Микробиологические исследования смывов на наличие возбудителей иерсиниозов

Обратившись в санэпидемслужбу, вы можете не только заказать такие распространенные услуги, как дезинфекция, дезинсекция или дератизация, но также обратиться в лабораторию при СЭС, которая проводит самые разные анализы. Одними из наиболее востребованных являются микробиологические смывы – на золотистый стафилококк, легионеллы, сальмонеллы и т.п.

Изучение микрофлоры смывов необходимо:

• Для определения санитарно-гигиенического состояния заведений общественного питания – ресторанов, кафе, столовых в школах, детских садах, больницах, а также предприятий пищевых торговых сетей – при этом исследуется загрязненность рабочих поверхностей, окружающих предметов и рук работающего в сфере общепита персонала.
• Для выявления путей распространения опасных инфекционных заболеваний – при этом изучаются смывы, взятые с поверхностей исследуемых объектов и рук людей.

При проверке организаций общественного питания микробиологический анализ смывов позволяет определить общий уровень загрязненности предприятия, наличие или отсутствие нарушений в технологиях приготовления продуктов питания, сделать выводы о соблюдении санитарно-гигиенических норм. Также с помощью анализа смывов можно определить правильность хранения продуктов и готовых блюд. Главная же цель микробиологического анализа смывов – это снижение рисков отравлений, острых кишечных отравлений и других заболеваний, связанных с приемом некачественной пищи. Анализ результатов исследования и принятие соответствующих мер по повышению санитарно-гигиенического уровня на предприятии – залог высокого качества и безопасности продукции.

Каждое предприятие общественного питания обязано регулярно осуществлять санитарно-бактериологический контроль, который связан с исследованием предметов и объектов, соприкасающихся с пищей или используемых при её приготовлении, обработке и хранении. Обычно исследуются:

• Вода, используемая в процессе производства,
• Оборудование, бытовые предметы, кухонный инвентарь,
• Продукты и полуфабрикаты, готовые блюда и сырье,
• Смывы с рабочей одежды и кожи рук работников предприятия общепита, с рабочих столов (используемых для обработки пищевых продуктов),
• Пробы с посуды и столовых приборов.

Физические лица также могут заказать исследование микробиологических смывов:

• Это возможность дополнительно позаботиться о здоровье членов семьи,
• Шанс проверить соответствие условий жилого помещения - квартиры или дома санитарно-эпидемиологическим нормам.

Методика сбора и изучения смывов широко используется во всем мире, поскольку дает очень точные и объективные результаты, а также помогает определить присутствие тех или иных патогенных микроорганизмов.

В нашей лаборатории при санэпидемслужбе можно заказать следующие виды исследований:

• Микробиологические смывы БГКП – позволяют определить наличие или отсутствие бактерий группы кишечных палочек.
• Микробиологические смывы ОМЧ помогают установить общее микробное число, т.е. количество микроорганизмов 1 кубическом метре воздуха. С помощью этого исследования проверяется микробиологическое состояние вентиляционных систем и систем кондиционирования.
• Микробиологические смывы Сальмонеллы применяются для определения обсемененности сальмонеллами объектов внешней среды, а при вспышках сальмонеллеза – для установления источников заболевания и факторов передачи возбудителей.
• Итоговая обсемененность – исследование позволяет установить микробиологическую загрязненность воздуха в офисах и административных помещениях.
• Микробиологические смывы Легионеллы включают анализ воздуха и смывов на наличие бактерий Legionella, которые способны вызвать легионеллез – тяжелое заболевание, поражающее легкие человека и напоминающее пневмонию.
• Микробиологические смывы на Золотистый стафилококк – исследование смывов на наличие патогенного стафилококка, санитарно-показательного микроорганизма, который может вызвать самые разные гнойно-воспалительные заболевания, хотя также встречается и бессимптомное носительство.
• Микробиологическое исследование плесени, грибка и дрожжей

Наших заказчиков часто интересует, как происходит забор материалов для исследования. Смывы собирают стерильными салфетками или ватными тампонами, которые предварительно смачивают стерильным изотоническим раствором.

Существуют некоторые правила забора материала для анализов:

• Смывы с инвентаря и оборудования производят в санитарные дни после санитарной обработки или перед началом работы,
• Если смыв необходимо взять с больших площадей – столы, стены, тогда пробы берут в нескольких местах (для площади в 100*100 см).
• При сборе смывов с рук сотрудников общепита используют также стерильные тампоны или салфетки, которыми протирают тыльную часть кисти, затем ладонь не менее 5 раз, после чего межпальцевые участки и ногтевое ложе, а также зону под ногтями.
• Собирая смывы с санитарной одежды, необходимо протереть 4 участка площадью 5*5 см каждый: нижние части обоих рукавов, а также 2 участка с нижней и верхней части переда спецовки.

Заказав анализ микробиологических смывов в частном порядке до проверки контролирующего органа, любое предприятие общепита сможет заранее выявить имеющиеся проблемы, устранить их и тем самым благополучно избежать санкций и штрафов.

Энтеропатогенные иерсинии (Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis) вызывают кишечные инфекции, характеризующиеся поражением лимфоидного аппарата кишеч­ника, токсико-аллергическими осложнениями, развитием генерализованных процессов.

Микробиологическая диагностика иерсиниозов включает бактериологическое и серологическое исследования.

Бактериологическое исследование.Материал, подлежащий исследованию (фекалии, кишечные биоптаты, лимфоузлы или ткань удаленного аппендикса, кровь, слизь из ротоглотки), об­рабатывают в течение 1 минуты 0,5% раствором гидроксида ка­лия в 0,5% хлориде натрия, затем делают посевы на агар CIN, Серова или среду Эндо, которые после посева инкубируют при 32 °С в течение 24—48 ч или 24 ч при 37 0 С и столько же при комнатной температуре. Параллельно посевы помещают в холодильник при температуре +4 0 С (иерсинии хорошо растут при низ­ких температурах). Пересевы со среды накоп­ления выполняют на 3, 5, 10, 15-е сутки на указанные выше питательные среды.

На 3-й (4-й) день проводят идентификацию чистой культуры по биохимическим и антигенным свойствам (биовар, серогруппа с помощью РА у культур, выращенных при температуре ниже 30 0 С), учитывают тем­пературу физиологического оптимума иерсиний (28-30 0 С), определяют чувствительность к анти­биотикам. Воз­будители иерсиниоза и псевдотуберкулеза оксидазоотрицательны, ферментируют до кислоты глю­козу, обладают нитратредуктазой и другими свойствами (см. табл. 5).

В отличие от возбудителя псевдотуберкулеза, бактерии вида Y. enterocoliticaпо биологическим свойствамгетерогенны, включая безусловно-патогенные, условно-патогенные (возбудители оппортунистической инфекции или пищевого отравления) и непатогенные для человека иерсинии. Определение факторов виру­лентности у Y. enterocoliticaпредполагает постановку реакций аутоагглютинации и кальцийзависимости, пиразинамидазного теста, определение плазмидассоциированных антигенов.

Тест аутоагглютинации.В две пробирки со средой Кларка за­севают исследуемый штамм, инкубируют в течение 24 ч одну пробирку при 37 0 С, другую - при 26 - 28 0 С. При наличии вирулентности бактерии, выращенные при температуре 37 0 С, склеиваются в виде хлопьев, оседающих на дно и стенки пробирки. Культура, инкубированная при температуре 26 – 28 0 С, не агглютинируется.

Определение пиразинамидазной активности.На скошенную среду с пиразинамидом, засевают исследуемые культуры, выращенные при температуре 25-30 0 С на ПА, инкубируют при той же температуре в течение 48 часов, после чего смачивают скошенную поверхность раствором суль­фата аммонийного железа, оставляя пробирку при комнатной температуре в течение 15 мин. В пробирках с культурами патогенных иер­синий цвет среды остаются без изме­нений; непатогенные иерсинии меняют цвет скошенной части среды на коричневый.

Тест кальцийзависимости ставят на кальций-дефицитном агаре, который готовят путем добавления раствора оксалата натрия к расплавленному МПА. После перемешивания вносят 4 мл 0,5М раствора хлорида магния. Исследуемую культуру засевают на 2 чашки с кальций-дефицитным агаром, одну чашку инкубируют 24 — 48 часов при 37 0 С, другую - при 26 - 28 0 С. При наличии вирулентности при дефиците кальция у клеток, инкубированных при 37 °С (но не 26 – 28 0 С), прекращается рост бактерий, при этом колонии на чашке либо имеют карликовые размеры (Y. enterocolitica), либо отсутствуют совсем (чаще у Y. pseudotuberculosis). При 26 – 28 0 С так же, как у непатогенных иерсинии при двух температурных режимах, на­блюдается рост колоний обычных размеров.

Серологическое исследованиезаключается в постановке РА, РНГА или ИФА с иерсиниозными диагностикумами и парными сыворотками крови больных с подозрением на иерсиниоз с целью определения специфических антител.

Генодиагностика – обнаружение типичных фрагментов ДНК патогенных иерсиний в клиническом материале или пищевых продуктах мето­дами ДНК-ДНК-гибридизация или ПЦР-анализа.

Микробиологическое исследование включает выделение возбудителя с целью диагностики заболевания у людей и животных, а также для эпидемиологического расследования при осложнении ситуации. Кроме того, используются иммунологические методы с целью выявления антител и антигенов.

а) Бактериологическое исследование иерсиний. С учетом биологии возбудителей псевдотуберкулеза и иерсиниоза бактериологическое исследование материала от больных людей, животных и объектов окружающей среды проводят с использованием одних и тех же сред накопления и плотных питательных сред для их выращивания. Исследуют различный материал от больных людей, животных и различных объектов внешней среды.

Подготовка материала для посева:

— Корнеплоды (морковь, редис и др.), фрукты (в том числе цитрусовые), овощи (помидоры, огурцы свежие), яйца (неповрежденные). Все перечисленные продукты в количестве 5-10 штук тщательно обмывают тампоном и помещают в емкости с 50 мл среды подращивания.

— Овощи — лук зеленый, репчатый, листья салата, зелень, 1 -2 верхних листа капусты разрезаются на несколько частей. Подготовленные объекты помещают в специальные емкости и заливают средой подращивания на 2-3 см выше уровня материала.

— Сыр, творог, брынза, колбаса, сосиски, масло сливочное, кремы, 25,0-30,0 г (или порция), измельчают и помещают в стеклянные емкости с 50 мл среды подращивания;

— Молоко, сметана, рассол, компот, соки, 5-10 мл, помещают в 50 мл среды подращивания.

— Воду питьевую фильтруют через ватный тампон или обычные санитарно-бактериальные фильтры, которые помещают в 50 мл среды подращивания.

При поступлении пробирок со смывами (тампонами), сделанными на месте взятия материала с поверхностей различных объектов окружающей среды, рук или зева персонала пищеблоков либо с овощей, в них добавляют 4-5 мл среды подращивания (на 2 см выше тампона).

Испражнения: 0,5-1,0 г испражнений помещают в пробирку с 5 мл среды накопления. Если материал доставлен в пробирке с тампоном (петлей), необходимо долить их средой накопления на 2-3 см выше тампона.

Моча: осадок после центрифугирования доливают средой подращивания 1:5. При исследовании цельной мочи 50 мл разводят 1:1 средой подращивания.

Кровь (в первые дни заболевания) засевают в бульон. При необходимости серологического исследования вначале после свертывания используют сыворотку. Для посева используют сгусток, который измельчают и заливают 5 мл бульона.

Органы и ткани, взятые при операции людей, от животных или трупов людей измельчают. Каждый отдельно по 1,0-1,5 г помещают в среду подращивания.

В практической работе целесообразно использовать следующую схему бактериологического исследования.

Первый день. После предварительной подготовки материала его заливают средой подращивания. Для этого используют следующие среды — пептонно-калиевую, буферную пептонную воду или буферно-казеиново-дрожжевую. Материал ставят в холодильник и выдерживают в нем до положительного высева.

Второй — третий день. Из сред подращивания делают первый высев на плотные питательные среды. Для этого бактериологической петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности), не взбалтывая содержимое пробирок, засевают материал частыми штрихами на плотные дифференциально-диагностические среды: Эндо, СБСТ, селективный дезоксихолатный агар. Из пробирок с посевом крови делают высев на чашки со слабощелочным агаром.

Чашки с посевом ставят в термостат при 22°С, чашки со средой СБСТ — при 37°С. Исходный материал хранят в холодильнике.

Третий — четвертый день. Посевы на плотных питательных средах просматривают визуально, в том числе и через лупу, или в микроскопе с малым увеличением, снимают по 3-4 подозрительные колонии.

Колонии иерсиний на СБСТ через 48 ч инкубации при 37°С — зеленовато-синего цвета. Колонии энтеробактерий в зависимости от гидролиза мочевины могут быть синего цвета (клебсиеллы, протеи) или при отсутствии гидролиза — ярко-желтого (шигеллы, сальмонеллы, эшерихии).

На среде Эндо через 48 ч при 22°С вырастают колонии — мелкие круглые выпуклые блестящие с ровным краем. Колонии Y. pseudotuberculosis — бесцветные, Y. enterocolitica — слабо-розоватого цвета.

Колонии, имеющие вышеописанную характеристику, отсевают на плотные слабощелочные среды (МПА, агар Хоттингера). Для исключения протеев, алкалигенес колонии засевают также в пробирки с маннитом и мочевиной, ставят пробу на оксидазу.

Если в чашках с плотными средами не обнаружен рост колоний, посев повторяют из исходного материала, который после высева вновь помещают в холодильник (и так повторяют до 7-го дня, в некоторых случаях — до 10-го).

Четвертый — пятый день. Культуры с положительной пробой на разложение маннита, уреазу и отрицательной на оксидазу подлежат дальнейшей идентификации. Для этого материал засевают в среды Гисса, используя основные биохимические свойства бактерий, указанные в таблице ниже, и дополнительно — в пробирки со скошенным слабощелочным агаром. Пробирки помещают в термостат при 37°С (возможна инкубация при 22-25°С, но у некоторых субстратов при этой температуре реакция задерживается). Пробы на подвижность и реакцию Фогес — Проскауэра культивируют при температуре 22 и 37°С. Скошенный агар помещают при температуре 22-25°С в термостат. Для биохимической идентификации можно использовать систему API 20Е (bio-Merieux).

Пятый — шестой день. Проводят учет результатов биохимических рядов. При обнаружении культур со свойствами, соответствующими возбудителям иерсиниоза или псевдотуберкулеза, определяют серовар в реакции агглютинации (РА) с культурой, выросшей на скошенном агаре. РА ставится на стекле по общепринятой методике с диагностическими сыворотками к Y.pseudotuberculosis (0:1, 0:3 сероваров) и к Y.enterocolitica к штаммам сероваров: 0:3; 0:4,32; 0:5,27; 0:7,8; 0:8; 0:6,30; 0:9, а также в случае необходимости к штаммам Y.enterocolitica — 0:5; 0:4,33; 0:13,7. По результатам дают ответ. Специфические сыворотки производит НИИЭМ им. Пастера (С.-Петербург).

Культуры, имеющие отклонения, подвергают дальнейшему исследованию. Если не выделена культура, повторяют высев из исходного материала.

Каждый раз при повторном высеве материала на плотную питательную среду целесообразно применять методику щелочной обработки. Для посевов крови, мочи и слизи зева щелочная обработка не требуется. В лунку полистироловой пластинки наливают 0,2 мл рабочего раствора щелочи, затем вносят две полные петли (0,2 мл) исследуемого материала, перемешивают и через 3-5 мин все содержимое лунки высевают на бульон Хоттингера. Посевы помещают в термостат при 22-25 или 37°С. Далее анализ проводят по схеме, указанной ранее.

Седьмой — десятый день. Для дифференциации штаммов Y. enterocolitica вирулентных и авирулентных вариантов проводят пробы, принятые в практике: аутоагглютинации и температурозависимой морфологии колоний. Другие тесты — заражение лабораторных животных, заражение монослоев перевиваемых культур (НЕр-2, HeLa) — возможны в специализированных институтах.

Тесты аутоагглютинации основаны на наличии у патогенных иерсиний плазмиды вирулентности pYV. Для постановки теста аутоагглютинации культуры Y. enterocolitica высевают на бульон Хоттингера и инкубируют при 26°С в течение 24 ч. Затем делают пересев на агар Хоттингера для получения изолированных колоний и инкубируют при той же температуре в течение 48 ч.

Для каждого штамма отбирают по 10 колоний и пересевают каждую в 2 пробирки со средой Кларка. Посевы инкубируют при 37 и 26°С. Результат учитывают через 24-48 ч.

Реакция аутоагглютинации считается положительной (наличие pYV+ иерсиний), если в 9 из 10 пробирок, инкубированных при 37°С, среда остается прозрачной или наблюдается легкое помутнение при наличии рыхлого хлопьевидного осадка в результате спонтанного склеивания клеток иерсиний, обусловленного гидрофобными белками на их поверхности. В пробирках, инкубированных при 26°С, отмечается равномерное помутнение среды и компактный осадок на дне, хлопья отсутствуют.

При отрицательном результате в пробирках, инкубированных при той и другой температурах, отмечается помутнение среды, хлопья отсутствуют.

Для оценки патогенных свойств выделенных Y.enterocolitica используется также иммунологический метод, основанный на выявлении белков наружной мембраны (антигенов вирулентности). Сыворотку получают иммунизацией кроликов вирулентным штаммом, содержащим pYV+ (сыворотка выпускается НИИЭМ им. Пастера, С.-Петербург). Для постановки реакции культуру иерсиний засевают на агар Хоттингера и инкубируют при 37 и 26°С в течение 18-24 ч.

Реакция ставится на стекле. Это помогает выявить патогенные штаммы среди гетерогенных по этому признаку штаммов Y. enterocolitica, циркулирующих среди грызунов и объектов внешней среды.

в) Экспресс-диагностика иерсиний. Выявление антигенов иерсиний. Выявление специфических антигенов бактерий является перспективным для ранней диагностики. К настоящему времени применительно к иерсиниям разработаны следующие методы.

Метод коагглютинации (РКоА), позволяющий выявлять микробные антигены, а также связанные антигены в составе иммунных комплексов.

Реакция агглютинации латекса (ЛА) для выявления антигенов возбудителей псевдотуберкулеза в конрофильтратах больных и в объектах внешней среды. Диагностикум выпускается НИИВС (С.-Петербург).

Тест-система ИФА для выявления антигенов Y.pseudotuberculosis 01 серовара (выпускается ФГУП НИИЭМ им. Пастера, С.-Петербург).

Генетические методы. ТЩР-анализ, был испытан для ранней диагностики псевдотуберкулеза, расследования вспышек, для выявления циркуляции иерсиний среди грызунов; он показал диагностическую ценность. Но этот метод пока еще не внедрен в практику. Имеются лишь единичные сообщения об его использовании.

г) Серологическая диагностика иерсиний. Серологическое исследование проводится в случае обследования больных, здоровых людей, а также животных.

Кровь для исследования берут из вены или пальца, собирают в стерильную пробирку, помещают в термостат при 37°С на 30-60 мин для образования сгустка. Затем сгусток отделяют от стенок и пробирку переносят в холодильник. Возможно отделение сгустка центрифугированием. Из полученной сыворотки делают двукратные разведения, начиная с 1:100.

Используют реакцию агглютинации с типовым или аутоштаммом, а также реакцию гемагглютинации с коммерческими диагностикумами — псевдотуберкулезным или кишечно-иерсиниозным 03 и 09. Диагностикумы выпускает НИИВС (С.-Петербург).

Начальным диагностическими титром считается разведение 1:200 для РА и 1:160 — для РИГА при наличии реакции на 3 или 4 креста. Для подтверждения диагноза необходима оценка динамики титра антител в повторном исследовании сыворотки на 10-14-й день заболевания.

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 3.1.2020

Рефераты и конспекты лекций по географии, физике, химии, истории, биологии. Универсальная подготовка к ЕГЭ, ГИА, ЗНО и ДПА!

Микробиологическая диагностика иерсиниоза

Кишечный иерсиниоз и псевдотуберкулез - острые инфекционные заболевания, протекающие с преимущественным

поражением желудочно-кишечного тракта. Возбудители принадлежат к семейству Enterobacteriaceae, рода Yersinia (Y.pseudotuberculosis и Y. enterocolitica).

Микробиологической диагностики этих заболеваний используют микроскопический, бактериологический, серологический и аллергологический методы.

Материалом для исследования кровь, моча, стул, продукты питания.

Микроскопический метод. В мазках, изготовленных из испражнений, мочи и крашеных по Граму Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica имеют вид безспорових грамотрицательных палочек размером от 1-3 - 0,5-0,8 мкм. Оба вида бактерий подвижные при температуре 18-20ºС и неподвижные при температуре 37 ° С.

Бактериологический метод. Основан на выделении возбудителя, как правило, с каловых масс больного. Сначала материал для исследования высевают в жидкие среды накопления (фосфатно-буферный раствор, 1% пептонная вода) и выдерживают в холодильнике при температуре 5-6 ° С для накопления иерсиний в микробных ассоциациях. При недостаточности питания и низкой температуре иерсинии накапливаются быстрее других энтеробактерии. На 3-5 сутки выполняют висел из среды накопления на чашки Петри со средами Эндо, Плоскирева, Серова, предварительно обработанные слабым раствором щелочи, и помещают в термостат для культивирования.

Y. enterocolitica на плотных средах образует мелкие, круглые, выпуклые блестящие колонии с ровными краями, с блакитино-серым оттенком. В процессе старения колонии сливаются и растут сплошь. На среде Эндо образуются колонии с розовым оттенком. В редких питательных средах наблюдают диффузный рост в виде помутнения.

Y. pseudotuberculosis образуют как S- так и R-формы колоний. S-формы Y. pseudotuberculosis - мелкие, блестящие, серовато-желтые и менее прозрачные чем в Y. enterocolitica. На среде Эндо колонии бесцветные. R-формы - выпуклые, бугристые, средних размеров, часто с фестончатыми краями. В процессе старения колонии увеличиваются в размерах и теряют свою прозрачность. В жидкостных питательных средах иерсинии дают диффузный рост в виде помутнения или в виде осадка хлопьев, оставляя среду прозрачным. Отбирают подозрительные колонии, выросшие и изготавливают из них мазки, которые окрашивают по Граму, микроскопируют. Часть колонии, которая остались, пересевают на скошенный питательную среду для накопления чистой культуры микробов. Пробирки помещают в термостат на 48-72 часов при температуре 22-30 ° С.

Полученную чистую культуру микроорганизмов высевают в пестрый ряд Гиса для изучения биохимических свойств.

Иерсинии не образуют сероводорода, проявляют уреазная активность. Ферментируют большинство углеводов, исключая лактозу и мычать, без образования газа. В иерсиний псевдотуберкулеза реакция Фогеса-Проскауера всегда отрицательная, тогда как в кишечных иерсиний при температуре 22-28 ° C она положительная. Псевдотуберкульозни микробы от кишечных иерсиний отличаются по отношению к сахарозы и рамнозы, лизабельнистю псевдотуберкульозним бактериофагом и аглютинабельнистю соответствующими видовыми сыворотками.

Для изучения антигенных свойств выполняют реакцию агглютинации на стекле с адсорбированной диагностической сывороткой при разведении 1:10. Результаты оценивают через 3-5 минут.

Серологический метод. С целью выявления специфических антител в крови больного используют реакцию агглютинации и реакцию пассивной гемагглютинации (см. Приложение). Исследуют парные сыворотки, отобранные в начале и на 3-й неделе заболевания. Развернутая РА типа Видаля выполняется с соответствующими диагностикумами. Реакцию считают положительной при титре антител 1: 200 и выше. Реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) ставят с эритроцитарных псевдотуберкульозним и кишковоиерсиниозним диагностикумами. РПГА считается положительной при титре 1: 160 - 1: 200 и выше.

При исследовании парных сывороток, наиболее вероятным считают прирост титров антител в 4 раза и больше.

В экспресс-диагностике псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза для выявления антигенов иерсиний в материале, который исследуется, в первые дни заболевания может быть использован ИФА (см. Приложение).

Аллергологический метод. Для постановки внутрикожной пробы * используют алергодиагностични препараты "псевдотуберкулин" и "ентероиерсин". Учет пробы проводят через 24 часа. Реакция считается положительной, если в месте введения 0,1 мл аллергена образуется папула и зона гиперемии диаметром 10 мм и более.