Лабораторная диагностика классической чумы свиней

Классическая чума свиней (КЧС) - высококонтагиозная инфекционная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, поражением кровеносной и кроветворной систем, крупозным воспалением легких и крупозно-дифтерическим воспалением толстого кишечника. Группа А по данным МЭБ.

К ВКЧС восприимчивы домашние свиньи всех пород и возрастных групп, особенно чистопородные, а также дикие кабаны.

Болезнь регистрируется главным образом в Азии, Центральной и Южной Америке, а также в некоторых регионах Европы и Африки.

Вирус чумы свиней относится к семейству Flaviviridae, род Pestivirus. Вирусную природу КЧС установили в 1908 г. Швейнитц и Дорсе.

Антигенная вариабельность ВКЧС не доказана. По вирулентности различают А-, В- и С-варианты вируса. В группу А входят вирулентные эпизоотические штаммы, вызывающие у свиней всех возрастов остро протекающую болезнь. Вирусы подгруппы В вирулентны только для поросят и при циркуляции в стаде вызывают атипичную или хроническую чуму.
ПодгруппаС – американский слабовирулентный шт. 331.
Установлено одностороннее родство между ВКЧС и вирусом диареи КРС: АТ к вирусу диареи КРС нейтрализуют ВКЧС, но АТ к ВКЧС не нейтрализуют вируса диареи. В сыворотке крови свиней-реконвалесцентов обнаруживают ВНА, ПА и КСА.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований. Эпизоотологические и патологоанатомические данные зависят от восприимчивости свиней, вирулентности штамма и комплекса мероприятий по профилактике КЧС.

Если в очаге штамм вируса вирулентный, поголовье свиней не иммунное, то болезнь характеризуется высокой контагиозностью, большей смертностью, гипертермией, геморрагическими поражениями кожного покрова, признаками поражения органов ЖКТ и ЦНС. Обращают внимание выраженный геморрагический диатез в различных органах, мраморность лимфоузлов, инфаркты селезенки, кровоизлияния в почках на фоне их анемии, катарально-геморрагический гастроэнтерит, лимфоцитарный энцефаломиелит. Однако частая вакцинация свиней против чумы создает иммунный фон, влияющий на симптомы болезни и характер патоморфологических изменений. При хроническом течении характерными изме­ниями являются очаговый дифтеритический налет (бутоны), коричневая экзема, фибринозный плеврит и перикардит, некроз миндалин. Хроническая болезнь часто протекает на фоне других инфекций. Правильный диагноз может быть поставлен только лабораторными исследованиями.

Экспресс-методы обнаружения вируса КЧС. Рекомендована дифференциация пестивирусов с использованием ДНК-зонда на ВКЧС. В качестве гибридизационного зонда используют комплементарную ДНК (меченую 32 Р) к участку гена белка Р125. Для быстро-D обнаружения ВКЧС в тканях с помощью ПЦР из образцов тканей животных фенольным дом выделяют препараты РНК, подвергают обратной транскрипции и амплифицируют ПЦР. Используемые "гнездовые" праймеры позволяют амплифицировать разные изоляты ВКЧС. ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет дифференцировать различные пестивирусы. Предложен вариант ПЦР для выявления ВКЧС с использованием 4-х праймеров для амплификации фрагментов гена белка

Е-1. Чувствительность метода составляет 10 ТЦД₅₀.

Выделение вируса.Для выделения вируса берут пробы крови, кусочки селезенки, миндалин, лимфоузлов, грудной кости, почек и легких от 2-3 животных в первые 2ч после гибели или убоя больных в атональном состоянии. Материал отбирают в стерильные флаконы, закрывают резиновыми пробками, флаконы обрабатывают снаружи 5%-ным р-ром хлорамина или осветленным 20%-ным р-ром хлорной извести, обертывают марлей, смоченной дезинфицирующим р-ром, и помещают в полиэтиленовый пакет. Взятый патматериал помещают в термос со льдом, опечатывают и отправляют с нарочным в лабораторию с сопроводительным документом. В лаборатории из каждой пробы готовят 20%-ную суспензию на 0,85%-ном р-ре NaCl, которую трижды замораживают и оттаивают, центрифугируют при 3-4 тыс. мин- 1 20-30 мин. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками 1ч при 37°С и используют для выделения вируса.

Выделение вируса в культуре клеток. Используют перевиваемую культуру клеток РК-15, выращенную на стеклянных пластинках. На каждую пробу материала берут не менее 8 пробирок, в которые вносят по
0,4 мл исследуемого материала. Адсорбируют вирус 2 ч 137°С, затем его удаляют, клетки отмывают средой и заливают 2 мл поддерживающей среды с 2% сыворотки теленка. Для контроля качества культуры клеток оставляют 10 пробирок незаряженными. Инкубируют 24-96 ч. ВКЧС в культуре клеток РК-15 не вызывает, поэтому индикацию его проводят методом прямой ИФ. Через 24-96 ч после инокуляции пластинки с монослоем клеток извлекают из пробирок, подсушивают на воздухе и 10 мин фиксируют в холодном (4°С) ацетоне, подсушивают на воздухе и помещают их клетками вниз на капле ФИТЦ-Ig ВКЧС, нанесенного в рабочем разведении на предметные стекла. Препараты выдерживают во влажной камере 30 мин при 37°С, затем промывают в сосуде с 0,01 M ФСБ с рН 7,2-7,5 30-40 мин в темном месте, ополаскивают в дистиллированной воде, подсушивают на воздухе и заключают в забуференный глицерин (9 частей глицерина и 1 часть 0,01 М ФСБ с рН 7,5). Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят кап­лю забуференного глицерина, помещают препарат клетками вниз и заливают края расплав­ленным парафином, Просматривают под люминесцентным микроскопом.

В инфицированных препаратах, обработанных ФИТЦ-Ig, АГ вируса обнаруживают по ярко-зеленому диффузному свечению цитоплазмы пораженных клеток, располагающихся группами, которые называют флюоресцирующими микробляшками. Через 24-48 ч в культу­ре клеток РК-15 наблюдают появление микробляшек. При их отсутствии в первом пассаже проводят 2-й и 3-й пассажи испытуемого материала с последующим ИФ через 24-96 ч.

Индикация и идентификация вируса. Гистологические исследования. Проводят с целью обнаружения специфических изме­нений нервных тканей. От павших или убитых свиней берут кусочки полушария головного мозга, мозжечка, аммоновых рогов, спинного мозга в различных участках. Гистологические препараты окрашивают гематоксилин-эозином. В большинстве случаев (70-93%) в ЦНС об­наруживают негнойный лимфоцитарный энцефаломиелит, характеризующийся периваскулярными лимфоцитарными инфильтратами, очаговой пролиферацией клеток микроглии (глиальных узелков) и дистрофией ганглиозньгх клеток. B срезах, приготовленных из лим­фоузлов, сердечной мышцы и печени, можно обнаружить присутствие ацидофильных внут­риядерных телец-включений, несколько меньших, чем ядрышки. В лимфоузлах их находят на 6-12-й день после заражения.

ВКЧС обладает выраженным гематотропизмом в отношении костного мозга, содержа­щего большее количество бластных клеток, чем лимфоузлы и селезенка. Поэтому костный мозг поражается первым; ингибируются миелопоэтические и эритропоэтические клетки и пролиферируют крупные клетки с базофильной цитоплазмой. Наряду с этим обнаруживают картину глубокого цитолиза и дистрофию лимфопоэтических органов.

При подозрении на чуму для уточнения диагноза несколько тяжелобольных животных убивают и исследуют мазки из костного мозга грудной клетки.

Биопроба. Из благополучного по инфекционным болезням хозяйства берут поросят в возрасте 2-3 мес массой 20-30 кг. В качестве материала используют 10%-ную суспензию, приготовленную из органов (селезенки, лимфоузлов, костного мозга) или крови от павших животных. Суспензию обрабатывают антибиотиками, выдерживают не менее 4 ч при 4°С, центрифугируют и надосадочную жидкость используют для заражения животных. Трем по­росятам вводят подкожно по 1 мл крови или по 2 мл суспензии органов. Двум животным исследуемый материал не инокулируют, содержат их отдельно для контроля. Двум порося­там, иммунным к ВКЧС, вводят исследуемый материал в тех же дозах с целью дифферен­циальной диагностики в отношении АЧС. За всеми животными наблюдают 21 день и еже­дневно измеряют температуру тела.

Диагноз считают положительным, если 2 из 3-х неиммунных поросят заболевают, про­являя симптомы болезни, и погибают, а 2 иммунных остаются здоровыми или проявляют незначительные и кратковременные (1-4 дн) признаки болезни слабой интенсивности (повышение температуры тела не выше 41°С). Однако следует иметь ввиду, что при отсут­ствии реакции у восприимчивых животных или в случае ее недостаточной выраженности, нельзя с уверенностью исключить присутствие вируса в исследуемом материале. Отрица­тельный результат заражения может быть следствием либо слишком малого количества в нем вируса, либо слабой вирулентности последнего. Поэтому следующим шагом является повторное, спустя 3-6 нед после инокуляции исследуемого материала, заражение (реинфекция) подопытных свиней на этот раз вирусом с заведомо известной вирулентностью. Отсут­ствие у животных реакции на это заражение свидетельствует о приобретении ими иммуни­тета в результате первой инокуляции (бессимптомного переболевания) и косвенно указывает на присутствие вируса в исследуемом материале. Одновременно с проведением второй пробы заражают дополнительно двух восприимчивых поросят (контроль) вирусом, использо­ванным для реинфекции.

Иногда биологическая проба себя не оправдывает или дает неясные результаты при вы­делении штаммов вируса, вызывающих легкое заболевание. Такие штаммы у инокулированных поросят вызывают хроническую болезнь. Дело осложняется тем, что штаммы со слабой вирулентностью могут не обладать иммунизирующими свойствами, а это не позво­ляет уточнить диагноз при использовании дополнительного контрольного заражения виру­лентным штаммом (реинфекции). При диагностике заболевания, обусловленного такими штаммами могут понадобиться молодые животные и дополнительные пассажи для повышения вирулентности.

Предложена шкала оценки вирулентности полевых штаммов ВКЧС:

- слабовирулентные (патогенные лишь для поросят-сосунов) не иммунизирующие штаммы. Поросята-сосуны заболевают в первые дни жизни и смертность их велика, поросята-отъемыши (12-15 кг) реагируют только в определенные дни подъемом температуры тела, не приобретая иммунитета;

- слабовирулентные (патогенные для молодых животных) иммунизирующие штаммы. У животных массой 15-20 кг развивается хроническая болезнь, подсвинки массой 35 кг реаги­руют подъемом температуры тела, продолжающимся несколько дней. На вскрытии обнару­живаются незначительные точечные кровоизлияния. Животные приобретают иммунитет;

- сильно вирулентные штаммы вызывают у животных массой 30 кг острое заболевание, смертность 40% и больше. На вскрытии характерны геморрагические изменения.

Тест модуляции фагоцитарной активности макрофагов. Дефицит фагоцитарной функции приводит к нарушению локальных иммунных реакций с развитием воспалитель­ных процессов на слизистых оболочках. При КЧС происходит локализация фагоцитарной функции лейкоцитов: при репродукции вакцинного шт. ЛК-ВНИВВиМ снижается процент и индекс фагоцитоза нейтрофилов и макрофагов, а при репродукции вирулентного вируса шт. Ши-Мынь повышается процент и индекс фагоцитоза нейтрофилов и снижается таковой у макрофагов. При КЧС in vivo и in vitro фагоцитарная активность лейкоцитов крови кратко­временно (до 4 сут) снижается при инфицировании вакцинным штаммом и повышается у макрофагов при инфицировании вирулентным штаммом ВКЧС. Установленный в инфици­рованных клетках-мишенях цитопатический эффект, выражающийся в модуляции фагоци­тарной активности свиных макрофагов, используют в диагностике КЧС.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ: ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ

Классическая чума свиней (КЧС) – высококонтагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, поражением кровеносной и кроветворной систем, крупозным воспалением легких и крупозно-дифтеритическим воспалением толстого кишечника [1].

Болезнь встречается более чем в 60 странах на всех континентах (за исключением США, Канады, Австралии, Скандинавских стран). Более других от этой инфекции страдают страны Европы, Азии, Южной и Центральной Америки, где хорошо развито свиноводство. Классическая чума свиней относится к списку А особо опасных инфекций и наносит большой экономический ущерб свиноводству как в развивающихся, так и в развитых странах с хорошо организованным ветеринарно-санитарным надзором [2]. В связи с вышеизложенным, разработка современных методов диагностики является актуальной проблемой современной науки и практики.

Лабораторная диагностика КЧС основывается на выявлении вирусного антигена, специфических антител, обнаружении вирусного генома и выделении вируса [5].

Обнаружение вирусной нуклеиновой кислоты. Методы ПЦР и ДНК-зонда позволяют дифференцировать пестивирусы (КЧС и вирусы диареи КРС) [1].

ПЦР. Выделяют рибонуклеиновую кислоту из образцов тканей животных фенольным методом, подвергают обратной транскрипции и амплифицируют [1].

Метод ДНК-зондов. В качестве гибридизационного зонда используют копмлементарную ДНК к участку гена белка Pl 25, меченную ³²Р [1].

Обнаружение вирусного антигена (белка).

РИФ. Из лейкоцитарного концентрата проб крови больных или подозрительных по заболеванию животных, а также костного мозга грудной кости делают маз­ки, а из органов - срезы [1]. Специфиче­ское свечение в цитоплазме указывает на наличие вируса КЧС. В контрольных пре­паратах подобного свечения не должно быть [4].

РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом. Вирус считается обнаруженным при наличии гемагглютинации в суспензии из патологического материала в разведениях не менее чем 1:8 [1].

ИФА. В иммуноферментных конъюгатах используют иммуноглобулины баранов, инфицированных ВКЧС. Метод позволяет при постмортальной диагностике выявлять вирус со 100%-ной эффек­тивностью без биологического накопления [1].

РДП слабочувствительна, дает положительный результат в 50 % случаев [1].

РИОЭФ (реакция иммуноэлектроосмофореза), в которой антигены и антитела движутся строго навстречу друг другу под действием электрического поля. РИЭОФ значительно чувствительнее, чем РДП, и скорее (за 30 мин) выявляет вирус в мезентериальных лимфоузлах и суспензии ткани поджелудочной железы [1].

Обнаружение вируса биопробой. Биопробу при диагностике ставят в сомнительных случаях. Из благополучного по инфекционным болезням хозяйства берут иммунизированных и неиммунизированных против КЧС поросят в возрасте 2-3 мес. массой 20-30 кг. В качестве материала для заражения используют 10%-ную суспензию органов (селезенки, лимфоузлов, костного мозга) или кровь от павших животных. Материал вводят подкожно. Диагноз на КЧС считают установленным, если неиммунизированные животные на 2–5-й день заболевают и в течение 7–10 дней погибают, а иммунизированные остаются здоровыми[1].

Выделение вируса в культуре клеток. Выделение вируса проводят на перевиваемой линии культуры клеток РК-15 (почки поросенка), выращенной на покровных стеклах в пробирках. Вирус КЧС в культуре РК-15 не вызывает ЦПД; поэтому индикацию его проводят с помощью серологических реакций РИФ и РНГА [1].

Гистологические исследования. Проводят с целью обнаружения специфических изменений нервных тканей. От павших или убитых свиней берут полушария головного мозга, мозжечка, аммоновых рогов, спинного мозга в различных участках. Препараты окрашивают гематоксилин-эозином. В большинстве случаев (70-93%) в ЦНС об­наруживают негнойный лимфоцитарный энцефаломиелит. В срезах, приготовленных из лим­фоузлов, сердечной мышцы и печени, можно обнаружить присутствие ацидофильных внут­риядерных телец-включений, несколько меньших, чем ядрышки [4].

Ретроспективная серологическая диагностика. В настоящее время в лабораторной диагностике КЧС используются три метода обнару­жения специфических антител к ВКЧС:

непрямой метод РИФ [1]. Используют зараженные вирусом перевиваемые клетки (РК-15) на стек­лышках. Титром AT к КЧС считают последнее разведение сыворотки, обеспечивающее зеленое свечение (на 2 креста) диффузного цитоплазматического АГ виру­са при отсутствии подобного свечения в контролях [4].

Реакция нейтрализации (РН) в сочетании с РИФ. Ставят в культуре клеток РК-15, выращен­ной на покровных стеклах в пробирках. Учет реакции проводят через 48 ч. Присутствие вируса обнаруживают в люминесцентном микроскопе [1]. От­сутствие флюоресцирующих микробляшек (при наличии их в контроле вируса) в препаратах ВКЧС указывает на наличие в ма­териалах специфических AT. Титром AT считают то предельное разведение сыворотки, при котором наблюдается полное подавление образования флюоресцирующих микробляшек [4].

ИФА в непрямой модификации. На миллипоровские фильтры, смоченные раствором АГ ВКЧС, наносят свиные сыво­ротки. Затем фильтры инкубируют в растворе кроличьего IgG (против IgG свиньи), меченого пероксидазой хрена. Опытные образцы окрашиваются в коричневый цвет, контрольные остаются бесцветными [4].

К ВКЧС восприимчивы свиньи всех пород и возрастных групп, особенно чистопородные, а также дикие кабаны [4]. Болезнь возникает в любое время года, протекает в виде эпизоотии [3].

Очень важно своевременно провести лабораторную диагностику классической чумы свиней, поскольку смертность достигает от 80 до 100 % [3].

Библиографический список

Белоусова, Р.В. Ветеринарная вирусология: учебник / Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская, И. В. Третьякова. – М.: КолосС, 2007. – 424 с.

Бессарабов, Б.Ф. Инфекционные болезни животных: учебник / Б.Ф. Бессарабов, А.А. Вашутин, Е.С. Воронин. – М.: КолосС, 2007. – 671 с.

Госманов, Р.Г. Ветеринарная вирусология: учебник / Р.Г. Госманов, Н. М. Колычев. – М.: КолосС, 2006. – 304 с.

Сюрин, В.Н. Вирусные болезни животных: учебник / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьёв, Н.В. Фомина. – Москва: ВНИТИБП. – 928 с.

Wenswoort, G. Topographical and functional mapping of epitopes on hog cholera virus wich monoclonal antibodies // J. gen. Virol. – 1989. – V. 70. – P. 2865-2876.

5.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

УТВЕРЖДЕНЫ 30 декабря 1996 г., N 13-4-2/809

1. Общие положения

1. Общие положения

1.1. Лабораторная диагностика классической чумы свиней (КЧС) основана на:

- обнаружении антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресценции в клетках мазков-отпечатков проб органов;

- выделении эпизоотического вируса КЧС из патологического материала инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15) и его идентификации реакцией прямой иммунофлуоресценции;

- обнаружении специфических антител в сыворотках крови переболевших классической чумой свиней реакцией нейтрализации флуоресцирующих микробляшек или реакцией непрямой иммунофлуоресценции;

- выделении и идентификации вируса КЧС биопробой на животных.

Для постановки иммунофлуоресцентных реакций используют "Набор препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической чумы свиней".

1.2. При проведении лабораторной диагностики руководствуются "Правилами работы и охраны труда в ветеринарных лабораториях", утвержденными Министерством сельского хозяйства СССР 14 января 1975 г.

2. Схема проведения лабораторных исследований

2.1. Отбор проб органов и подготовка патологического материала для исследования.

2.2. Приготовление мазков-отпечатков для постановки реакции прямой иммунофлуоресценции и экстрактов проб исследуемых органов для инокуляции культуры клеток (проводится одновременно).

2.3. Постановка реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) с целью обнаружения специфического антигена вируса КЧС в мазках-отпечатках из проб органов. По положительным или отрицательным результатам реакции ставят предварительный диагноз.

2.4. Инокуляция культуры клеток РК-15 экстрактами суспензий проб исследуемых органов с последующей постановкой РПИФ для обнаружения и идентификации эпизоотического вируса КЧС.

2.5. Исследование сывороток крови свиней в реакции нейтрализации флуоресцирующих микробляшек (РНФМ) или реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Серологические исследования проводят в тех случаях, когда пробы крови получены от свиней, подозреваемых в переболевании классической чумой (ретроспективные исследования из хозяйств, не применяющих вакцинацию против КЧС в течение последних 2 лет.

2.6. Постановку биопробы проводят только по указанию Департамента ветеринарии, когда при подозрении на КЧС на основании эпизоотологического обследования получены отрицательные результаты лабораторных исследований.

3. Отбор и подготовка проб к исследованию

3.1. Для исследования берут лимфатические узлы (подчелюстные и мезентериальные), части миндалин, селезенки, легкого, почки, кровь и костный мозг (из грудной или трубчатой кости) от 3. 5 животных, убитых в стадии агонии, или не позже чем через 2. 3 ч после гибели.

3.2. Пробы отбирают в стерильные флаконы массой 5. 10 г каждый, герметически укупоривают резиновыми пробками.

Флаконы снаружи обрабатывают 5%-ным раствором едкого натра или осветленным 20%-ным раствором хлорной извести, обертывают марлей, смоченной тем же раствором, укладывают в полиэтиленовый пакет и помещают в термос со льдом. В случае длительной транспортировки (более 2 сут) пробы органов замораживают. Термос помещают в металлический контейнер, опечатывают и доставляют с нарочным в лабораторию с сопроводительным документом.

3.3. При ретроспективной диагностике направляют 5. 10 проб крови (по 5. 8 см ) от свиней, подозреваемых в переболевании классической чумой. Кровь берут не ранее чем через 15. 20 сут после установления признаков болезни.

3.4. В лаборатории пробы селезенки, лимфатических узлов, легкого, почки каждого животного очищают от жировой и соединительной тканей и готовят по 2 мазка-отпечатка каждого органа для РПИФ. Для этого обезжиренные спирт-эфиром (1:1) покровные стекла укрепляют в расщепах деревянных палочек с условными номерами и делают мазок-отпечаток, прикладывая стекло к поверхности среза исследуемого органа (каждый отпечаток делается новым срезом органа). Мазки-отпечатки высушивают на воздухе при комнатной температуре (30. 60 мин) и помещают в химический стакан с холодным (2. 4°С) ацетоном. Фиксацию проводят в камере бытового холодильника при (4±2)°С в течение 10. 15 мин. Затем мазки-отпечатки извлекают из ацетона, высушивают и используют для постановки РПИФ. Хранят мазки-отпечатки при (4±2)°С не более 3 сут.

Контрольные отрицательные мазки-отпечатки готовят заранее, используя пробы органов от здоровых животных.

3.5. Навески каждого органа (примерно по 2 г) отдельно растирают в ступке со стерильным порошком из стекла или песком и готовят 20%-ную суспензию на стерильном 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Приготовленные суспензии дважды замораживают при -10. -12°С, оттаивают при 30. 37°С и центрифугируют в рефрижераторной центрифуге при 2500. 3000 об/мин в течение 10. 15 мин. Надосадочную жидкость (экстракт) отсасывают, вносят 100 ЕД/см пенициллина и 100 мг/см стрептомицина (конечная концентрация), выдерживают 1 ч при (37±0,5)°С и готовят разведения 1:5 и 1:10 на стерильном 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Для инокуляции культуры клеток используют как исходные (неразведенные) экстракты, так и разведенные.

3.6. Для получения сыворотки пробы крови выдерживают 1 ч в термостате при (37±0,5)°С или при комнатной температуре до образования сгустка. Сгусток обводят и пробы переносят в камеру бытового холодильника на 10. 14 ч. Сыворотку отсасывают и используют для исследования.

4. Обнаружение антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресценции в мазках-отпечатках.

4.1. Содержимое ампулы ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС растворяют 0,5 см дистиллированной воды и готовят рабочее разведение препарата на 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе - ФСБ (приготовление буферного раствора в Приложении, п.1), указанное на ампуле.

4.2. Препараты мазков-отпечатков, приготовленные по п.3.4, помещают на капли ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС, нанесенные в рабочем разведении на края предметных стекол, находящихся во влажной камере, и выдерживают при (37±0,5)°С в течение 30 мин.

4.3. Препараты снимают с предметных стекол, ополаскивают ФСБ и свободными концами спичек укрепляют в гнездах отмывочного штатива. Штатив помешают в цилиндрическую банку с раствором ФСБ, установленную на магнитную мешалку. Отмывание мазков-отпечатков от несвязавшихся или неспецифически связавшихся ФИТЦ-иммуноглобулинов ведут в течение 20 мин в темном месте, сменяя буферный раствор через 10 мин.

4.4. После отмывания препараты ополаскивают дистиллированной водой, подсушивают на воздухе и помещают на капли нефлуоресцирующего глицерина, разведенного раствором ФСБ в соотношении 9:1, нанесенные на прозрачные обезжиренные предметные стекла. Края препаратов заливают расплавленным парафином.

4.6. Специфическую флуоресценцию учитывают в лимфоидных клетках паренхимы селезенки, лимфатических узлов, легкого, расположенных группами, а также в эпителиальных клетках миндалин и клетках эпителия почечных канальцев, расположенных группами. Флуоресценцию обнаруживают в виде яркого, зеленого, диффузного свечения цитоплазмы антигенсодержащих клеток.

4.7. Учет и оценка результатов.

Проводят по условной четырехкрестовой шкале при увеличении 5x40: (++++, +++, ++, +) обнаружение во всех полях зрения множества групп клеток с яркой зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат положительный; (±) обнаружение в 5. 10 полях зрения единичных групп, состоящих из 3. 5 клеток с зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат сомнительный; отсутствие в мазках-отпечатках клеток с цитоплазматической флуоресценцией. Свечение клеток тускло-зеленое - результат отрицательный.

Отдельно расположенные клетки с флуоресценцией цитоплазмы или ядра не учитывают.

Текст ГОСТ 25754-83 Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней

ЖИВОТНЫЕ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

ГОСТ 25754—83 (СТ СЭВ 3453-81)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ

РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛИ

Э. В. Ивановский, Н. К. Мищенко, Н. Д. Насокина

ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР

Член Коллегии А. Д. Третьяков

УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 22 апреля 1983 г. № 2017

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней

Agricultural animals. Methods* of laboratory diagnostics of classical pig-plague

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 22 апреля 1983 г. № 2017 срок действия установлен

с 01.07.84 до 01.07,89

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт устанавливает методы лабораторной диагностики классической чумы свиней.

Стандарт применяют при диагностике заболеваний животных в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреждений.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 3453—81.

1. ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Сущность метода заключается в обнаружении специфических патолого-гистологических изменений нервных тканей в специально подготовленных срезах.

1.1. Метод отбора проб

1.1.1. Для проведения исследования от павших или убитых свиней берут полушария большого мозга с частями коры, мозжечок, аммоновые рога, спинной мозг в различных участках ствола.

1.2. Аппаратура, материалы и реактивы

1.2.1. Для проведения исследования применяют:

термостат с температурой нагрева 58 °С;

микротом для приготовления срезов в парафине;

микроскоп биологический по ГОСТ 8284—78;

пластинку нагревающую на 40°С;

парафин с точкой плавления от 56 до 58 °С по ГОСТ 23683—79; book пчелиный по ГОСТ 21179—75; формалин по ГОСТ 1625—75; кальций хлористый по ГОСТ 4460—77; кадмий хлористый по ГОСТ 4330—76; спирт этиловый абсолютный; спирт этиловый 96 %-ный по ГОСТ 5962—67; бензол по ГОСТ 5955—75 или ксилол, или толуол по ГОСТ 5789—78;

гематоксилин кристаллический; эозин;

кислоту фосформолибденовую; бальзам канадский;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72.

1.3. Подготовка к исследованию

1.3.1. Отобранные пробы фиксируют по Бейкеру. Для этого готовят раствор следующего состава:

хлористый кальций — 1 г; хлористый кадмий — 1 г;

10 %-ный формальдегид или формалин— 10 см 2 3 ; дистиллированная вода— 100 см 3 .

1.3.2. Фиксированные пробы обрабатывают путем подготовки срезов, включенных в парафин (см. обязательное приложение 1) или путем подготовки срезов при помощи гистокриотома.

1.3.3. Для окрашивания гистологических препаратов используют метод окрашивания гематоксилином (см. обязательное прило-* жение 2).

1.4. Проведение исследования

1.4.1. Подготовленные и окрашенные срезы просматривают под микроскопом.

1.5. Обработка результатов

1.5.1. Гистологические изменения, выражающиеся в наличии воспаления, диапедизиальных кровоизлияний, васкулярного эндо-телита, мукоидного фирбиозного и гиалинового перерождения стенок сосудов, а также лимфогистиоцитарного энцефаломиэлита в первичной ткани, характерны при заболевании чумой.

2. МЕТОД ПРЯМОЙ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

2.1. Метод отбора проб

2.1.1. Для проведения исследования берут миндалины, селезенку, почки, легкие, лимфатические узлы (мезентариальные и подчелюстные), красный костный мозг и кровь.

Пробы органов и тканей берут от павших животных не позднее 8 ч после гибели, от больных и подозреваемых в заболевании животных— сразу после убоя. Кровь берут от больных и подозревае-вых в заболевании животных.

2.2. Аппаратура и реактивы

2.2.1. Для проведения исследования применяют: микроскоп люминисцентный;

центрифугу с частотой вращения 5000 об/мин; шприцы;

рефрижератор на минус 20 °С; нож термоэлектрический; стекла предметные по ГОСТ 9284—75; стекла покровные по ГОСТ 6672—75; ацетон по ГОСТ 2603—79; глицерин по ГОСТ 6824—76;

раствор фосфатный буферный с pH 7,2; готовят следующим образом:

раствор А — в 1 дм 3 дистиллированной воды разводят 11,871 г двузамещенного фосфата натрия;

раствор Б — в 1 дм 3 дистиллированной воды растворяют 9,076 г однозамещенного фосфата калия. Смешивают 800 см 3 раствора А и 250 см 3 раствора Б;

раствор фосфатный буферный с pH 8,0; готовят следующим образом:

смешивают приготовленные растворы А — 930 см 3 и Б — 70 см 3 . При приготовлении буферных растворов в каждом случае pH растворов проверяют потенциометром;

коньюгат флюоресцентный специфический; коньюгат флюоресцентный нормальный;

краситель Эванса, 0,25 %-ный раствор в буферном растворе.

2.3. Подготовка к исследованию

2.3.1. Из проб органов при помощи криотома, микротома или термоэлектрического ножа (при сильном замораживании) готовят срезы толщиной 5 мк, которые помещают на обезжиренные предметные стекла и высушивают в течение 30 мин при 4°С.

Из проб костного мозга и лейкоцитарного концентрата готовят мазки (см. обязательное приложение 3).

2.3.2. Препараты (срезы и мазки) фиксируют ацетоном в течение 10 мин при минус 20 °С или в течение 5—10 мин при комнат

ной температуре. После фиксации препараты высушивают на воздухе при комнатной температуре до полного испарения ацетона.

Фиксированные препараты допускается хранить в морозильнике при температуре не менее минус 20 °С в течение 6 мес.

2.3.3. Фиксированные препараты двукратно промывают фосфатным буферным раствором (pH 7,2), после чего оставляют их в растворе на 10 мин.

Увлажненные препараты допускается хранить до использования во влажной камере при 4°С в течение 3 дней.

2.3.4. Подготовленные препараты окрашивают методом контрастной иммунофлюоресценции.

Для этого приготовляют на фосфатном буферном растворе (pH 7,2) рабочие разведения специфического и нормального флюоресцентного конъюгата в соответствии с указаниями, нанесенными на этикетках препаратов. К полученным разведениям конъюгатов добавляют краситель Эванса в соотношении: 3 части коньюгата и 1 часть красителя.

Окрашивают следующие препараты:

три препарата, приготовленных из исследуемых проб; из них два препарата покрывают специфическим коньюгатом с красителем Эванса, а третий—(нормальным коньюгатом с красителем Эванса (контроль);

два препарата, приготовленных из органов свиней, не инфицированных вирусом чумы, покрывают специфическим коньюгатом с красителем Эванса (контроль).

Окрашенные препараты выдерживают в термостате в течение 30 мин при 37°С или в течение 12—18 ч при комнатной температуре.

Препараты двукратно промывают в фосфатном буферном растворе, после чего оставляют на 10 мин в свежей дистиллированной воде.

После частичного высушивания на воздухе препараты покрывают буферным глицерином (9 частей нефлюоресцирующего глицерина и 1 часть фосфатного буферного раствора с pH 8,0) и закрывают покровными стеклами.

При необходимости покровные стекла фиксируют парафином. Окрашенные препараты хранят при 4°С в течение 3—4 недель без потери специфической флюоресценции.

2.4. Проведение исследования

2.4.1. Препараты просматривают под люминисцентным микроскопом.

2.5. Обработка результатов

2.5.1. Специфическая флюоресценция характеризуется желтовато-зеленоватым и зеленоватым оттенками свечения цитоплазмы разных клеток (в зависимости от оптики и системы освещения).

Ядра клеток выглядят темными и не флюоресцируют. Фон препаратов имеет флюоресценцию красно-оранжевого цвета.

В срезах из селезенки и лимфатических узлов флюоресцирующие клетки рассеяны или сконцентрированы вокруг сосудов и синуса.

В препаратах из миндалин флюоресценция более ясная и выявляется в базальных клетках поверхностного эпителия и эпителия крипт.

В срезах почек специфическая флюоресценция устанавливается главным образом в различных клетках почечных и интерасциаль-ных поперечных срезов канальцев.

В мазках из красного костного мозга специфическая флюоресценция отличается большей яркостью, размером и количеством флюоресцирующих клеток.

Аналогичная флюоресценция выявляется в мазках из лейкоцитарного концентрата.

Специфическая флюоресценция в цитоплазме даже в отдельных клетках препаратов, полученных от животных, подозреваемых в заболевании, указывает на наличие вируса классической чумы свиней.

Все контрольные срезы и мазки не должны иметь желтоватозеленоватой флюоресценции цитоплазмы. 3

3. МЕТОД ПОСТАНОВКИ БИОПРОБЫ

Сущность метода заключается в выявлении наличия вируса чумы свиней путем введения восприимчивому животному (свинье) суспензии, полученной из органов, взятых от больных или подозреваемых в заболевании животных.

3.1. Метод отбора проб

3.1.1. Для постановки биопробы от больных, павших или убитых животных берут кровь, селезенку, лимфатические узлы, трубчатую длинную кость.

Кровь от животных для проведения биопробы берут с соблюдением правил асептики.

Если органы начали портиться, то проводят сечение трубчатой длинной кости и извлекают мозг, который используют для проведения исследования.

3.2. Аппаратура, материалы и реактивы

3.2.1. Для проведения исследования применяют:

центрифугу с частотой вращения 5000 об/мин;

ступку или измельчитель ткани;

антибиотики (пенициллин, стрептомицин или другие антибиотики с широким спектром действия);

мертиолат натрия (тиомерсал),

3.3. Подготовка к исследованию

3.3.1. Кусочки селезенки и лимфатические узлы измельчают при помощи ножниц. Измельченные пробы селезенки и лимфатических узлов или костного мозга растирают в ступке с малым количеством физиологического раствора, добавляют физиологический раствор до получения 10%-ной суспензии. К полученной суспензии добавляют пенициллин и стрептомицин по 300—1000 ЕД/см 3 , тиомерсал в конечной концентрации 1:5000 — 1 : 10000 и выдерживают не менее 4 ч при 4°С.

суспензию центрифугируют в течение 10 мин с частотой вращения 4000—5000 об/мин. “

Надосадочную жидкость используют для проведения биолробы. Перед использованием из надосадочьзй жидкости делают посевы на питательные среды.

3.4. Проведение исследования

3.4.1. Берут пять поросят в возрасте 2—3 мес, массой 20—30 кг, восприимчивых к чуме свиней. Трем животным вводят подкожно по 1 см 3 крови или по 2 см 3 суспензии органов. Двух поросят, не инокулированных исследуемым материалом, содержат отдельно для контроля.

Двум поросятам, иммунным к чуме свиней, вводят исследуемый материал в тех же дозах с целью дифференциальной диагностики в отношении африканской чумы свиней.

За подопытными животными ведут клиническое наблюдение в течение 21 сут с ежедневным измерением температуры тела.

3.5. Обработка результатов

3.5.1. Диагноз на классическую чуму свиней считают положительным:

если два из трех неиммунных поросят, которым был введен исследуемый материал, заболевают, проявляя клинические признаки болезни, и погибают;

если два иммунных поросенка, которым введен исследуемый материал, в период наблюдения остаются здоровыми или проявляют незначительные и кратковременные (1—4 дня) клинические признаки болезни слабой интенсивности (повышение температуры тела не выше 41 °С).

3.5.2. Заболевание иммунных животных указывает на то, что исследуемый материал содержит возбудителя другой инфекции.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Обязательное

ПРИГОТОВЛЕНИЕ БЛОКОВ И ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ, ВКЛЮЧЕННЫХ В ПАРАФИН

Фиксированные и обработанные пробы выдерживают в 96%-ном этиловом спирте (три ванны), абсолютном спирте (три ванны) « амиловом спирте (три ванны). В каждой ванне кусочки выдерживают в течение 2 ч. Затем пробы выдерживают в трех парафино-восковых банях при 58°С по 2 ч в каждой.

Пробы вынимают из последней бани и включают в парафин в виде блоков специальной формы.

Сечение микротомом делают в виде ленты толщиной 5—7 мк.

При помощи игл фиксируют срезы в центре предметного стекла, предварительно смазанного слоем альбумина по Мейеру на нагревающей пластинке при 40°С. Альбумин по Мейеру готовят следующим образом: смешивают яичный белок и глицерин в соотношекпи 1:1.

Предметные стекла со срезами выдерживают в термостате при 37°С в течение 6—42 ч, после чего удаляют парафин, выдерживая в трех ваннах с растворителем в течение 10 мин в каждой.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Обязательное

ОКРАШИВАНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ

Стекла со срезами проводят через следующие ванны:

три ванны с 96%-ным этиловым спиртом — 5 мин;

две ванны с дистиллированной водой—1—2 мин;

одна ванна с гематоксилином — 5—10 мин;

две ванны с водопроводной водой—1—2 мин;

одна ванна с эцином — 3—5 мин;

две ванны с дистиллированной водой — 1—2 мин;

одна ванна с 1%-ной формолмолибденовой кислотой — 3—5 мин;

одна-две ванны с дистиллированной водой для промывания;

две ванны с 96%-ным этиловым спиртом (дифференциация);

две ванны с растворителем (прояснение—10—30 мин).

Стекло со срезами накрывают покровным стеклом, которое фиксируют канадским бальзамом.

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Обязательное

[.Приготовление мазков из красного костного мозга

Берут грудную кость, делают продольный разрез и вынимают красный костный мозг, из которого делают несколько мазков.

2. Приготовление мазков лейкоцитарного концентрата

От больных или подозреваемых в заболевании свиней собирают 15 см 3 крови в пробирку, содержащую антикоагулят. Кровь в пробирке энергично встряхивают для отделения плазмы и выдерживают пробирку в течение 1 ч при комнатной температуре.

Пастеровской пипеткой отбирают плазму с лейкоцитами и переносят в центрифужную пробирку. Плазму центрифугируют в течение 10 мин с частотой вращения 1000 об/мин, сливают надрсадочную жидкость, а из осадка беломолочного цвета делают 2—3 мазка.

Редактор Н Е. Шестакова Технический редактор О Н. Никитина Корректор В. Я. Варенцова

Сдано в наб 13 05 83 Подп к печ 15 06 83 0,625 п л 0,51 уч-изд л Тир 6000 Цена 3 коп.