Кольцевая проба с молоком на бруцеллез
ВНИМАНИЕ! САЙТ ЛЕКЦИИ.ОРГ проводит недельный опрос. ПРИМИТЕ УЧАСТИЕ. ВСЕГО 1 МИНУТА.
При заболевании коров бруцеллезом в молоке появляются антитела, которые при добавлении к молоку бруцеллезного антигена склеиваются (реакция агглютинации) и адсорбируются на жировых шариках.
Ход определения в пробирку диаметром 5-8мм наливают 1мл молока и 1 каплю цветного бруцеллезного антигена (взвесь бруцелл, окрашенных гематоксилином) и ставят в термостат при температуре 37°С на 40-45мин. Положительная реакция характеризуется появлением в верхнем слое жидкости кольца синего цвета, при сомнительной реакции -слабоокрашенного синеватого кольца, а при отрицательной - никаких изменений не наступает.
5. УИРС. Ветеринарно-санитарная оценка исследуемых проб молока с заполнением качественного удостоверения.
Контрольные вопросы
1. Отбор проб молока. Пороки молока.
2. Методы исследования молока.
3. Ветеринарно-санитарная оценка молока, полученного от животных, больных инфекционными болезнями (туберкулез, бруцеллез, лейкоз, ящур и др.).
4. Ветеринарно-санитарная экспертиза молока коров при незаразных болезнях и субклинических маститах.
Приложение
УДОСТОВЕРЕНИЕ О КАЧЕСТВЕ №
Выдано на молоко____________________________________________________ ,
предприятие-изготовитель, район, город
Наименование показателя | Результаты исследования |
1. Органолептическое исследование: | |
-запах | |
-цвет | |
-консистенция | |
-вкус | |
2. Лабораторные исследования | |
-опр. чистоты | |
-опр. кислотности | |
-опр. плотности | |
-опр. бактериальной обсемененности | |
-контроль пастеризации | |
-установление молока коров, больных маститом | |
3. контроль натуральности молока: | |
-опр. добавления воды | |
-опр. подснятия жира | |
-опр. двойной фальсификации | |
-реакция на формалин | |
-реакция на перекись водорода | |
-реакция на соду | |
-реакция на кровь и гной | |
-реакция на кетоновые тела | |
-реакция на антибиотики | |
-кольцевая проба на бруцеллез | |
Заключение: |
Показатели безопасности подтверждены сертификатом
Время отгрузки _________
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ НАДЗОР ___________________________________ Субъект Российской Федерации ___________________________________ Район (город) ___________________________________ Наименование учреждение | ФОРМА №2 Выдается ветеринарными врачами на животных (включая птиц, рыб, насекомых), а также биологические объекты, используемые для их размножения |
ВЕТЕРИНАРНОЕ СВИДЕТЕЛЬСТВО № 00 – 000000
Я, нижеподписавшийся ветеринарный врач, выдал настоящее ветеринарное свидетельство
(кому - наименование юридического лица или ФИО физического лица)
в том, что_______________________________________________________________
( наименование продукта или сырья животного происхождения согласно ГОСТ, ОСТ, ТУ)
в количестве ___________ ____________ _____________
(мест, штук, кг) (упаковка) (маркировка)
(наименование предприятия. Ф.И.О. владельца, адрес), (дата выработки) подвергнута ветеринарно-санитарной экспертизе в полном объеме изготовлена из сырья, прошедшего ветеринарно-санитарную экспертизу (ненужное зачеркнуть), и признана годной для
(реализации без ограничений, с ограничением - указать причины
или переработки согласно правилам ветсанэкспертизы)
(вид транспорта, маршрут следования)
(наименование и адрес (№ товаротранспортных документов)
Продукция подвергнута дополнительным лабораторным исследованиям
(наименование лаборатории, № экспертизы и результаты исследования)
_________________________________________________________________ (указываются эпизоотическое благополучие местности, дата и номер разрешений вышестоящего)
_____________________госветинспектора на вывоз продукции за пределы территории, перечисляются №№ клейм и др )
Свидетельство предъявляется для контроля при погрузке в пути следования и передается грузополучателю Копии свидетельства недействительны. При установлении нарушений порядка заполнения бланка свидетельство передается главному госветинспектору Субъекта российской Федерации по месту выхода груза с указанием выявленных нарушений
При исследовании молока кольцевой пробой на бруцеллез в пробирку диаметром 5 - 8 мм наливают 1 мл молока и 1 каплю цветного бруцеллезного антигена (взвесь бруцелл, окрашенных гематоксилином) и ставят ее в термостат при температуре 37 град. C на 40 - 45 минут. Положительная реакция характеризуется появлением в верхнем слое жидкости кольца синего цвета, при сомнительной реакции слабо окрашенное синеватое кольцо, а при отрицательной - никаких изменений не наступает.
ФАЛЬСИФИКАЦИЯ МОЛОКА И МЕТОДЫ ЕЁ ВЫЯВЛЕНИЯ
Контроль пастеризации молока
Проба на пероксидазу:
В пробирку наливают 5 мл пастеризованного молока, добавляют 5 капель р-ра крахмального КСl и 5 капель 0,5 % р-ра перекиси водорода. Содержимое перемешивают. Если цвет содержимого пробирки не изменился, то молоко пастеризовано правильно. Окрашивание содержимого пробирки в синий цвет показывает, что молоко пастеризовано с нарушением режима или к правильно пастеризованному молоку добавлено сырое молоко.
Лактоальбуминовая проба:
Используется для установления пастеризации при температуре выше 80 °С.
В колбе смешивают 5 мл пастеризованного молока и 20 мл воды, добавляют 3 мл 0,1 н р-ра серной кислоты для осаждения казеина и отфильтровывают. В пробирку вносят 5 мл фильтрата и кипятят. Если молоко пастеризовано при 80 °С, то при его кипячении не образуется хлопьев альбумина, а при охлаждении фильтрата не будет осадка.
Определение добавления воды в молоко
Для установления наличия добавленной воды по нейтральной пробе в пробирку наливают 1,5-2см3 концентрированной химически чистой серной кислоты. К такому же количеству контролируемого молока прибавляют одну каплю формалина и перемешивают. Молоко осторожно наливают по стенке в пробирку с серной кислотой. При наличии в молоке воды на границе соприкосновения кислоты и молока образуется сине-фиолетовое кольцо. В натуральном молоке такого кольца не будет.
Определение примеси соды ГОСТ 24065-80
Примесь соды в молоке и молочных продуктах определяют путем добавления к 3-5 мл исследуемого молока или молочного продукта такого же количества 0,2%-кого спиртового раствора розоловой кислоты. При наличии соды содержимое в пробирке окрашивается в розово-красный цвет, а при отсутствии - в оранжевый.
Определение примеси крахмала
Фальсификацию молокакрахмалом определяют путем добавления в пробирку с 5 мл хорошо перемешанного молока (сметаны, сливок) 2-3 капель люголевского раствора. Содержимое пробирки тщательно взбалтывают. Появление через 1-2 минуты синей окраски указывает на присутствие в исследуемой пробе крахмала.
ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНАЯ ЭКСПЕРТИЗА
КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ
Продукты, получаемые из молока в результате молочнокислого брожения (иногда с участием спиртового брожения), называются кисломолочными. Различают продукты, получаемые в результате только молочнокислого брожения (1-я группа) - ряженка, простокваша различных видов, ацидофильное молоко, творог, сметана, йогурт, и продукты, получаемые при смешанном молочнокислом и спиртовом брожении (2-я группа) — кефир, кумыс и др. Продукты 1-й группы имеют достаточно плотный, однородный сгусток и кисломолочный вкус, обусловленный накоплением молочной кислоты. Продукты 2-й группы обладают кисломолочным освежающим, слегка щиплющим вкусом, обусловленным присутствием этилового спирта и углекислоты, и нежным сгустком, пронизанным мельчайшими пузырьками углекислого газа. Сгусток этих продуктов легко разбивается при встряхивании, благодаря чему продукты приобретают однородную жидкую консистенцию, поэтому их часто называют напитками.
При производстве кисломолочных продуктов применяют чистые культуры молочнокислых бактерий. В зависимости от вырабатываемых продуктов в состав чистых культур входят молочнокислый стрептококк (Str. lactis), болгарская палочка (Васt. bulgaricum), ацидофильная палочка (Васt. аcidophilum), ароматообразующие бактерии (Str. diacetilactis) и молочные дрожжи (Тorula). Каждый продукт изготовляется с помощью определенных культур микроорганизмов.
Основные биохимические процессы, протекающие при получении кисломолочных продуктов, таковы: молочнокислое и спиртовое брожение молочного сахара, коагуляция казеина и гелеобразование; в результате этих процессов формируются консистенция, вкус и запах готовых продуктов.
Отбор проб
Кисломолочные продукты тщательно перемешивают. Для всех продуктов объем средней пробы составляет 50 мл (за исключением сметаны и сливок – 15 г, творог – 20 г). Во всех случаях исследуют органолептически и выборочно содержание жира и кислотность. При необходимости выявляют фальсификацию и контролируют режим (пастеризации или кипячения). Продукт исследуют не позднее 4 часов после отбора. Для отбора используют трубчатые и цилиндрические пробоотборники.
Рисунок 2 – Пробоотборники для сливочного масла, творога и сметаны
Методика оценки качества кисломолочной продукции:
Органолептика: Простокваша должна иметь вкус и запах чистые, кисломолочные, без посторонних, не свойственных продукту привкусов и запахов, в простокваше южной допускается спиртовой привкус, в варенце и ряженке – привкус пастеризации. Цвет молочно-белый, у ряженки и варенца – с буроватым оттенком. Сгусток в меру плотной, ненарушенный, без газообразования, на поверхности допускается незначительное выделение сыворотки, на изломе сгусток глянцевидный, устойчивый, для варенца и ряженки допускается наличие молочных пенок, для ацидофильной и южной – слегка тягучий. Не допускается к приемке простокваша с пустотами, дряблую, вспученную, загрязненную, с кормовым, горьким вкусом и запахом. Кислотность простокваши 80-1100Т, южной – 90-1400Т, ряженки 75-1000Т.
Кефир должен иметь вкус чистый, кисломолочный, освежающий, слегка острый, специфический, без посторонних привкусов и запахов. Консистенция однородная, наполняющая жидкую сметану. Допускается газообразование в виде отдельных глазков, не более 2% отделившейся сыворотки. Кислотность 85-1200Т не допускается к приемке кефира с горьким, аммиачным, кормовым и другими привкусами и запахами, а также грязный.
По качеству творог делят на высший и 1-й сорта. Творог высшего сорта должен иметь вкус и запах чистые, нежные, кисломолочные, без посторонних привкусов и запахов. Консистенция нежная, допускается неоднородная. Цвет белый, слегка желтоватый, с кремовым оттенком, равномерный по всей массе. В 1-м сорте допускаются слабовыраженные привкусы кормов, тары и наличие слабой горечи. Консистенция рыхлая, мажущаяся, а для обезжиренного творога – с незначительным выделением сыворотки, рассыпчатая кислотность жирного творога высшего сорта не более 200 0 Т, полужирного – 210 0 Т, нежирного – 220 0 Т. Пороками творога являются кормовые привкусы, выраженный кисломолочный вкус, горечь, крупитчатость. Не допускают к приемке творог плесневелый и загрязненный.
Сметану 30%-ой жирности по качеству делят на высший и 1-й сорта. Цвет белый с кремовым оттенком. Вкус и запах чистый, молочнокислый, с выраженными вкусом и ароматом, свойственными пастеризованным продуктам.
Консистенция однородная, в меру густая, без крупинок жира и белка, глянцевитая. Кислотность сметаны 65-900 о Т. В 1-м сорте допускается слабо выраженный кормовой вкус, наличие горечи, консистенция недостаточно густая, слегка комковатая, наличие легкой тягучести; кислотность 65-110 0 Т.
Остальные виды сметаны на сорта не подразделяют. Пороками сметаны являются жидкая, комковатая консистенция, прогорклый вкус и др. Не допускают к приемке сметану с горьким, кислым, кормовым вкусом и запахом, тягучую, загрязненную и с выделившейся сывороткой.
Лабораторные методы исследования исследования:
Основными тестами при массовых диагностических исследованиях являются пробирочная РА, РА на стекле (Роз-бенгал проба), РСК и РДСК, кольцевая реакция с молоком, реакция диффузионной преципитации.
При обнаружении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота (ранее иммунизированного или не иммунизированного) животных с уровнем антител 100 ME и более их признают больными,
50 ME — результат РА сомнительный. В случае сомнительной РА животных исследуют через 15-30 суток повторно и при вторичном сомнительном результате животных признают больными.
При исследовании в РА невакцинированных баранов-производителей, пробников, ярок, козлов, содержащихся в благополучных отарах, где проводилась иммунизация, РА оценивают как положительную при уровне антител 100 ME и более, сомнительной — 50 ME. В последнем случае животных через 15-30 суток исследуют повторно, и, если содержание антител не увеличилось, их признают здоровыми.
Роз-бенгал проба (РБП).РА на стекле с корпускулярным антигеном, окрашенным розовым бенгальским, используют для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и северных оленей. Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре не ниже 18°С. Исследуемые сыворотки в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки, затем в лунку рядом с сывороткой помещают при исследовании крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней 0,03 мл антигена, сывороток овец, коз, буйволов и северных оленей — 0,015 мл антигена. Компоненты должны иметь температуру не ниже 18°С.
Кольцевая реакция с молоком (КР).Реакцию применяют для проверки благополучных по бруцеллезу стад крупного рогатого скота и молока на рынках.
КР на 2-3 креста считают положительной, 1 крест — сомнительной. При положительной КР от всех животных стада берут кровь для исследования в РА или РСК (РДСК) или РА и РИД. Если получают их отрицательный результат, то независимо от позитивной КР животных признают здоровыми.
При диагностике бруцеллеза северных оленей для оценки эпизоотического состояния стад, благополучных по бруцеллезу, вакцинированных против бруцеллеза; для исследования на бруцеллез не ранее чем через два месяца после применения вакцин; для дифференциации неспецифических реакций.
Техника проведения РИД. Расплавленный агар разливают по 2,5 мл на предметные стекла, пластинки размером 6x9 см —12 мл, стандартные чашки Петри слоем не менее 2 мм, которые предварительно размещают на строго горизонтальной поверхности. В застывшем агаровом геле штампом делают лунки: центральную диаметром 5 мм и шесть переферических по 3 мм.
В центральную лунку вносят 20 мкл О-полисахаридного антигена, в периферические — 40 мкл исследуемых сывороток крови. Одновременно на каждой пластинке (чашке Петри) ставят контроль с позитивной сывороткой крови. Затем стекла (чашки Петри) выдерживают во влажной камере при температуре не ниже 18° С и учитывают результат в косопроходящем свете через 24 и 48 часов. Как положительный результат оценивают наличие линии преципитации, появившейся через 24 часа. Сыворотки крови, давшие реакцию преципитации через 48 часов, исследуют повторно и при получении линии преципитации через 24 или 48 часов результат реакции признают положительным.
Печеночно-сывороточный или печеночно-аминопептидный агар.Готовят печеночный отвар: 500 г свежего фарша говяжьей печени смешивают с 500 мл воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют в автоклаве, смешивают равные объемы печеночного отвара и водопроводной воды, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2% агар-агара. На 1000 мл смеси вносят 17 мл 10%-ной двууглекислой соды, автоклавируют 20-25 минут при 115° С, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,0-7,2, добавляют 1% глюкозы и 2% глицерина, разливают по колбам и стерилизуют 20-25 минут при 110° С. Перед использованием агар расплавляют, остужают до 50° С, добавляют 10-20% сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота (печеночно-сывороточ-иый агар) или 10-15% аминопептида (печеночно-аминопептидный агар) и разливают по чашкам или пробиркам. Также готовят полужидкие агары, внося 0,15-0,2% агар-агара. Рекомендуют среды данного типа для культивирования В. ovis.
Печеночный агар Хеддльсона.В 500 мл воды вносят 10 г пентона,
5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, автоклавируют 30 минут, добавляют 500 мл печеночного отвара, охлаждают до 60° С, устанавливают рН 7,0. К 1 л среды добавляют один яичный белок, автоклавируют 30 минут при 120° С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,0, разливают по емкостям и стерилизуют 30 минут при 115° С.
Плотный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (ППГГА). 400 г свежей говяжьей печени освобождают от жира и пленок, измельчают, добавляют 500 мл водопроводной воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр. Полученный печеночный отвар разводят водопроводной водой 1:1, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2,5% агара и
17 мл 10%-ного раствора гидрокарбоната натрия на 1000 мл. Среду автоклавируют 20 минут при 115° С, отстаивают в автоклаве 3-4 часа, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,2. Затем в среду вносят 1% глюкозы и 2-3% глицерина, разливают по пробиркам, колбам, стерилизуют 20-25 минут при 110° С. Данную среду рекомендуется применять для культивирования В. abortus, В. melitensis и В. suis, при бактериостатическом методе дифференциации бруцелл. ППГГБ готовят так же, но агар не добавляют.
Сывороточно-декстрозиый агар.К 835 мл дистиллированной воды добавляют 15г агар-агара, 10г пептона, 5 г химически чистого натрия хлорида и 165 мл мягкой воды. Прогревают 1 час текучим паром, устанавливают рН 7,8, автоклавируют 30 мин при 127° С, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,4. Среду разливают по сосудам и стерилизуют при 116° С 15 минут. Перед использованием среду расплавляют, охлаждают до 50° С, добавляют стерилизованные фильтрованием сыворотку крови лошади или крупного рогатого скота до концентрации 5% и раствор декстрозы до уровня 1%. Среда рекомендуется для первичного выделения бруцелл.
Сывороточно-декстрозный бульон.Готовят так же, как сывороточно-декстрозный агар, но без добавления агар-агара.
Альбими-агар.В 1000 мл дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,3, все компоненты растворяют в аппарате Коха, фильтруют через ватный фильтр. Вносят 1 г глюкозы, 0,2 г бисульфита натрия, устанавливают рН 7,2 0-7,3, разливают по колбам и стерилизуют 40 минут текучим паром, затем 20 минут в автоклаве при 110° С. Дрожжевую воду получают путем кипячения 1 кг хлебных дрожжей в 1000 мл дистиллированной воды, затем фильтруют через полотно и хранят под флороформом в темноте (не более 15 дней).
Реакция Хеддльсона (пластинчатый метод)
Преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции, быстром получении результатов и чувствительности реакции. В качестве антигена для постановки реакции Хеддлсона и Райта применяют единый бруцеллезный диагностикум. Реакцию ставят на обычном оконном, тщательно вымытом, обезжиренном стекле, расчерченном на квадраты величиной 4 x 4 см каждый, по горизонтали должно быть 5 квадратов. На первом квадрате с левой стороны записывается номер испытуемой сыворотки, в последующие квадраты слева направо разливают (микропипеткой или 1 мл градуированной пипеткой) испытуемую сыворотку в следующих дозах: 0,04, 0,02, 0,01 и 0,03 (контроль сыворотки). К первым трем дозам сыворотки добавляют по 0,03 мл антигена. К последней дозе сыворотки (0,03) добавляют 0,03 мл физиологического раствора. Сыворотку осторожно смешивают с антигеном палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Контроль антигена ставят, добавляя 0,03 мл физиологического раствора к 0,03 мл антигена. Затем стекло слегка подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерное нагревание всей поверхности стекла.
В случае положительной реакции в первые же минуты в каплях сыворотки с антигеном появляются хлопья (агглютинат). Максимальный срок наблюдения 8 минут. Контроль сыворотки ставят с каждой испытуемой сывороткой для исключения спонтанной агглютинации; контроль антигена ставят один (при любом числе испытуемых сывороток) для исключения спонтанной агглютинации применяемого антигена. Учет реакции проводят невооруженным глазом по следующей схеме: а) полное просветление жидкости с крупными и мелкими хлопьями, т.е. 100 % агглютинации (4+); б) почти полное просветление жидкости с ясно заметными хлопьями, т.е. 75 % агглютинации (3+); в) незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями, т.е. 50 % агглютинации (2+); г) мутная жидкость с едва заметной зернистостью (+); д) равномерная мутная жидкость (-).
Для оценки результатов рекомендуется следующая схема: а) агглютинация на 4+ во всех дозах сыворотки - результат "резко положительный"; б) агглютинация не менее 2+ во всех дозах сыворотки - результат "положительный"; в) агглютинация только в первой или в первой и второй дозах сыворотки - результат "сомнительный"; г) отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки - реакция "отрицательная".
Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительный результат реакции. При сомнительном или отрицательном результатах реакции и наличии эпидемических и эпизоотических показаний, а также в стационаре и при обследовании доноров, где необходимо определение титра агглютининов и их динамики, следует применять реакции Райта и Кумбса, РПГА и ИФА.
Роз-Бенгал проба (РБП)
Роз-Бенгал проба, по сравнению с другими методами серологической диагностики бруцеллеза, обладает следующими преимуществами: большой чувствительностью, способностью в короткие сроки после заражения выявлять специфические бруцеллезные антитела и, благодаря кислой реакции антигена, ингибировать проявления неспецифических антител, а также стабильностью показаний, технической простотой постановки, требующей небольшой затраты труда и времени, четкостью и быстротой получаемых результатов.
Сыворотки крови, подлежащие исследованию, должны быть прозрачные, без примеси эритроцитов. Их исследуют не позднее, чем через 4 дня хранения при температуре плюс 4-8 °С.
Допускается исследовать сыворотки, консервированные сухой борной кислотой (2 % борной кислоты к объему сыворотки). Консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 14 дней.
Антиген представляет собой суспензию инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл в буферном растворе, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет. Расфасован во флаконы из темного стекла, подлежит хранению в темном сухом месте при температуре плюс 4-12 °С. Срок годности антигена при соблюдении условий хранения 18 месяцев со дня его изготовления.
Антиген во флаконах без этикетки (надписи) или с трещинами, содержащий постороннюю примесь, неразвивающиеся хлопья, плесень, с истекшим сроком годности или подвергавшиеся замораживанию, для применения не годен.
Перед употреблением антиген выдерживают 30-40 мин. при комнатной температуре и затем тщательно встряхивают.
Техника постановки Роз-Бенгал пробы: реакцию проводят на чистых сухих металлических эмалированных пластинках или изразцовых плитках с лунками при комнатной температуре (плюс 18-30 °С).
Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки шприцем-полуавтоматом или микропипеткой, которые трижды промывают фенолизированным (карболизированным) физиологическим раствором и подсушивают фильтровальной бумагой.
В каждую лунку рядом с сывороткой пипеткой-капельницей вносят равное количество (0,03 мл антигена) и тщательно смешивают активным движением ручного полисмесителя на 5 или 25 проб для получения однородной смеси, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки.
Пластину с внесенными на нее сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи автоматического прибора, предназначенного для этой цели. При положительной реакции появляются хлопья агглютината розового цвета.
В начале работы ставят контроль антигена с нормальной (отрицательной) и положительной агглютинирующей сыворотками в тех же дозах, а также контроль антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 мл антигена добавляют 0,03 мл физиологического раствора).
Учет реакции проводят невооруженным глазом в течение 4 мин. после смешивания сыворотки с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.
Агглютинацию, которая наступает позже, чем через 4 мин - не учитывают.
Реакцию считают положительной при наличии выраженной агглютинации в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.
При отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена) реакцию считают отрицательной.
После учета реакции пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 3 % раствор фенола или 1 %-ный раствор хлорамина, затем тщательно промывают водопроводной водой, высушивают и используют повторно. Для этих целей можно применять кассеты и штативы сушилки.
При нечетко выраженной агглютинации проводят повторное исследование.
По результатам повторного исследования дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).
Сыворотки, с которыми получена положительная РБП, исследуют в РА и РСК (РДСК) для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. Сыворотки, с которыми получена отрицательная РБП, дополнительно в РА и РСК (РДСК) не исследуют.
Кольцевая реакция с молоком
Кольцевая реакция применяется с целью ориентировочной проверки благополучных по бруцеллезу молочных стад и для проверки молока на рынках.
Сущность кольцевой реакции заключается в том, что в молоке бруцеллезных животных при добавлении антигена образуется комплекс антитела с антигеном, который адсорбируется жировыми частицами молока. Жировые частицы вследствие своего малого удельного веса поднимаются наверх, увлекая адсорбированный агглютинат, который в зависимости от цвета антигена образует на поверхности жидкости окрашенное кольцо.
Для кольцевой реакции применяют цветной антиген Триленко, представляющий взвесь убитых, окрашенных бруцеллезных микробов.
Для исследования необходимо брать цельное, лучше свежее, молоко или консервированное формалином (из расчета 0,1 мл 10 % раствора формалина на 10 мл молока).
В пробирку берут 2 мл молока и добавляют 0,1 мл (2 капли) концентрированного антигена, тщательно встряхивают и помещают в водяную баню или термостат на 45-50 мин при температуре 37-39 °С.
Учет реакции: а) если в верхней части столбика молока (в слое сливок) четко выражено синее кольцо, а остальная часть молока белая, реакция оценивается положительной - 100 или 75 % агглютинации (+ + + + и + + +); б) при наличии достаточно выраженного синего кольца в слое сливок, а остальная часть молока синеватого цвета, реакция оценивается положительной – 50 % агглютинации (+ +); в) если синее кольцо в слое сливок слабо выражено и весь столбик молока имеет синий цвет, реакция считается сомнительной - 25 % агглютинации (+ и ±); г) если столбик молока равномерно окрашен в синий цвет, а слой сливок остается белым или слегка желтоватым, реакция отрицательная (-).
Молоко от коров с сомнительной реакцией исследуют повторно через 10-15 суток. При получении отрицательного или снова сомнительного результата животных считают благополучными по бруцеллезу.
Пластинчатая реакция агглютинации (исследование молока)
Данная реакция применяется для исследования только свежего молока и молочной сыворотки. Не подлежит исследованию пастеризованное, кипяченое и замороженное молоко (в таком молоке антибруцеллезные агглютинины разрушаются), а также молоко, имеющее кислотность выше 30 °С по Тернеру (во избежание получения неспецифических результатов).
Реакцией агглютинации можно исследовать молоко жирное (цельное), обезжиренное (снятое) и молозиво. Жирное молоко предварительно обезжиривают отстаиванием или центрифугированием, затем из-под слоя сливок забирают молоко для исследования. Обезжиренное молоко и молозиво исследуют без предварительной подготовки, но так, чтобы сливок попало минимальное количество.
Обезжиренное молоко наносят на стекло (чашку Петри) в количестве 0,1 мл (или двух капель) и 0,05 мл (или одной капли). К каждой дозе испытуемого молока добавляют по одной капле бруцеллезного диагностикума. Реакция сопровождается двумя контролями: к 0,05 мл диагностикума добавляют 0,1 мл физиологического раствора и 0,1 мл испытуемого молока смешивают с 0,05 мл 12 % раствора хлористого натрия. Путем покачивания стекла смешивают ингредиенты. Учет реакции производят в первые 3-5 мин.
Положительная реакция агглютинации характеризуется выпадением хлопьев с большим или меньшим обесцвечиванием молока. При отрицательном результате молоко остается равномерно окрашенным в голубой цвет (цвет антигена).
Исследование молочной сыворотки
Перед получением молочной сыворотки жирное молоко обезжиривают путем центрифугирования или отстаивания. Молочную сыворотку получают при створаживании молока сычужным ферментом. Для этого к 5 мл молока добавляют 1-2 капли 10 % сычужного фермента на физиологическом растворе хлористого натрия. Пробирки помещают при температуре 37 °С на 20-30 мин (до свертывания молока). Молочную сыворотку можно получить также путем помещения молока при 37 °С на сутки. Молочную сыворотку сразу отделяют путем фильтрования через бумажный фильтр. Дальнейшие манипуляции: постановка реакции и учет результатов аналогично постановке и учету реакции агглютинации с цельным молоком.
При оценке результатов исследования молока на бруцеллез при помощи пластинчатой реакции агглютинации необходимо учесть возможность образования мелкохлопчатого агглютината, который из-за мутности молока может быть не отмечен и результаты реакции могут быть приняты за отрицательные. В отрицательных реакциях рекомендуется молоко исследовать в реакции агглютинации с молочной сывороткой.
Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; Нарушение авторского права страницы
Читайте также: