Индикация возбудителя сибирской язвы

Сибирская язва - острая антропонозная инфекцион­ная болезнь, вызываемая Bacillus anthracis, харак­теризуется тяжелой интоксикацией, поражением кожи, лимфатических узлов.

Таксономия. Возбудитель относится к отделу Firmicutes, роду Bacillus.

Морфологические свойства. Очень крупные грамположительные палочки с обрубленными концами, в мазке из чистой куль­туры располагаются короткими цепочками (стрептобациллы). Неподвижны; образуют расположенные центрально споры, а также капсулу.

Культуральные свойства. Аэробы. Хорошо растут на простых питательных средах в диа­пазоне температур 10—40С, температурный оптимум роста 35С. На жидких средах дают придонный рост; на плот­ных средах образуют крупные, с неровными краями, шерохо­ватые матовые колонии (R-форма). На средах, содер­жащих пени­циллин, через 3ч роста си­биреязвенные бациллы образу­ют сферопласты, расположен­ные цепочкой и напоминаю­щие в мазке жемчужное ожерелье.

Биохимические свой­ства. Ферментативная актив­ность достаточно высока: воз­будители ферментируют до кислоты глюкозу, сахарозу, мальтозу, крахмал, инулин; обладают протеолитической и липолитической активностью. Выделяют желатиназу, обладают слабой гемолитической, лецитиназной и фосфатазной активностью.

Выделяют желатиназу, проявляют низкую гемолитическую, лецитиназную и фосфатазную активность.

Антигены и факторы патогенности. Содержат родовой соматический полисахаридный и видовой белковый капсульный антигены. Образуют белковый экзотоксин, обладающий антигенными свойствами и состоящий из нескольких компонентов (летальный, протективный и вы­зывающий отеки). Вирулентные штаммы в восприимчивом организме синтезируют сложный экзотоксин и большое количество капсульного вещества с выраженной антифагоцитарной активнос­тью.

Резистентность. Вегетативная форма неустойчива к фак­торам окружающей среды, споры чрезвычайно устойчи­вы и сохраняются в окружающей среде, выдержи­вают кипячение. Чувствительны к пенициллину и другим антибиотикам; споры устойчивы к антисептикам.

Эпидемиология и патогенез. Источник инфекции — больные животные, чаще крупный рогатый скот, овцы, свиньи. Человек заражается в основном контактным путем, реже али­ментарно, при уходе за больными животными, переработке животного сырья, употреблении мяса. Входными воротами инфекции в большинстве случаев явля­ются поврежденная кожа, значительно реже слизистые оболоч­ки дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. В основе патогенеза лежит действие экзотоксина, который вызывает коагуляцию белков, отек тканей, приводят к развитию токсико-инфекционного шока.

Клиника. Различают кожную, легочную и кишечную формы сибирской язвы. При кожной (локализованной) форме на месте внедрения возбудителя появляется характерный сибиреязвенный карбункул, сопровождается отеком. Легочная и кишечная формы относятся к генерализованным формам и выражаются геморрагическим и некротическим поражением соответствующих органов.

Иммунитет. После перенесенной болезни развивается стой­кий клеточно-гуморальный иммунитет.

Микробиологическая диагностика:

Наиболее достоверным методом ла­бораторной диагностики сибирской язвы является выделение из исследуемого материала культуры возбудителя. Диагностическую ценность представляют также реакция термопреципитации по Асколи и кожно-аллергическая проба.

Бактериоскопическое исследование. Изучение окрашенных по Граму мазков из патологического материала позволяет обнаружить возбудителя, представляющего собой грамположительную крупную неподвижную стрептобациллу. В организме больных и на белковой питатель­ной среде микроорганизмы образуют капсулу, в поч­ве— споры.

Бактериологическое исследование.Исследуемый материал за­севают на чашки с питательным и кровяным агаром, а также в пробирку с питательным бульоном. Посевы инкубируют при 37С в течение 18ч. В бульоне В. anthracis растет в виде хлопьевидного осадка; на агаре вирулентные штаммы образуют колонии R-формы. Авирулентные или слабовирулентные бактерии образуют S-формы ко­лоний.

Биопроба.Исследуемый материал вводят подкожно морским свинкам кроликам. Готовят мазки из крови и внутренних органов, делают посевы для выделения чистой культуры возбудителя.

Экспресс-диагностикапроводится с помощью реакции термо­преципитации по Асколи и иммунофлюоресцентного метода.

Реакцию Асколи ставят при необходимости диагности­ровать сибирскую язву у павших животных или у умерших людей. Образцы исследуемого материала измельчают и кипятят в пробирке с изотоническим раствором хлорида натрия в течение 10 мин, после чего фильтруют до полной прозрачности.

Метод иммунофлюоресценции позволяет выявить капсульные формы В. anthracis в экссудате. Мазки из экссудата через 5—18 ч после заражения животного обрабатывают капсульной сибиреязвенной антисывороткой, а затем флюоресцирую­щей антикроличьей сывороткой. В препара­тах, содержащих капсульные бациллы, наблюдается желто-зеле­ное свечение возбудителя.

Кожно-аллергическая проба.Ставится на внутренней по­верхности предплечья — внутрикожно вводят 0,1 мл антраксина. При положительной реакции через 24 ч появляются гиперемия и инфильтрат.

Лечение: антибиотики и сибире­язвенный иммуноглобулин. Для антибактериальной терапии препарат выбора – пенициллин.

Профилактика. Для специфической профилактики исполь­зуют живую сибиреязвенную вакцину. Для экстренной профилактики назначают сибиреязвенный иммуноглобулин.

Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка.Получена из крови кролика, гипериммунизированного культурой В. anthracis. Применяется для постановки реакции термопреципитации по Асколи.

Сибиреязвенная живая вакцина СТИ.Высушенную взвесь живых спор В. an­thracis авирулентного бескапсульного штамма. Применяется для профилактики сибирской язвы.

Противосибиреязвенный иммуноглобулин.Гамма-глобулиновая фракция сыворотки крови лошади, гипериммунизированной живой сибиреязвенной вакциной и вирулентным штаммом В.anthracis, используется с профилактической и лечебной целью.

Антракс (лат. наименование - Anthrax) или сибирская язва, остро-контагиозное, инфекционное заболевание протекающее с явлениями септицемии и проявляющееся карбункулами различной величины. Восприимчивы все виды животных и человек (антропозооноз). Регистрируется во всех странах мира.

Этиология

Возбудителем сибирской язвы является неподвижная, грамположительная, аэробная, спорообразующая палочка Вaccillus anthracis. Длинна возбудителя 5-8 мкм, толщина 1-1,5 мкм. В мазках из патологического материала бациллы располагаются одиночно или попарно, выделенные из чистой культуры — цепочкой. Наружные концы обрублены, внутренние закруглены.

Возбудитель имеет капсулу, которая чётко просматривается в свежем материале, далее она распадается и при микроскопии видны только следы.

Попадая во внешнюю среду, под действием кислорода, происходит спороорбразование. Спора десятилетиями может находиться вне организма животного и при этом сохранять свою патогенность.

Микроорганизм хорошо растёт на обычных питательных средах. На МПА образовывает бело-серые, плоские, шероховатые колонии с неровными краями. На МПБ на дне пробирки напоминает кусочек ваты (рыхлый, туче-образный осадок). При посеве в косяк агаризированной среды рост напоминает ёлочку с вершиной внизу. На МПА с пенициллином, образовывает цепочку из шаров (жемчужное ожерелье).

При саморазложении трупа бациллы лизируются в течение 7-10 дней. Кипячение убивает моментально, прямой солнечный свет — в течение нескольких часов. Заморозка мяса при -15 ᵒC консервирует возбудителя до 15 дней, при -10 ᵒC до 24. Сухой жар при 140 ᵒC убивает через 2,5-3 часа, автоклавирование при2-х атм. через 10 мин, кипячение в растворе едкого натра через 20-30 минут.

Эпизоотология

Наиболее восприимчивы к сибирской язве сельскохозяйственные и дикие копытные животные. Домашние и дикие плотоядные менее восприимчивы. Возбудитель описан у более 40 видов млекопитающих.

Источник болезни больное животное выделяющие бациллы во внешнюю среду с мочой, слюной, фекалиями, кровью при состоянии агонии.

Фактором передачи является вскрытый труп и обсеменённая спорами внешняя среда (кожа, шерсть, инфицированные предметы ухода). При вынужденном дорезе (который строго запрещён) распространение патогена возможно на большие расстояния (задействованы люди, плотоядные животные, птицы).

При захоронении трупов в землю споры остаются патогенными на протяжении десятилетий. Раскопки способствуют выносу их на поверхность и возобновлению эпизоотической цепи.

Пути заражения: алиментарный (при поедании обсеменённых кормов и воды на пастбищах или кормов животного происхождения), трансмиссивный (кровососущими насекомыми), аэрогенный (вдыхание пыли содержащей споры).

Сибирская язва проявляет сезонность, и заражение происходит при пастбищном содержании. В стойловый период возможны единичные случаи, причиной которых являются контаминированные спорами корма.

Течение болезни во многом зависит от вирулентности возбудителя и резистентности организма животного. Размножение бациллы происходит в кровеносной и лимфатической системах. Микроорганизм подавляет фагоцитарную активность лейкоцитов и приводит к септицемии. Нарушение кислотно-щелочного равновесия в крови препятствует её свёртываемости и способствует быстрой гибели животного.

При заражении через кожные покровы микроорганизмы купируются и вызывают серозно-геморрагическое воспаление, которое проявляется карбункулёзной формой.

Симптомы

Продолжительность инкубационного периода от 1 до 3-х дней и зависит от резистентности животного и вирулентности бациллы.

По локализации процесса заболевание делят на кожную форму, ангинозную, кишечную, легочную.

Септические процессы могут дать начало карбункулёзной форме, а также смешанному течению.

Процессы могут проходить сверхостро (молниеносно). В этом случае клинически заболевание не диагностируется, поскольку наступает быстрый падёж. При этом отмечаются кровянистые выделения из носовой полости и ротовой, а также анального отверстия.

Острая форма проявляется резким повышением температуры тела до 42ᵒ C, угнетением, отказом от принятия корма, учащением пульса, прекращением лактации, цианозом слизистых оболочек, кровавым поносом. У крупного рогатого скота и овец наблюдаются признаки тимпании, у лошадей — колики. Нередко заболевание проявляется отёками в области шеи, гортани, подгрудка, живота. Гибель наступает через 2-4 дня.

Подостро заболевание развивается на протяжении 7-8 дней. Симптомы те же, что и при остром, но проявление их медленное, перемежающееся.

Хроническая форма может растянуться от1-го до 3-х месяцев. На фоне постепенного истощения животного проявляются отёки подчелюстного пространства, воспаление подчелюстных лимфатических узлов. Животное может выздоравливать, а может пасть и диагноз в таком случае будет установлен по патологоанатомической картине.

Карбункулёзная форма проявляется возникновением плотных, горячих и болезненных припухлостей. Чаще карбункулы возникают в области шеи и головы. С созреванием текстура припухлости становится твёрдой, затем мягкой, тестовидной, холодной. Омертвение начинается с центра.

Ангинозная форма характерна для свиней и часто протекает бессимптомно или с признаками фарингита, а диагностируется при вскрытии туши.

Кишечная форма сопровождается коликами, запорами сменяющимися поносами чаще с примесью крови.

Диагностика

Диагноз ставится на основании эпизоотологических данных, клинической картины, патологоанатомических изменений и лабораторных исследований.

При подозрении на сибирскую язву вскрывать трупы запрещено. Если вскрытие начато, то оно приостанавливается при первых же подозрениях. Для исследований отбирают ухо с той стороны, на котором лежит труп, и отправляют в лабораторию.

Если труп в стадии разложения, для диагностики отбирают кусочки кожи.

Обязательным для лабораторной диагностики является: микроскопия мазков-отпечатков, постановка реакции преципитации, посев на питательные среды, биопроба на лабораторных животных.

Дифференцировать сибирскую язву необходимо от пастереллёза, лейкоза, пироплазмоза, эмфизематозного карбункула КРС, брадзота овец, отравлений, солнечного удара.

Лечение

Для лечения применяется сибиреязвенная сыворотка, сибиреязвенный гамма-глобулин в комбинации с инъекциями антибиотиков (бициллин, пенициллин, стрептомицин). При карбункулёзной форме используется противовоспалительная терапия.

Профилактика

Все случаи антракса строго контролируются. На хозяйство налаживается карантин и объявляется неблагополучным. Мероприятия проводятся исключительно в согласовании с ветеринарным законодательством.

Подозрительных животных изолируют и лечат. Трупы сжигают. Проводят дезинфекционные мероприятия помещений и прилегающей территории. Естественный иммунитет образовывается после выздоровления и является достаточно стойким.

Для иммунизации сельскохозяйственных животных используются живые споровые жидкие вакцины против сибирской язвы, согласно с наставлением по применению. Иммунитет образовывается на протяжении 10 дней и длится в течение 12 месяцев.

Для предотвращения возникновения очагов необходимо соблюдать правила захоронения трупов и утилизации боенских отходов. Осуществлять постоянный надзор за транспортировкой и перемещением животных, переработкой сырья, санитарным состоянием животноводческих ферм и пастбищ. Проводить постоянный лабораторный контроль земли со скотомогильников.

Все виды обследования, вакцинации и лечения Вашего питомца, в том числе экстренная помощь и госпитализацию Вашего питомца.

КРУГЛОСУТОЧНО:
+7 495 532 89 00
(многоканальный)
WatsApp / Viber
+7 925 584 75 71

Токсокароз - зоонозное заболевание, вызванное паразитированием круглых червей и характеризующееся…

Саркома - новообразование, которое характеризуется инфильтративным ростом клеток соединительной…

Фавус (парша) - заболевание грибковой природы, характеризующееся поражениями кожных покровов,…

Травмы головного мозга - патологическое состояние животного, проявившееся в результате механических…

Лишай - собирательное понятие заболеваний наружного покрова тела животного вызванного микроскопическими…

Тепловой удар и солнечный - острое расстройство функций центральной нервной системы в результате…

Тонзиллит - воспалительный процесс, проходящий в нёбных миндалинах, лимфоидных образованиях…

Туляремия - инфекционная болезнь бактериальной природы. Заболеванию подвержены сельскохозяйственные…

Хориоптоз - инвазионное заболевание вызываемое клещами-кожеедами рода Chorioptes. Заболеванию…

Чума крупного рогатого скота - вирусное, высоко контагиозное заболевание, имеющее острое течение…

Блефарит - заболевание воспалительного характера затрагивающее края век. Подвержены болезни…

Синовит - воспалительный процесс проходящий в синовиальной мембране выстилающей капсулу сустава.…

Все виды обследования, вакцинации и лечения Вашего питомца, в том числе экстренная помощь и госпитализацию Вашего питомца.

КРУГЛОСУТОЧНО:
+7 495 532 89 00
(многоканальный)
WatsApp / Viber
+7 925 584 75 71

Больше половины от всех кошек с аллергией, животные страдают от проявлений пищевой аллергии.…

Особенностью вируса иммунодефицита кошек, является медленного развитие, постепенное изменение…

Необходимо внимательно следить за любыми изменениями в состоянии своего любимца, отмечая нарушения…

Пневмоторакс представляет серьезную опасность для жизни животного и без своевременного вмешательства…

Для домашних животных, куда большую опасность представляют моющие средства для окон, различные…

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выявления возбудителя сибирской язвы в низкой концентрации из объектов внешней среды. Способ включает подготовку материала, концентрирование его селективной сорбцией на магноиммуносорбентах путем встряхивания суспензии исследуемого материала и магноиммуносорбентов с концентрацией 5-6 мкл/мл в течение 15-20 мин, культивирование в селективной среде в присутствии ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры, в качестве которых используют смесь полимиксина и триметаприма в равных количествах с концентрацией смеси 23-25 мкг/мл, кипячение пробы в течение 1 ч, отделение супернатанта и последующее его исследование в полимеразной цепной реакции. Изобретение обеспечивает повышение надежности индикации микроорганизмов из объектов внешней среды, повышение его чувствительности.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано дня выявления возбудителя сибирской язвы в низкой концентрации в объектах внешней среды (почва, вода, смывы, сточные воды, воздух и др.).

Трудности индикации Bacillus anthracis в объектах внешней среды обусловлены не только низкой концентрацией, но и сходством его с другими видами аэробных спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus.

Традиционные методы индикации возбудителя сибирской язвы включают подготовку суспензии пробы, приготовление мазков, окрашивание их антиспоровой люминисцирующей сывороткой и микроскопию с использованием люминисцентного микроскопа. Чувствительность этого метода не превышает 10 5 спор/мл пробы и чаще всего недостаточна для обнаружения возбудителя в почве. Кроме того, даже адсорбированные люминисцирующие глобулины не дают 100% специфичности и могут давать ложноположительные результаты со спорами Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis (Буравцева Н.П. с соавт., 1998).

В последнее время интенсивно развиваются способы детекции возбудителей инфекционных заболеваний в биологическом материале и объектах внешней среды с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые позволяют обнаружить микроб с чувствительностью 10-100 м.к./мл в течение 5-6 ч.

В основе ПЦР лежит амплификация участка генома путем многократного копирования специфичной для данного микроорганизма нуклеотидной последовательности (Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Т.2. Саратов, 1998, с.162-169).

Индикация сибиреязвенного микроба в объектах внешней среды, например, почве, стоках и т.д., методом ПЦР затрудняется низкой концентрацией микроорганизмов, присутствием посторонней микрофлоры, наличием споровых форм, которые трудно поддаются лизированию, а следовательно получению ДНК, необходимой для проведения реакции.

Представляет интерес селективное концентрирование микроорганизмов магноиммуносорбентами. Известен набор устройств и приспособлений для различных манипуляций с магноиммуносорбентами (Пат. РФ 2098828, G 01 N 33/553, С 12 М 1/00, 10.12.97. Бюл. 34).

При селективном концентрировании микроорганизмов на магносорбентах с иммобилизированными на их поверхности специфическими антителами значительно повышается надежность и чувствительность индикации микроорганизмов в объектах внешней среды за счет реакции антиген-антитело.

Однако такие методы обнаружения могут использоваться для установления присутствия или отсутствия патогеннных бактерий, а для определения их эпидзначимости требуются дальнейшие исследования.

В клинической практике проведен ряд исследований по объединению иммуномагнитной сорбции и полимеразной цепной реакции с последующей гибридизацией ДНК-зондом для обнаружения бактерий в патологическом материале.

На магнитные носители наносятся специфические иммуноглобулиновые фракции или моноклональные антитела и инкубируются в бактериальных суспензиях.

Носители со связанными антигенами подвергаются кипячению и в супернатанте амплифицируются ДНК-мишени с последующей идентификацией специфических фрагментов (Oral. MicrobioL Immunol. 1997, Oct. 15, р. 311-317; J. Glin. Microbiol. Immunol., 1995, Nov.11, pp.2908-2912; PCR Methods Appl, 1992, Nov. 2, pp. 167-171; J. Clin. Microbiol, 1992, Nov. 306, pp. 2801-2806).

При использовании этого способа на 7 часов, по сравнению с традиионным, сократилось время проведения анализа. Повысилась чувствительность и специфичность индикации. Например, при исследовании испражнений на наличие Bacterioides forsythus иммунофлуоресцентным методом положительная реакция отмечалась в 62% случаев, а при использовании сочетанного применения магноиммуносорбции, ПЦР 4 и гибридизацией ДНК-зондами в 82%.

Однако использование этого метода при индикации возбудителя сибирской язвы не обеспечивает достаточной надежности и чувствительности при выявлении его в объектах внешней среды, что обусловлено наличием спор и сопутствующих спорообразующих микроорганизмов.

Наиболее близким к заявляемому является способ индикации Bacillus anthraсis с использованием полимеразной цепной реакции (Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Т.1, Саратов, 1998, с.77-79). Согласно этому способу исследуемый материал, сконцентрированный путем фильтрации в объеме 0,1-1,0 мл засевается в 5 мл бульона Хоттингера рН 7,2-7,3 и подращивается при 37 o С в течение 3 ч. Затем в бульон вносится пенициллин до конечной концентрации 1000 ед/мл и инкубируется еще 1 ч. После этого 0,5-1,0 мл содержимого переносится в пробирку типа "Eppendorf" и центрифугируется 20 мин при 6-8 тыс. об/мин. Надосадочная жидкость отбирается для проведения ПЦР.

После амплификации по программе, соответствующей праймерам продукт в объеме 10 мкл, наносится в гнезда 1,5% агарозного геля и подвергается электрофорезу при напряжени 60-100 V в течение 15-45 мин. Параллельно с исследуемыми образцами ставятся контроли: положительный с ДНК Bacillus anthracis и отрицательный со стерильной деионизированной водой. После окрашивания геля бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в течение 30 мин просматривают гель в ультрафиолетовых лучах. Положительным результатом является наличие полос ДНК с такой же электрофоретической подвижностью, как в положительном контроле и отсутствие таковых в отрицательном.

Недостатком способа-прототипа является недостаточная надежность индикации микроорганизмов из объектов внешней среды при их низкой концентрации (до 10 м.к./мл), наличии спор сапрофитов и другой сопутствующей микрофлоры.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение надежности индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды при его низкой концентрации за счет повышения чувствительности способа и его ускорения.

Технический результат достигается тем, что способ включает подготовку исследуемого материала, концентрирование его селективной сорбцией на магноиммуносорбентах путем встряхивания суспензии исследуемого материала и магноиммуносорбентов с концентрацией 5-6 мкл/мл в течение 15-20 мин, культивирование в селективной среде в присутствии ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры, в качестве которых используется смесь полимиксина и триметаприма в равных количествах с концентрацией смеси 23-25 мкг/мл, кипячение пробы в течение 1 ч, отделение супернатанта и последущее исследование в ПЦР.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Сорбция исследуемого материала на магноиммуносорбентах при встряхивании в течение 15-20 мин с концентрацией магноиммуносорбентов 5-6 мкл/мл, что обеспечивает достаточно полный селективный отбор микроорганизмов из исследуемого материала при его низких концентрациях за счет образования комплекса антиген-антитело.

Культивирование пробы в селективной среде в течение 1,5-2,0 ч, содержащей в качесве ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры смесь полимиксина и триметаприма в концентрации 23-25 мкл/мл, позволяет получать культуру Bacillus anthracis в вегетативной форме, которая в отличие от споровой легко лизируется и обеспечивает выход ДНК сибиреязвенного микроба при минимальном присутствии ДНК сопутствующих микроорганизмов, что в конечном счете дополнительно повышает чувствительность и специфичность индикации возбудителя сибирской язвы.

Возможность практического использования заявляемого способа подтверждается примерами его конкретного выполнения.

Пример 1. Исследуемый материал, концентрированный путем фильтрации в объеме 0,1-1,0 мл. Засевали в 5 мл бульона Хотгингера, рН 7,2-7,4, и подращивали в термостате при 37 o С в течение 3 ч. Затем в бульон добавляли пенициллин до конечной концентрации 1000 ед/мл и продолжали инкубировать еще 1 ч, после чего 0,5-1,0 содержимого переносили в пробирки типа "Eppendorf" и центрифугировали 20 мин при 6-8 тыс. об/мин. Для постановки ПЦР использовали надосадочную жидкость.

Возможны следующие варианты постановки ПЦР: а) для выявления фрагмента 256 п.н. гена cap В с праймерами C1 C2 и фрагмента 407 п.н. гена pag с с праймерами Р1 и Р2.

Реакционная смесь содержала по 12 пМ праймеров, 8 мМ смеси dNTP, 1,5 мМ MgCl₂, 1 ед. Taq-полимеразы и 5-10 мкл исследуемого материала. Программа амплификации: 30 циклов 92 o С - 1 мин, 46 o С - 1 мин, 70 o С - 1 мин (И.И. Тучков, А.Н. Куличенко, И.Г. Дроздов, 1994).

б) для выявления фрагмента хромосомы 152 п.н. с праймерами R1 и R2. Реакционная смесь содержала 0,5 мкМ праймеров, 200 мкМ смеси dNTP, 1,5 мМ MgCl₂, 1 ед. Taq-полимеразы и 5-10 мкл исследуемого мериала. Программа амплификации: предварительная денатурация при 94 o С - 1 мин, затем 40 циклов 94 o С - 1 мин, 60 o С - 1 мин, 72 o С - 1 мин (Patra e.a., 1995). Амплификация проводилась в термоциклере "Amply 250". Параллельно с образцами ставились контроли: положительый с ДНК Bacillus anthracis и отрицательный со стерильной деионизированной водой в количестве 5 мкл.

По завершении амплификации продукты в объеме 10 мкл наносилсь в гнезда 1,5% агарозного геля и подвергались электрофорезу при 60-120 V в течение 15-45 мин. После окрашиваня геля бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в течение 30 мин просматривали гель в УФ лучах.

Чувствительность метода составила 2000 спор в 1 мл суспензии почвы.

Пример 2. Вытяжку из почвы контаминировали спорами Bacillus anthracis с содержанием 10, 50, 100, 250, 500, 1000 и 2000 м.к./мл, добавляли 5 мкл/мл 10% суспензии сибиреязвенных магноиммуносорбентов и выдерживали 20 мин при комнатной температуре при периодическом встряхивании. Затем магноиммуносорбенты отмывали, переносили в пробирку типа "Eppendorf" с 1 мл бульона Хоттингера и инкубировали при 37 o С в течение 2 ч.

Пробы после подращивания лизировали кипячением в течение 1 ч, центрифугировали и исследовали в ПЦР с праймерами R1 и R2 к хромосомальной последовательности Ва 813 и праймерами P1, P2, C1, C2 к последовательностям к плазмидным генам pag и cap. Амплификацию проводили в термоциклере "Perkin Elmer 2400". Параллельно ставили положительный контроль с ДНК Bacillus anthracis и отрицательный со стерильной деионизированной водой.

Для праймеров к плазмидной последовательности (Р1, P2, C1, C2) реакционная смесь содержала: Н₂O до конечного объема 25 мкл, 2,5 мкл x 10 реакционного буфера, 1,5 мМ MgCl₂, 0,4 мкл BSA, 8 мМ смеси dNTP, 1 мкл праймеров, 5 мкл исследуемой ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы. Программа амплификации: 30 циклов, 92 o С - 30 с, 46 o С - 30 с, 72 o С - 30 с.

Для выявления хромосомальной последовательности Ва 813 с праймерами R1 и R2 реакционная смесь содержала: Н₂О до конечного объема 25 мкл, 2,5 мкл. х10 реакционного буфера, 1,5 мкл. MgCl₂, 1 мкл. BSA, 200 мкМ смеси dNTP, по 0,5 мМ праймеров, 5,0 мкл исследуемой ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы. Программа амплификации: предварительная амплификация 94 o С 5 мин, затем 40 циклов; 94 o С - 30 с, 60 o С - 30 с, 72 o С - 30 с.

После проведения амплификации продукты в объеме 10 мкл наносились в гнезда 1,5% агарозного геля и подвергались электрофорезу при напряжении 90-100 V в течение 20-45 мин. Предварительно окрашенный бромистым этидием гель просматривался в ультрафиолетовых лучах.

Чувствительность данного метода составила 500 спор в 1 мл суспензии почвы при одновременном определении детерминант вирулентности.

В работе использовали магноиммуносорбенты, приготовленные на основе аллюмосиликата и адсорбированного на нем сибиреязвенного иммуноглобулина (Пат. РФ. 2138813, G-01, 33/543 от 27.09.99. Бюл. 27).

Пример 3. Проводится аналогично примеру 2, за исключением того, что подращивание исследуемого материала, адсорбированного предварительно на магноиммуносорбенты, проводилось на селективную среду, состоящую из бульона Хоттингера, к которому в качестве ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры была добавлена смесь полимиксина и триметаприма.

При учитывании результатов ПЦР чувствительность метода составила 50 спор в 1 мл суспензии почвы.

Как показали экспериментальные исследования, заявленные режимы концентрирования и инкубирования исследуемой культуры выбраны оптимально. Уменьшение концентрации магноиммуносорбентов менее 5 мкл/мл и времени перемешивания менее 15 мин снижает чувствительность способа, увеличение же этих параметров нецелесообразно. Уменьшение времени культивирования менее 1,5 ч и концентрации смеси ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры ниже 23 мкг/мл приводит к понижению чувствительности ПЦР при низкой концентрации возбудителя сибиреязвенной инфекции в объектах внешней среды. Увеличение указанных параметров нецелесообразно.

Способ индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды, включающий подготовку исследуемого материала и его концентрирование, посев материала в питательную среду, культивирование, кипячение пробы в течение 1 ч, отделение супернатанта и его исследование в полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что концентрирование исследуемого материала осуществляют селективной сорбцией на магноиммуносорбентах путем встряхивания суспензии исследуемого материала и магноиммуносорбентов с концентрацией 5-6 мкл/мл в течение 15-20 мин, отмывкой в магнитном поле стерильным физиологическим раствором, культивирование проводят в селективной среде в течение 1,5-2,0 ч с использованием в качестве ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры смесь полимиксина и триметаприма в равных количествах с концентрацией смеси 23-25 мкг/мл.

Глава 30. Возбудитель сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis включен в семейство Bacillaceae, род Bacillus. Название болезни - "углевик" дано русским врачом Андриевским, который в конце XVIII века изучал это заболевание в Сибири во время большой эпизоотии среди коров.

Возбудитель сибирской язвы был открыт Паллендером в 1849 г. Большой вклад в изучение этого заболевания внесли Р. Кох, Л. Пастер и Л. С. Ценковский.

Морфология. Возбудители сибирской язвы - крупные палочки 6-8 × 1-1,5 мкм с обрубленными или несколько вогнутыми концами. Грамположительны. В организме они располагаются попарно или в виде коротких цепочек. На питательных средах встречаются длинные цепочки. Бациллы сибирской язвы неподвижны. В организме образуют капсулу, окружающую одну, две особи или всю цепочку. Бациллы сибирской язвы образуют споры овальной формы, расположенные в центре и не превышающие поперечника микробной клетки. Спорообразование лучше всего происходит при доступе кислорода и температуре 30-40° С. При температуре выше 43° С и ниже 15° С спорообразование прекращается. В период образования спор цитоплазма клетки почти полностью лизируется, клеточная стенка разрывается и спора выходит наружу (рис. 47).

Рис. 47. Морфологические и культуральные свойства возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis). а - В. anthracis (в крови мыши); б - образование капсул; в - споры; г - рост колонии; д - рост культуры на МПБ; е - рост культуры на желатине

Культивирование. Возбудители сибирской язвы - факультативные анаэробы. Неприхотливы. Растут при температуре 35-38° С и рН среды 7,2-7,6. На МПА образуют крупные колонии с неровными бахромчатыми краями (R-форма). От края колонии отходят пучки нитей. Вид колоний напоминает голову медузы или львиную гриву. R-форма является характерной для вирулентных штаммов сибиреязвенных бацилл. В старых культурах появляются гладкие S-формы колоний - не вирулентные.

В бульоне рост сибиреязвенных бацилл характеризуется придонным ростом. На дне пробирки образуется осадок в виде комка ваты, при этом среда остается прозрачной.

При посеве на 10-12% желатин после 2-3-дневной инкубации появляется рост по ходу укола в виде белых тяжей, уменьшающихся книзу (вид опрокинутой елочки).

При посеве возбудителей на МПА с пенициллином (на пластинчатом агаре) наблюдается распад бацилл на шары, цепь из которых напоминает жемчужное ожерелье. Характер роста на средах имеет диагностическое значение (см. рис. 47).

Ферментативные свойства. Сибиреязвенные бациллы обладают выраженной ферментативной активностью. Сахаролитические свойства: расщепляют глюкозу, лактозу, мальтозу, левулезу и другие сахара до образования кислоты.

Протеолитические свойства выражаются в пептонизации молока, разжижении желатина, свертывании молока (медленно). Они образуют сероводород и аммиак, переводят нитраты в нитриты, гидролизируют крахмал и т. д. Не гемолизируют эритроциты, чем отличаются от Вантракоида. Лизируются противосибиреязвенным фагом. Сибиреязвенные бациллы образуют ферменты: диастазу, пероксидазу, липазу.

Токсинообразование. В. anthracis образует токсин - протеиновый комплекс, содержащий отечный и летальные факторы. Этот токсин называют "мышиный токсин" (ввиду высокой чувствительности мышей). Большая роль в вирулентности сибиреязвенных бацилл принадлежит капсуле, которая связана с токсическим веществом.

Антигенная структура. Бациллы сибирской язвы содержат два антигена: 1) соматический (полисахаридный), который находится в клеточной стенке микроба. Термоустойчив. Против этого антигена антитела не продуцируются. Этот антиген длительно сохраняется в культурах и трупном материале. На его обнаружении основана реакция преципитации Асколи; 2) капсульный (протеиновый) антиген, обусловливающий антифагоцитарное действие.

Находясь в организме или на средах, содержащих экстракты тканей, бациллы сибирской язвы вырабатывают протективный термолабильный антиген, который является атоксичным, но обладает иммунизирующей способностью.

У сибиреязвенных бацилл имеется общий антиген с антракоидом и другими спорообразующими сапрофитами (В subtilis, B. cereus и др.).

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы возбудителей сибирской язвы малоустойчивы. При 100° С они погибают мгновенно, температура 55-60° С губит их через 30-40 мин. Обычные концентрации дезинфицирующих растворов убивают их через несколько минут. Капсулы сибиреязвенных бацилл обладают большой устойчивостью. При исследовании трупов животных, подвергнутых действию гнилостной микрофлоры, можно обнаружить пустые капсулы (тени). Споры устойчивы: они выдерживают кипячение на протяжении 15-20 мин. Автоклавирование (120° С) убивает их через 20 мин. К низким температурам не чувствительны. В сухом состоянии сохраняются до 30 лет, в почве - десятилетия.

Обычные растворы дезинфицирующих веществ губят их через 2-3 сут (табл. 46).

Таблица 46. Свойства возбудителей сибирской язвы

Примечание. B. anthracoides обладают слабой подвижностью, вызывают гемолиз эритроцитов, непатогенны для морских свинок.

Восприимчивость животных. К сибиреязвенным бациллам чувствительны коровы, овцы, лошади, олени, свиньи. Заражаются они друг от друга пищевым путем, поглощая с кормом споры возбудителя.

Из лабораторных животных наиболее восприимчивы белые мыши, морские свинки, кролики. Эти животные после заражения погибают через 2-4 сут от септицемии. На месте введения наблюдаются отек и гиперемия. Кровь у погибших животных густая и темно-красного цвета, так как сибиреязвенные бациллы обладают антикоагулирующим действием.

Источники заболевания. Больные животные.

Пути передачи. Контактно-бытовой, воздушно-пыльевой, пищевой (при использовании продуктов, зараженных бациллами сибирской язвы).

Человек от человека обычно не заражается, тем не менее при заболевании человека сибирской язвой принимаются все необходимые меры предосторожности.

Патогенез. Входными воротами являются кожа и слизистые оболочки дыхательных путей и пищеварительного тракта. В зависимости от локализации различают кожную, легочную и кишечную формы. Каждая форма может генерализоваться.

Кожная форма - в месте проникновения появляется покраснение, переходящее в папулу (зудящую). Папула медно-красного цвета переходит в везикулу с серозно-геморрагическим содержимым, после подсыхания образуется черный струп (углевик).

Легочная форма - развивается специфическая пневмония, протекающая по типу отека легких. Обычно заканчивается летально.

Кишечная форма - все вышеописанные явления развиваются в слизистой кишечника. Обычно заканчивается летально.

Иммунитет. Довольно стойкий, антимикробный и антитоксический. Зависит от образования протективных антител. Большая роль принадлежит фагоцитарной реакции. В сыворотке переболевших сибирской язвой обнаруживаются антитела, разрушающие капсульную субстанцию бацилл.

При сибирской язве развивается гиперчувствительность, регистрируемая в аллергической пробе с антраксином.

Профилактика. Все мероприятия по предупреждению сибирской язвы проводят совместно с ветеринарной службой Они предусматривают своевременное выявление, изоляцию больных животных, тщательную дезинфекцию территории.

Специфическая профилактика. В настоящее время используют вакцину СТИ, которая была изготовлена в 1942 г. Н. Н. Гинсбургом из бескапсульной культуры. Вакцинируют обычно людей, которые по характеру своей работы связаны с сельскохозяйственными животными. Для экстренной профилактики (людям, контактировавшим с больными) вводят противосибиреязвенный иммуноглобулин и антибиотики.

Лечение. Противосибиреязвенный иммуноглобулин, антибиотики: пенициллин, стрептомицин, тетрациклин.

1. Опишите морфологию возбудителя сибирской язвы.

2. Опишите культуральные свойства и какая форма: S или R является вирулентной?

3. Какими свойствами обладает сибиреязвенный токсин?

4. Пути передачи и формы заболевания сибирской язвой.

5. Какие факторы обусловливают иммунитет при сибирской язве.

Цель исследования: выявление возбудителей сибирской язвы и дифференциация его от антракоида, выявление антигенов возбудителя.

Работа с возбудителем сибирской язвы проводится в строго режимных условиях!

1. Содержимое везикул, карбункула, отторгнутый струп (кожная форма).

2. Мокрота (легочная форма).

3. Испражнения (кишечная форма).

4. Кровь (септическая форма).

5. Почва, шерсть животных (для постановки реакции Асколи).

Способы сбора материала

5. Реакция преципитации Асколи.

Первый день исследования

1. Посевы вынимают из термостата. Изучают рост на плотной и жидкой питательной среде. Колонии на плотной питательной среде изучают под микроскопом при малом увеличении. При наличии подозрительных колоний выделяют чистую культуру на скошенный МПА. Посевы инкубируют в термостате.

2. Из бульонной культуры (рост в виде комка ваты на дне, бульон прозрачный) делают висячую каплю (для установления неподвижности - дифференциации от антракойда).

3. Ставят тест "жемчужного ожерелья" (ускоренный метод исследования). С этой целью к бульону Хоттингера добавляют 30% инактивированной лошадиной сыворотки и пенициллин из расчета 0,5 ЕД на 1 мл бульона. Приготовленную среду разливают в пробирки по 2-3 мл и в каждую вносят 2 капли исследуемой бульонной культуры. Посевы инкубируют в термостате 3 ч при температуре 37° С. Затем вынимают их из термостата. Из каждой пробирки делают 2-3 мазка, высушивают на воздухе и фиксируют в жидкости Карнуа (6 частей этилового спирта + 3 части хлороформа + 1 часть ледяной уксусной кислоты). Фиксацию проводят до полного испарения жидкости. Полученные мазки окрашивают метиленовым синим и микроскопируют.

В мазках сибиоеязвенные бациллы обнаруживаются в виде цепи шаров, напоминающих жемчужное ожерелье - результат действия пенициллина.

4. Осматривают зараженных животных. Павших животных вскрывают, делают мазки и мазки-отпечатки, которые фиксируют, окрашивают и изучают под микроскопом. При наличии подозрительных палочек производят посевы на МПА и МПБ.

Вынимают посевы из термостата, делают мазки, микроскопируют. На МПА и МПБ бациллы сибирской язвы растут в виде бескапсульных особей. Производят посев на сахара, лакмусовое молоко, желатин, на чашки с 2% кровью и ставят пробу с сибиреязвенным бактериофагом. Посевы инкубируют в термостате.

Вынимают посевы из термостата и учитывают полученные результаты (см. табл. 46).

Исследование мокроты, испражнений и крови после специальной обработки ведут так же.

Для диагностики сибирской язвы используют аллергическую пробу с сибиреязвенным антигеном (антраксин). Для этого внутрикожно на внутренней поверхности предплечья вводят антраксин. Реакцию учитывают через 24-48 ч. Положительная реакция проявляется с первых дней заболевания.

Реакцию ставят для обнаружения специфического антигена бацилл сибирской язвы в шерсти животных, коже, трупах, почве и т. д.

Приготовление антигена: исследуемый материал измельчают в ступке, заливают 25-50-кратным объемом изотонического раствора натрия хлорида и кипятят (антиген термоустойчив). Полученный экстракт фильтруют через смоченную тем же раствором фильтровальную бумагу. Фильтрат-термоэкстракт - прозрачная жидкость. Для реакции используют преципитирующую сибиреязвенную сыворотку и для контроля сибиреязвенный антиген (рис. 48).

Рис. 48. Реакция Асколи. 1 - преципитирующая сыворотка + исследуемый термоэкстракт; 2 - преципитирующая сыворотка + стандартный сибиреязвенный антиген (контроль); 3 - преципитирующая сыворотка + антиген из шерсти здорового животного (чужеродный антиген); 4 - преципитирующая сыворотка + изотонический раствор хлорида натрия; 5 - нормальная сыворотка + испытуемый антиген

Постановка реакции: 1-я пробирка - преципитирующая сыворотка + исследуемый термоэкстракт;

2-я пробирка - преципитирующая сыворотка + стандартный сибиреязвенный антиген (контроль).

3-я пробирка - преципитирующая сыворотка + термоэкстракт из шерсти здорового животного (контроль).

При положительной реакции в первых двух пробирках образуется преципитационное кольцо, в третьей - кольцо отсутствует.

Реакция эта очень чувствительна (см. рис. 48).

МПА, МПБ, желатиновая среда (см. главу 7).

1. Какой материал используют для бактериологического исследования?

2. Основные методы микробиологического исследования.

3. Какие имеются ускоренные методы исследования? Как получить тест "жемчужного ожерелья?"

4. Каким методом можно выявить сибиреязвенные бациллы во внешней среде?

Нарисуйте схему лабораторного исследования сибирской язвы но дням.

Престижные индивидуалки согласны оттянуться в полный рост с вами предельно пышным отдыхом сексуального характера. Они изящные проститутки будут рады, если вы насвистите им в пустое время и посоветуйте увидеть друг друга.