системного клещевого боррелиоза;
• для определения инфицированности исследуемых клещей;
• для определения содержания антигенов и генетического материала возбудителей клещевого энцефалита и/или системного клещевого боррелиоза в исследуемых клещах;
• для определения возможного инфицирования клеща в целях своевременной диагностики заболеваний, экстренной специфической профилактики и проведении целенаправленного патогенетического лечения;
• для определения наличия и процента инфицированности клещей на исследуемой территории в природных очагах и в сезон распространения насекомых.

Когда назначается исследование?

• При обследовании клеща после его укуса человека, раздавливания внедрившегося насекомого, извлечения клеща, в том числе в специализированном стационаре;
• при обследовании клеща в целях диагностики антигенов и генетического материала возбудителей клещевого энцефалита и/или системного клещевого боррелиоза;
• при обследовании клещей в целях определения наличия и процента инфицированности клещей на исследуемой территории в природных очагах и в сезон распространения насекомых.

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Причины положительного результата:

• инфицированность исследуемого клеща вирусом клещевого энцефалита;
• инфицированность исследуемого клеща возбудителем системного клещевого боррелиоза;
• инфицированность исследуемого клеща вирусом клещевого энцефалита и системного клещевого боррелиоза.

Причины отрицательного результата:

• отсутствие инфицированности исследуемого клеща вирусом клещевого энцефалита и/или системного клещевого боррелиоза;
• содержание возбудителя в исследуемом материале ниже уровня детекции;
• ложноотрицательные результаты.



При подозрении на наличие клещевого энцефалита и/или системного клещевого боррелиоза, но при отрицательных результатах исследования рекомендуется исследование крови пациентов. При этом возможно определение антител классов IgM и/или IgG к антигенам возбудителей, а также выявление генетического материала возбудителей методом ПЦР.

Кто назначает исследование?

Инфекционист, вирусолог, паразитолог, эпидемиолог.

7 Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с микроскопией мазка крови при выявлении патологических изменений)

84 Вирус клещевого энцефалита, IgM

67 Вирус клещевого энцефалита, IgG

8 Вирус клещевого энцефалита, антиген (в ликворе)

6 Белок общий в ликворе

22 Глюкоза в ликворе

28 Borrelia burgdorferi, IgM, титр

48 Borrelia burgdorferi, IgG, титр

19 Borrelia burgdorferi s.l., ДНК [ ПЦР ]

127 Серологическая диагностика клещевого боррелиоза и энцефалита

Литература

1. Wang G, Liveris D, Brei B, Wu H, Falco RC, Fish D, Schwartz I. Real-time PCR for simultaneous detection and quantification of Borrelia burgdorferi in field-collected Ixodes scapularis ticks from the Northeastern United States / Appl Environ Microbiol. 2003 Aug;69(8):4561-5.

2. Pancewicz SA, Garlicki AM, Moniuszko-Malinowska A, Zajkowska J, Kondrusik M, Grygorczuk S, Czupryna P, Dunaj J Diagnosis and treatment of tick-borne diseases recommendations of the Polish Society of Epidemiology and Infectious Diseases. Polish Society of Epidemiology and Infectious Diseases / Przegl Epidemiol. // 2015;69(2):309-16, 421-8.

3. Вирусологическое исследование отдельных экземпляров иксодовых клещей с использованием методов микроанализа. Методические рекомендации.

4. Ткачев С. Е., Ливанова Н. Н., Ливанов С. Г.Исследование генетического разнообразия вируса клещевого энцефалита сибирского генетического типа, выявленного в клещах Ixodes persulcatus на Северном Урале в 2006 году / Сибирский научный медицинский журнал, № 4 (126) – 2007.

5. Покровский В.И., Творогова М.Г., Шипулин Г.А. Лабораторная диагностика инфекционных болезней. Справочник / М. : БИНОМ. – 2013.

6. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни / М.: Медицина. – 2005. – 696 с.

Традиционным в вирусологической практике при изучении вирусофорности эпидемически значимых переносчиков клещевого энцефалита и других арбовирусных инфекций являлось исследование пулов, состоящих из 10 и более клещей, этот же принцип используется при выделении штаммов вирусов. В Методических рекомендациях излагается подробная методика исследования отдельных экземпляров иксодовых клещей для определения их вирусофорности с использованием иммуноферментного метода для прямого обнаружения вируса клещевого энцефалита в исследуемом материале и комбинированное применение микрокультуры клеток и иммуноферментного метода для накопления и индикации вируса в пробах, где его содержание очень низкое.

Вирусологическое исследование отдельных экземпляров клещей является целесообразным, т.к. позволяет получить прямые сведения не только о проценте инфицированных клещей на обследуемых территориях, но и количественно охарактеризовать содержание вируса. Выделение штаммов вируса с целью изучения их биологических свойств из отдельных экземпляров клещей исключает возможность генотипического и фенотипического смешения в процессе выделения, что не исключено при выделении вируса из пула клещей. Исследование отдельных экземпляров клещей при их присасывании на людях с целью определения их возможной инфицированности является важным моментом для проведения своевременной и целенаправленной пассивной иммунизации.

Преимущества ИФМ состоят в возможности прямого определения вирусного антигена в минимальных объемах исследуемого материала, простоте выполнения, высокой чувствительности и специфичности. В случае необходимости ИФМ можно дополнить методами биологического накопления вируса. Если вирус в пробе присутствует в количествах, не выявляемых с помощью ИФМ, его следует размножить в микрокультуре до уровня, превышающего порог чувствительности в ИФМ. Комплексное использование ИФМ и метода микрокультуры клеток дает возможность определить титр инфекционного вируса в отдельных экземплярах клещей, а также провести его накопление в количествах, достаточных для изучения биологических свойств. К основным достоинствам метода микрокультуры клеток, по сравнению с другими методами выделения вируса с использованием биологических моделей, следует отнести высокую экономичность и возможность проведения массового исследования проб с минимальными трудозатратами и высокой эффективностью.

Методические рекомендации предназначены для врачей-вирусологов, эпидемиологов, паразитологов санэпидстанций, лабораторий научно-исследовательских институтов, занимающихся вопросами изучения вируса клещевого энцефалита и других арбовирусных инфекций.

ИФМ - иммуноферментный метод.

ФЭК - фибробласты эмбрионов кур (первичная культура).

ПЭВ - культура клеток почек эмбриона свиньи (перевиваемая).

КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер.

ФСБ - фосфатно-солевой буфер.

ФСБ-С - фосфатно-солевой буфер с сорбиталем.

ФСБ-СС - фосфатно-солевой буфер с сорбиталем и сывороткой.

Планшеты для иммунологических реакций с плоским дном из полистирола, ТУ 64-2-278-79.

Пробирки для микропроб объемом 0,5 и 1,5 куб. см Ленинградского завода медицинских полимеров.

Дозаторы пипеточные, ПЛ-01.

Центрифуга лабораторная типа ЦЛО-3.

pH-метр любой марки.

Холодильник бытовой и на -40° любой марки.

Термостаты на 37° и с углекислым газом.

Весы торсионные ВТ-500.

Шприц непрерывного действия типа рекорд.

Насос водоструйный НВ.

Микроскоп 50 - 100 любой марки.

Осветитель ртутно-кварцевый ОКР-21.

Фотометр или спектрофотометр на 492 нм.

Лабораторная стеклянная посуда: пробирки, пипетки градуированные и пастеровские, чашки Петри, колбы, цилиндры мерные.

Альбумин бычий сывороточный, сухой, ТУ 10П-34-62.

Вода дистиллированная и бидистиллированная, требования ГФ-Х, стр. 107.

Калий двухромовокислый (К Сr О ), х.ч., ГОСТ 4220-75.

Лимонная кислота (С Н О ), х.ч., ГОСТ 3652-75.

Натрий углекислый (Na CO ), х.ч., ГОСТ 8379.

Натрий двууглекислый (NaHCO ), х.ч., ГОСТ 4201-79.

Натрий гидроокись (NaOH), х.ч., ГОСТ 4328-77.

Натрии хлористый (NaCl) х.ч., 4233-77.

Натрий фосфат однозамещенный (NaH PO х 2H O), ч.д.а.,

Натрий фосфат двузамещенный (Na HPO , ч.д.а., ГОСТ 11773-76.

Орто-фенилендиамин - C H (NH ) МРТУ 095880-694.

Перекись водорода (Н О ) 30%, х.ч., ГОСТ 10929-76.

Пенициллин-натриевая или калиевая соль.

Раствор полиглюкина (Красноярский завод медицинских

Среда 199 х 10 (десятикратный концентрат).

Сорбиталь С-20, ГОСТ 01105. 113-63.

Телячья сыворотка (производство НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи,

Кислота серная (H SO ) х.ч., ГОСТ 4204-77.

кислота), Serva, ФРГ, 25245.

Иммуноглобулин к вирусу клещевого энцефалита .

Антиген нормальный (контрольный) .

Антиген вируса клещевого энцефалита .

Диагностикум вируса клещевого энцефалита пероксидазный .

Готовится к выпуску Томским НИИВС.

Выпускается Томским НИИВС.

Членистоногих перед исследованием сортируют по половым и возрастным признакам. Клещей промывают 1 раз в этиловом спирте и 2 - 3 раза в растворе Хэнкса, pH 7,2 - 7,4 с антибиотиками (пенициллина 500 ед./мл и стрептомицина 1000 ед./мл). Каждого клеща переносят в небольшую охлажденную фарфоровую ступку и растирают. Для приготовления суспензии клеща добавляют 0,2 мл раствора Хэнкса с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 100 - 200 ед./мл) и 1% бычьего сывороточного альбумина.

Наиболее удобно растирать отдельные экземпляры клещей в пластмассовых пробирках для микропроб. Клеща переносят пинцетом в пробирку и опускают ее в жидкий азот на 10 - 15 секунд, гомогенизируют пестиком из нержавеющей стали (стержень диаметром 3 - 4 мм с краями, закругленными по внутренней форме пробирки). В пробирку добавляют 0,2 мл раствора Хэнкса с антибиотиками и альбумином. Пестик после использования прожигается над пламенем горелки, охлаждается в жидком азоте и используется повторно. Применение жидкого азота для глубокого замораживания клещей дает возможность сохранить биологическую активность материала и способствует более тонкому измельчению тканей клеща.

Из приготовленных суспензий берут 0,05 мл для исследования ИФМ и по 0,02 мл переносят на культуру клеток (в лунки панели). Оставшийся материал хранят при -40 °C или при -70 °C в холодильнике или в жидком азоте для повторного исследования и для рензоляции вируса. Хранить не более года.

Для прямой индикации вируса клещевого энцефалита ИФМ используют суспензии индивидуальных клещей. При предварительном выделении вируса в культуре клеток для исследования ИФМ используется культуральная жидкость. Суспензии клещей и культуральные сливы перед исследованием осветляют центрифугированием при 2000 об./мин. в течение 10 минут.

Специфический иммуноглобулин против вируса клещевого энцефалита, разведенный в КББ с pH 9,6 до концентрации 100 мкг/мл, вносят по 0,1 мл в каждую лунку планшета. Планшет оставляют в термостате при 37 °C на 2 часа во влажной камере.

Неадсорбировавшиеся иммуноглобулины удаляют вытряхиванием, лунки дважды промывают 0,01М ФСБ с pH 7,4. После промывки планшеты подсушивают постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

Готовят 1% раствор бычьего сывороточного альбумина на 0,01М ФСБ, вносят его в каждую лунку планшета, заполняя ее до края, и оставляют на 1 час при 37 °C. Альбумин адсорбируется на поверхности лунок, не занятой специфическим иммуноглобулином, предотвращая неспецифическую адсорбцию белков исследуемого материала.

Альбумин удаляют вытряхиванием и подсушивают постукиванием по фильтровальной бумаге. Сенсибилизированные планшеты можно сохранять в полиэтиленовых пакетах при 4 °C в течение 3 - 4 недель.

Разведения исследуемого материала делают на ФСБ-С (ФСБ с 0,05% сорбиталя) с 1% альбумина или 10% телячьей сыворотки (ФСБ-С). В лунки планшетов вносят по 0,05 мл каждого разведения. Инкубируют 1 час при 37 °C или 18 часов при 4 °C. На каждом планшете должны присутствовать стандартный специфический антиген вируса клещевого энцефалита и нормальный антиген (отрицательный контроль).

Содержимое лунок удаляют вытряхиванием в дезраствор, трижды промывают, как описано в п. 1.1, подсушивают постукиванием по фильтровальной бумаге.

Рабочее разведение пероксидазного диагностикума (указано на этикетке) готовят на ФСБ-С с 2% альбумина или 50% телячьей сыворотки. Диагностикум вносят по 0,1 мл в каждую лунку и оставляют для инкубации на 1 час при 37 °C.

Планшет вытряхивают, промывают, подсушивают (п. 1.1).

Готовят субстрат-индикаторный раствор и сразу же вносят во все лунки планшета по 0,1 мл, оставляют в темноте при комнатной температуре на 15 - 20 минут. Реакцию можно считать законченной, если в лунках со специфическим стандартным антигеном есть четкое желто-коричневое окрашивание субстрата, а лунки с нормальным антигеном остаются неокрашенными. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку 0,1 мл 2Н раствора серной кислоты.

Учет реакции визуальный или с помощью фотометра при длине волны 492 нм.

При визуальном учете результат считают положительным, если в лунках появляется отчетливое желто-коричневое окрашивание различной интенсивности. При этом необходимо учитывать результаты реакции в контрольных лунках: контрольный специфический антиген выявляется желто-коричневым окрашиванием субстрат-индикаторного раствора, тогда как в лунках с нормальным антигеном окрашивания быть не должно.

Для количественной оценки содержания антигена в положительных пробах при визуальном учете результатов используют разведения антигенов. Количество антигена оценивают его титром - максимальным разведением антигена, в котором еще можно наблюдать различимое глазом окрашивание субстрат-индикаторного раствора.

При инструментальном учете результатов реакции на фотометре при длине волны 492 нм содержимое лунок переносят в микрокювету и измеряют оптическую плотность пробы. Результат оценивают как положительный, если отношение оптической плотности исследуемой пробы к оптической плотности стандартного нормального антигена составляет не менее 2,1.

В качестве чувствительной системы для биологического накопления вируса используют первично-трипсинизированные клетки фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) или клетки перевиваемой линии СПЭВ, выращенные в лунках планшетов для иммунологических реакций (микрокультура клеток).

Приготовленную суспензию клеток разводят средой роста до концентрации 300 - 400 тыс. кл/мл для перевиваемых клеток СПЭВ и 5 - 6 млн. кл/мл для первичных ФЭК, разливают шприцем-дозатором по 0,2 мл в каждую лунку планшета. После заполнения планшеты закрывают крышками и помещают в термостат 37 °C. Монослой формируется через 12 - 18 часов.

Сформированный монослой контролируют визуально или под лупой х4 - 8, среду отсасывают водоструйным насосом в любую подходящую емкость через тонкую иглу для инъекций. Для предотвращения повреждения монослоя клеток кончик иглы погружают вдоль стенки лунки. После отсасывания среды качество монослоя дополнительно контролируют под микроскопом - монослой должен быть плотным, без просветов. Далее в лунки вносят по 0,2 мл раствора Хэнкса. Через 5 - 7 минут раствор отсасывают и отмывают монослой еще раз. После этого в лунки вносят по 0,18 мл среды поддержания .

Используют любую из опубликованных методик приготовления суспензий первичных и перевиваемых клеток (см., например, "лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний" под ред. Э. Леннета и П. Шмидт, М., Медицина, 1974).

Для выделения вируса первичный материал исследуют без разведения, внося по 0,02 мл суспензии каждого клеща в 2 - 4 лунки планшета. Планшеты накрывают крышками и помещают в термостат 37 °C. Через 72 часа культуральную жидкость исследуют ИФМ.

При определении титра вируса клещевого энцефалита материал

исследуют в разведениях с 10 до 10 . 10-кратные разведения

исследуемого материала готовят непосредственно в лунках с

клетками. На каждое разведение выделяют по 4 лунки. В лунки

первого разведения вносят по 0,02 мл суспензии клеща пипеточным

дозатором. Наконечник дозатора меняют, содержимое лунки

осторожно, чтобы не повредить монослой клеток, пипетируют и

переносят по 0,02 мл в лунки следующего разведения и т.д. После

приготовления разведений планшеты закрывают крышками и помещают в

термостат 37 °C. Через 72 часа культуральную жидкость из лунок

планшетов переносят в соответствующие лунки свежеприготовленной

культуры клеток (для этого за 18 часов заливают суспензией клеток

необходимое количество планшетов) по 0,05 мл, после чего в каждую

лупку добавляют по 0,15 мл среды поддержания. Через 72 часа

культуральную жидкость исследуют ИФМ. За титр вируса принимают то

конечное разведение, при заражении которым в 50% и более лунок с

клетками после накопления обнаруживается вирус-специфический

антиген ИФМ. Титр вычисляют методом Рида и Менча.

При ежегодном контроле вирусофорности эпидемиологически значимых переносчиков в документированных очагах клещевого энцефалита для выявления колебаний инфицированности клещей достаточно применения только ИФМ. Антиген вируса клещевого энцефалита определяют в 150 - 170 клещах скринингом суспензий клещей и рассчитывают вирусофорность. При необходимости количественной оценки содержания вируса в клещах положительные пробы исследуют в разведениях (с коэффициентом 2) ИФМ для определения титра вируса.

Основной задачей при исследовании клещей, собранных на неизученных территориях, является определение их вирусофорности с использованием максимально чувствительной тест-системы. В этом случае исследование первичного материала ИФМ является предварительным и служит для получения экспресс-информации о присутствии вируса в клещах на данной территории. Окончательный результат об инфицированности клещей можно получить после дополнительного вирусологического исследования отрицательных в ИФМ проб в микрокультуре клеток с последующей индикацией вируса клещевого энцефалита. Для этого через 72 часа после инокуляции первичного материала на монослой клеток культуральные сливы исследуют ИФМ.

При сравнительной оценке лоймопотенциала однотипных очагов важной характеристикой является не только процент инфицированности клещей, но и количество (титр) вируса клещевого энцефалита, содержащегося в отдельных экземплярах иксодовых клещей. Для получения экспресс-информации клещей исследуют ИФМ (см. п. 5.1). Выделение инфекционного вируса и определение титра проводят в микрокультуре клеток (см. п. 4.2.2).

Суспензии индивидуальных клещей исследуют ИФМ. Пробы, в которых обнаружен антиген вируса клещевого энцефалита, используют для заражения микрокультуры клеток. На каждую пробу берут 4 лунки с монослоем клеток (по 0,02 мл суспензии клещей в каждую лунку). Через 72 часа содержимое лунок переносят в отдельную для каждой пробы пробирку, исследуют ИФМ для контроля накопления вируса. Полученный на культуре клеток вируссодержащий материал можно использовать для заражения белых мышей или пробирочных клеточных культур для накопления вируса в большем объеме материала с целью дальнейшего изучения биологических свойств. Исследования проводят в условиях, исключающих возможность контаминации материала другими вирусами. Поскольку каждого клеща исследовали дважды ИФМ: до и после накопления вируса в микрокультуре клеток, рензоляция вируса из первичного материала не обязательна.

При необходимости исследования клещей, снятых после присасывания к людям, основной задачей является получение достоверного результата о наличии вируса в клеще в максимально короткие сроки. Для этого суспензию каждого клеща исследуют ИФМ и одновременно инокулируют в микрокультуру клеток. Обнаружение антигена вируса клещевого энцефалита ИФМ возможно (при наличии заранее сенсибилизированных планшетов) через 2,5 - 3 часа. Положительный результат ИФМ является достаточным основанием для проведения экстренной специфической профилактики. Окончательный результат получают при исследовании ИФМ культуральной жидкости, собранной через 72 часа после заражения микрокультуры клеток суспензией клеща.

Тактика обследования природных очагов инфекции строится в зависимости от задач, стоящих перед исследователем. При разведке территории на наличие очагов клещевого энцефалита необходимо получить данные о вирусофорности клещей за минимальный срок с наибольшего количества участков. С этой целью территорию, подлежащую обследованию, разбивают на ряд участков, лежащих в различных природных зонах (подзонах), различающихся по геоботанической характеристике. На каждом участке определяют 3 - 5 маршрутов протяженностью не менее 3 км каждый, с расстояниями между ними 5 - 10 км. В случае низкой численности клещей, если на всех маршрутах в сумме не удается собрать необходимое количество клещей (150 - 170 экземпляров), закладывают по такой же схеме дополнительные маршруты. При высокой численности клещей, когда на минимальном количестве маршрутов (три) собирают клещей больше необходимого минимума и нет возможности исследовать их всех, из общего количества произвольно выбирают необходимое число (после смешивания всех сборов). Такая тактика применяется тогда, когда наблюдения ведутся на однородной территории (тайга, крупный островной лесной массив). При работе на мозаичной территории (мелкие островные леса, колки лесостепи) один маршрут, как правило, пролагается на территории одного такого небольшого леса. В этом случае, поскольку промежуточная территория обычно не приспособлена для существования очагов (зачастую окультурена), расстояния между лесными участками могут быть и меньше, чем в первом случае.

При изучении многолетней динамики вирусофорности клещей на участках, где известно постоянное существование очагов, закладываются учетные площадки в различных типах ландшафтов с таким расчетом, чтобы на каждой площадке можно было провести 9 - 12 км учетных маршрутов, которые должны равномерно охватывать всю территорию площадки.

1,59 г Na CO и 2,93 г NaHCO растворить в 1 л