Алгоритм диагностики хронического бруцеллеза

Бруцеллез – хроническая бактериальная инфекция, при которой возникает лихорадка, поражаются кости, мышцы, сердце, сосуды, нервная система, почки. Заражение происходит от животных. Бруцеллез относят к особо опасным инфекциям.

Что такое особо опасная инфекция? Сегодня этот термин в мире не употребляется – он сохранился только в странах СНГ. Традиционно к особо опасным инфекциям принято относить такие заболевания, которые отличаются высокой заразностью и оказывают выраженное негативное влияние на организм.

Впервые изучением бруцеллеза занялся исследователь Дж. Марстон на острове Мальта в XIX веке. Местные жители и расквартированные английские солдаты заражались заболеванием, когда пили сырое козье молоко. В 1886 году бактерия впервые обнаружена в селезенке погибшего больного (это было сделано ученым Д. Брюсом – в честь него возбудитель назван бруцеллой), а с 1897 года успешно применяется анализ сыворотки зараженных людей.

В России первые случаи заболевания зарегистрированы в 1912 году в Ашхабаде.

На этот вопрос сложно ответить, так как даже в развитых странах выявляют не всех больных. Например, в США ежегодно выявляется 200 новых случаев, но считается, что это лишь десятая часть от общего количества реально заболевших.

В некоторых странах бруцеллез не встречается вообще: в Дании, Швеции, Исландии, Финляндии, Швейцарии, Словакии, Чехии, Румынии, Нидерландах, Великобритании (включая Нормандские острова), Японии, Болгарии, Люксембурге, на Виргинских островах и на Кипре.

Наиболее подвержены заражению бруцеллезом люди следующих профессий:

• фермеры;
• работники мясоперерабатывающих предприятий;
• врачи-ветеринары;
• сотрудники бактериологических лабораторий.

Около 90% заболевших – люди молодого и среднего возраста. В России заболевание наиболее распространено на Алтае, в Туве, Новосибирской, Омской области, Приуралье, Поволжье, Дагестане, на Северном Кавказе.

Причины бруцеллеза

Бруцеллез – инфекционное заболевание, которое вызывают шесть родственных видов бактерий.

Животные, от которых может происходить заражение:

• козы и овцы;
• крупный рогатый скот;
• свиньи;
• северные олени.

Наиболее опасен в этом отношении мелкий рогатый скот, так как токсины бактерий, которыми от него можно заразиться, особенно сильны. Существует разновидность бактерий-бруцелл, поражающая пустынных кустарниковых крыс. Они не опасны для человека.

Бруцеллы сохраняются в окружающей среде достаточно долго:

• в почве – до 6 месяцев;
• в молочных продуктах – до 2 месяцев;
• в мясе – до 20 суток;
• в сырах из зараженного молока – до 3-4 месяцев;
• в замороженном или засоленном мясе – до 1,5-2 месяцев.

Во время кипячения возбудители погибают мгновенно.

Бруцелла – бактерия, способная обитать и размножаться внутри клеток человеческого тела, где она недоступна для иммунной системы. Защитные системы организма не могут справиться с возбудителем, и заболевание протекает в хронической форме.

От человека заразиться бруцеллезом нельзя. Хотя, есть некоторые данные о возможности заражения плода от беременной матери, ребенка через грудное молоко, партнера во время полового акта.

Пути заражения бруцеллезом:

• при употреблении в пищу инфицированного молока, молочных продуктов, мяса;
• при вдыхании пыли от шерсти, навоза, подстилки, земли;
• непосредственный контакт, разделка мяса, если есть повреждения, ссадины и мелкие царапины на коже.

Признаки бруцеллеза

Бруцеллез протекает в 5 стадий:

Название стадии	Что происходит в организме?	Какими симптомами проявляется?
Инкубационный период	Человек съедает зараженный продукт. Болезнетворные бактерии проникают в клетки слизистой оболочки пищеварительной системы (другие пути проникновения – через слизистые оболочки органов дыхания и порезы на коже), размножаются и накапливаются в них. Затем с током лимфы они попадают в близлежащие лимфатические узлы.	Инкубационный период может продолжаться от недели до месяца. Симптомы отсутствуют.
Острый период	Возбудитель проникает из лимфатических узлов в кровь и распространяется по всему организму.	Симптомы острой стадии бруцеллеза: Лихорадка, при которой повышение температуры тела происходит преимущественно в вечерние часы. Ознобы. Во время озноба температура тела падает ниже нормальной, а затем опять начинает подниматься, возникает ощущение сухости во рту. Проливные холодные поты. Увеличение подкожных лимфатических узлов в области шеи и подмышек. По размерам они становятся похожими на фасолины. Снижение артериального давления. Головные боли, повышенная утомляемость, раздражительность, плохой сон.
Стадия поражения различных органов	Из крови бруцеллы попадают в разные органы и оседают в них. Одновременно начинается перестройка иммунитета организма, возникают аллергические реакции.	При хронической форме заболевания бывают поражены разные органы. Симптомы выражены в разной степени.

Признаки бруцеллеза при поражении разных органов

Бруцеллезный артрит – воспаление сустава. Является самым частым проявлением бруцеллеза в хронической форме.

Симптомы бруцеллезного артрита:

• резкие боли в суставе;
• припухлость, покраснение в области пораженного сустава;
• нарушение движений.

Чаще всего возникают полиартриты, при которых поражается несколько разных суставов, причем, очаги поражения постоянно перемещаются. Как правило, воспаление развивается в крупных суставах: тазобедренных, коленных, локтевых, плечевых, нередко страдает сочленение между крестцом и костями таза.

Реже встречается поражение мелких суставов кистей и стоп.

Артриты межпозвоночных суставов отличаются упорным течением, часто рецидивируют. При бруцеллезе поражения суставов могут сочетаться с воспалительными процессами в сухожильных влагалищах (тендовагинит), синовиальных сумках (бурсит), болями по ходу рядом расположенных нервов.

При длительном течении воспалительного процесса вокруг сустава образуется разрастание костной ткани, в результате чего нарушаются движения.

Бруцеллезный миозит – воспаление мышечной ткани. Чаще всего поражаются мышцы поясницы, рук и ног.

Симптомы бруцеллезного миозита:

• Боли в мышцах. Они продолжаются в течение длительного времени, имеют тупой характер, усиливаются во время изменения погоды.
• В толще мышц появляются болезненные уплотнения, которые можно прощупать.
• Со временем боль проходит, уплотнения исчезают, но затем они появляются в других мышцах.

Бруцеллезный целлюлит – воспаление в жировой ткани. Под кожей появляется болезненное округлое или овальное уплотнение диаметром от 1 до 4 см. Со временем оно рассасывается, либо еще больше уплотняется и остается под кожей в течение длительного времени. Во время каждого обострения хронического бруцеллеза возникают новые уплотнения.

Возможные поражения сердца и сосудов при бруцеллезе:

1. Эндокардит – воспаление внутренней оболочки сердца, которая выстилает его камеры изнутри. Основные проявления заболевания:
   • лихорадка;
   • слабость, потливость, повышенная утомляемость;
   • боли в костях и мышцах;
   • одышка;
   • отеки на ногах, особенно в вечернее время;
   • синюшный или фиолетовый оттенок кончиков пальцев, носа, мочек ушей.
2. Перикардит – воспаление наружной оболочки сердца. Основные симптомы заболевания:
   • повышение температуры тела;
   • общая слабость, недомогание;
   • боли в груди – возникают слева или в нижней части грудины, усиливаются во время частого глубокого дыхания, проходят в положении сидя, когда корпус наклонен вперед.
3. Тромбофлебит – воспаление стенки вены и образование на ней тромбов. Основные симптомы заболевания:
   • повышение температуры тела, недомогание;
   • боль по ходу воспаленной вены;
   • болезненные шишки под кожей;
   • отек пораженной конечности, боли, онемение.

Опасное осложнение тромбофлебита – отрыв тромба и его попадание с током крови в сердце, легочные сосуды (это состояние называют тромбоэмболией).

Обычно подозрение на бруцеллез возникает в том случае, когда у больного имеются симптомы инфекционного эндокардита или перикардита, врач назначает исследования для выявления обычных возбудителей, а их результат оказывается отрицательным. После этого назначают специфические анализы на бруцеллез.

Симптомы со стороны органов дыхания при бруцеллезе выявляются редко.

Виды поражения дыхательной системы:

• Бруцеллезная ангина – воспаление миндалин. Они увеличиваются в размерах, возникает боль в горле, которая усиливается во время глотания. Глотание становится затрудненным.
• Бруцеллезный фарингит – воспаление слизистой оболочки глотки. При этом отмечаются боли в горле, кашель.
• Бруцеллезный бронхит и бруцеллезная пневмония (воспаление легких). Проявляются характерными классическими симптомами. Больного беспокоит частый кашель, отходит мокрота, в которой могут быть примеси крови.

Последствия и остаточные явления бруцеллеза

К какому специалисту обращаться?

Лечением бруцеллеза занимается врач-инфекционист. Однако чаще всего больной изначально обращается к другому специалисту: к терапевту, гастроэнтерологу, ревматологу, кардиологу.

Бруцеллез – заболевание, которое может проявляться по-разному, большим количеством симптомов. Поэтому поставить диагноз только после смотра очень сложно. Врач может лишь заподозрить заболевание. Окончательно диагностировать бруцеллез помогают лишь лабораторные тесты.

Доктор проводит обычный врачебный осмотр. Он осматривает кожу пациента, выстукивает и выслушивает грудную клетку, ощупывает живот, суставы, проверяет их подвижность, осматривает горло. При поражении нервной системы пациент осматривается неврологом, глаз – окулистом.

Назначается комплекс диагностики, который может включать разные исследования, в зависимости от имеющихся симптомов:

• при поражении суставов: рентген, УЗИ, компьютерная томография, артроскопия;
• при поражении сердца: рентген грудной клетки, ЭКГ, ЭХО-кардиография;
• при поражении органов дыхания: рентген грудной клетки, анализ мокроты;
• при поражении пищеварительной системы: УЗИ органов живота, биопсия печени, анализы на гепатит;
• при поражении мочеполовой системы: УЗИ малого таза, кольпоскопия, гистероскопия, анализ мазков из влагалища;
• при поражении нервной системы: рентгенография черепа, компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, спинномозговая пункция, электроэнцефалография;
• при поражении лимфатических узлов и селезенки: ультразвуковое исследование, биопсия;
• при поражении глаз: осмотр окулиста.

Проводят общий анализ крови, бактериологические исследования. Симптомы бруцеллеза очень разнообразны, поэтому его сложно отличить от других заболеваний. Некоторые случаи, в которых возникает подозрение на бруцеллез:

• симптомы поражения суставов, которые беспокоят в течение длительного времени и не укладываются в клиническую картину большинства распространенных суставных заболеваний;
• эндокардит и перикардит, при которых бактериологические анализы показывают отрицательный результат;
• пневмония, бронхит или другое воспалительное заболевание, которое никак не поддается лечению обычными антибиотиками.

Лабораторная диагностика бруцеллеза

Существуют специальные лабораторные анализы, при помощи которых можно выявить возбудителя бруцеллеза. Однако их проведение возможно только в специально оборудованных лабораториях, так как выделение бруцелл в чистом виде представляет определенную опасность.

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических

антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции

связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),

пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба - РБП) и в молоке

коров - кольцевой реакции (КР).

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при

диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,

собак, пушных зверей и животных других видов.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от

больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА

и РСК и дату изготовления;

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием

или полученная в лаборатории;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);

раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,

верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и

антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида

натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов - 5-процентный

и оленей - 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации.

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:

при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак - 1:25, 1:50, 1:100 и

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов - 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

пушных зверей и морских свинок - 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или

групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках

первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,

лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл

соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови

овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего

раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок

берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).

Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда

штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,

четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из

пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго

и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках

третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления

переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда - в пятый. Из пробирок

пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные

разведения одновременно 10 сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными

сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего

устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим

раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке

удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,

1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества

сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты

реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)

или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток

овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,

разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения

сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят

с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;

с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками

осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 - 38 °С на 16 - 20 часов, затем выдерживают

при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в

крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) - полное просветление жидкости, микробные тела

осели на дно пробирки в виде "зонтика", при легком

встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья и

а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный

"зонтик" (75% агглютинации);

++ (2 креста) - просветление жидкости, "зонтик" умеренно выражен

+ (1 крест) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик"

слабо, при встряхивании заметно небольшое

хлопьев или комочков (25% агглютинации);

- (знак минус) - просветления жидкости и образования "зонтика" не

наступило, на дне пробирки виден "пунктик" осевших

микробов антигена, при легком встряхивании

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла

агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц

(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,

1:200 - 200 ME и т.п.).

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,

соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем

в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного

физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания

пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по

0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50

и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.

Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате

одновременно с основной реакцией.

Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем

сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.

При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие

агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,

исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного

рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME - международных единиц

антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак - с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских

свинок - с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с

сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с

сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.

При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного

исследуют повторно через 3 - 4 недели.

На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет

получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая

оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)

сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах

(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или

более - "положительная 100 ME"; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более -

"сомнительная 50 ME").

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его

годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного

связывания комплемента на холоде (РДСК).

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного

рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо

РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике

инфекционного эпидидимита баранов.

4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная

от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике

или полученная в лаборатории.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной

бане в день постановки реакции: для РСК - при 60 - 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов

и мулов - при 64 - 65 °С, буйволов - при 62 - 64 °С в течение 30 мин., свиней - при 60 - 62° в течение

50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов - при 63 - 64 °С в течение 30 мин.;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,

указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);

комплемент - сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%

борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей

или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента

проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N

Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на

этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для

проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну

пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для

титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 - 4 °С;

гемолитическая сыворотка (гемолизин) - для РСК в удвоенном титре, для РДСК - в утроенном.

Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой

новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);

эритроциты барана - 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе

для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и

гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в

термостате при 37 °С в течение 15 - 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь

физиологический раствор - 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в

дистиллированной воде рН = 7,3 - 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и

кальция (см. Приложение N 2, п. 2).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции

и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦ - ¦ -

¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ - ¦ 0,2 ¦ - ¦ -

¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ - ¦ - ¦ 0,4 ¦ -

¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2

¦ Физиологический раствор ¦ - ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2

¦ водяная баня 10 минут при 37 -

¦ Результат: гемолиз полная задержка

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и

4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.

Реакцию проводят в водяной бане при 37 - 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента -

сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической

системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,

которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.

Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл

физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в

два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в

возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой

пробирке) количество физиологического раствора.

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл

антигена в рабочем разведении, а во второй ряд - по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки

ставят в водяную баню при 37 - 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл

гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной

Разнообразные клинические проявления бруцеллеза приводят к необходимости широкого использования лабораторных методов исследования: бактериологического, биологического, сероло­гического и аллергического. Комплекс лабораторных исследований с обязательным учетом клинических, эпидемиологических и эпизоотологических данных обеспечивает правильную диагностику заболевания.

Бактериологический метод.Для исследования на бруцеллез в лабораторию поступает патологический материал от больных людей (кровь, мокрота, гной, суставная жидкость, пунктат из селезенки, моча), сельско­хозяйственных животных (абортированный плод, лимфатические узлы, паренхиматозные органы, кровь, моча, молоко, молочные продукты) и различные объекты окружающей среды (вода, навоз). Материал для исследования забирают в стерильную посуду.

Исследование крови необходимо проводить во время лихо­радочного состояния больного до лечения антибиотиками, так как в этот период наблюдается наибольший процент выделения культур. Кровь в количестве не менее 10 мл стерильно берут из локтевой вены и засевают по 5 мл в два флакона среды Кастанеда. Начиная с четвертого дня, посевы ежедневно просматривают и, при отсутствии роста культуры, поверхность агара орошают бульоном путем осторожного покачивания фла­кона. При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца роста бруцелл не обнаруживают, то делают контрольный высев из бульона среды Кастанеда на твердую питательную среду.

При обследовании людей на бруцеллез для удобства доставки флаконов с кровью можно пользоваться транс­портной жидкой средой, которую готовят заранее и хранят в лаборатории в течение полугода. Кровь доставляют в лабораторию в транспортной среде, засевают на среду Каста­неда и исследуют по общепринятой схеме.

Бруцеллы можно выделить из костного мозга, мочи, спинно­мозговой жидкости, грудного молока, желчи, мокроты, трупного материала и т. д. Исследуемый материал по 0,1 мл засевают на плас­тинки питательного агара и по 5-10 мл на жидкие питатель­ные среды. Для задержки роста посторонней микрофлоры при исследовании загрязненного материала к среде добавляют генцианвиолет (1:200 000) или антибиотики (пенициллин 0,25 ед/мл и стрептомицин 0,05 ед/мл).

Особого внимания заслуживает получение культуры из моло­ка сельскохозяйственных животных. Забор молока у овец, коров, верблюдов и коз рекомендуется проводить путем сдаивания его последних порций из каждого соска вымени по 10 мл в стерильную посуду. Если исследовать молоко в течение первых суток не удается, то его консервируют добавлением сухой борной кислоты 1 %, генцианвиолета 1:25 000. Для исследования молока из больших емкостей забирают 100 мл верхнего слоя, затем перемешивают и набира­ют еще 100 мл.

Лучшие результаты дает посев сливок, полученных центри­фугированием молока при 2,5-3 тыс. об/мин в течение 3-5 мин или путем отстаивания в течение одних суток в холо­дильнике. Сливки в количестве 0,1-0,2 мл засевают на твердую питательную среду с подавителем посторонней микрофлоры (4-6 пробирок на 1 пробу).

Бактериологический метод считается самым достоверным, т. к. выделение бруцелл является неопровержимым доказа­тельством бруцеллезной инфекции. Отрицательные результаты бактериологического исследования не дают права для заключе­ния об отсутствии заболевания.

Биологический метод.Для выделения бруцелл из материала, загрязненного посто­ронней микрофлорой или содержащего малые концентрации возбудителя, в качестве биологической пробы используют морских свинок (весом 250-300 г) или белых мышей (весом 17-18 г). Исследуемый материал в объеме не более 0,5 мл вводят под­кожно в паховую область белой мыши и 1 мл морской свинке.

Вскрытие белых мышей производят через 20-25 дней, а мор­ских свинок - через 30-35 дней после введения материала. Перед вскрытием у свинок кровь из сердца исследуют в реакции агглютинации. Для посевов у морских свинок берут лимфатические узлы (паховый, подчелюстной, шейный, парааортальный), кусочки селезенки, печени, костный мозг, кровь, мочу; у белых мышей - лимфатические узлы (пахо­вый, аксиллярный, парааортальный, подчелюстной), кусочки селезенки и печени. Лимфатические узлы, кусочки печени и селе­зенки помещают в стерильную чашку. Костный мозг извлекают пипеткой из рассеченной бедренной кости. Посевы крови из сердца, мочи и костного мозга производят стерильной пипеткой непосредственно на питательную среду (агар и бульон). Лимфа­тические узлы и органы перед посевом надсекают ножницами, берут стерильной деревянной палочкой, вносят первоначально в пробирку с агаром, раздавливают и тщательно втирают мате­риал в поверхность питательной среды. Затем остатки посевного материала переносят в пробирку с бульоном. Палочка должна быть длиной 25-30 см, диаметром 4-5 мм, хорошо отструганная, с несколько заостренным концом. После использования ее погру­жают на 1 час в дезраствор.

Все посевы дублируют (часть помещают в условия повышен­ного содержания углекислоты), выдерживают при 37 °С до 30 дней. Для предотвращения высыхания питатель­ных сред пробирки заливают парафином или закрывают резино­выми колпачками.

Посевы просматривают каждые 3-4 дня. Из помутневших бульонов делают высев в пробирки со скошенным агаром. Коло­нии бруцелл на пластинчатом агаре становятся видимыми на 5-7 сутки, иногда позднее. По истечении 30 дней наблюдение прекращают. Если за это время рост не появился, посевы уничто­жают, а результаты бактериологического исследования считают отрицательными.

Результат оценивают положительно при выделении хотя бы одной колонии бруцелл. Идентификацию возбудителя бруцеллеза проводят по: по характеру роста культуры на плотных питательных средах; морфологии микроба в мазках, окрашенных по Граму, Козловскому; агглютинации со специфической бруцеллезной сывороткой на стекле и объемным методом; свечению на 3-4+ культур, обработанных бруцеллез­ной люминесцирующей сывороткой.

Культуры предварительно проверяют на наличие признаков диссоциации, одним из перечисленных выше методов.

Дифференциации (определение видов и биоваров) подлежат культуры в S-форме после идентификации.

Подкомитетом по таксономии бруцелл Международного комитета номенклатуры бактерий и Объединенным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу в 1972 г. были определены единые тесты для проведения идентификации и дифференциации бруцелл для всех стран мира.

Серологические и аллергические методы исследования на бруцеллез.Серологические реакции и аллергическая проба являются общедоступными методами и применяются для диагностики бруцеллеза наряду с бактериологическим и биологическим методами.

В случае малой обсемененности пробы и отрицательных результатов, полученных при посеве исследуемого материала на питательные среды и заражении лабораторных животных, серологический метод может быть единственным, позволяющим диагностировать бруцеллез. В зависимости от целей исследования используют те или иные серологические методы.

При проведении эпидемиологического исследования в очагах применяют реакцию агглютинации пластинчатую (Хеддльсона) и объемную (Райта), реакцию Кумбса, РСК, РДСК, РПГА, кожную аллергическую пробу, иммуноферментный анализ (ИФА). Перед профилакти­ческой вакцинацией населения можно ограничиться постанов­кой пластинчатой реакции агглютинации (Хеддльсона) и кожной аллергической пробы.

Для диагностики острого и подострого бруцеллеза ставят реакцию Хеддльсона, Райта и РПГА. В случаях отрицательного результата используют реакцию Кумбса.

При диагностике хронического бруцеллеза и проведении диспансерного наблюдения за переболевшими рекомендуют наряду с реакциями Хеддльсона, Райта, РПГА, использовать реакцию Кумбса и аллергическую пробу (Бюрне).

Серологические реакции и аллергическая кожная проба по своему диагностическому значению в различные периоды заболевания не равноценны, вследствие чего не могут заменить друг друга. Это обусловливает необходимость применения комплексного серологического метода, являющегося наиболее надежным способом диагностики бруцеллеза.

В ранние сроки от начала заболевания (первые 6 месяцев) диагностическая ценность серологического метода выше, чем аллергического. Серологические реакции в этот период оказы­ваются положительными почти в 95 % случаев. По мере удлине­ния срока заболевания процент положительных серологических реакций начинает снижаться. При проведении обследования необходимо учитывать, что высокие титры антител всегда указывают на наличие инфекции, антитела в низких титрах или их полное отсутствие не исключает возможности заболевания. В связи с этим рекомендуется про­водить повторные исследования с интервалом 1-2 недели, особенно при подозрении на острую форму бруцеллеза.

Для постановки диагноза бруцеллеза у крупного рогатого скота применяют серологические и аллергические методы. Обследование начинают с постановки роз-бенгал пробы (РБП). Сыворотки, с которыми получена положительная РПБ, исследуют в РА Райта, РСК (РДСК), РПГА для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих анти­тел. Исследование проводят двукратно с промежутком в 30 дней.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Занятие 3.

Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; Нарушение авторского права страницы