Питательная среда для выделения возбудителя сибирской язвы сухая

Об актуальных изменениях в КС узнаете, став участником программы, разработанной совместно с ЗАО "Сбербанк-АСТ". Слушателям, успешно освоившим программу выдаются удостоверения установленного образца.

Программа разработана совместно с ЗАО "Сбербанк-АСТ". Слушателям, успешно освоившим программу, выдаются удостоверения установленного образца.

Обзор документа

Письмо Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения от 29 января 2014 г. N 01И-63/14 "О фальсифицированном медицинском изделии"

Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения сообщает о поступившей информации о выявлении фальсифицированных медицинских изделиях:

- "Питательная среда для культивирования сибиреязвенного микроба, сухая", производства ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии;

- "Селективная добавка для выделения возбудителя сибирской язвы", производства ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии.

Поставщик: ЗАО "ЭКОлаб-Диагностика": 142530, г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1.

Поставки сопровождались регистрационным удостоверением N ФСР 2011/10648 от 27.12.2011, выданным на медицинское изделие "Набор реагентов для бактериологических исследований "Питательная среда для выделения возбудителя сибирской язвы сухая" по ТУ 9398-117-78095326-2010", производитель: Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

1. Фальсифицированное изделие "Питательная среда для культивирования сибиреязвенного микроба, сухая" имеет следующие основные отличительные признаки:

Признак	Фальсифицированное изделие	Оригинальное изделие
Этикетка	Бумажная	Самоклеющаяся
Маркировка: название производителя	ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии	ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии
Маркировка: наименование изделия	Питательная среда для культивирования сибиреязвенного микроба, сухая	Питательная среда для выделения возбудителя сибирской язвы сухая
Маркировка: состав (г/л)	Белковая основа - 30,0 Натрий хлористый - 3,0 Агар - * рН *	Панкреатический гидролизат рыбной муки - 15,0 Пептон ферментативный - 15,0 Натрий хлористый - 4,5 Триметоприм - 0,025 Натрий углекислый - 0,1-0,5 Агар - * рН 7,2-7,5

2. Фальсифицированное изделие "Селективная добавка для выделения возбудителя сибирской язвы" имеет следующие основные отличительные признаки:

Признак	Фальсифицированное изделие	Оригинальное изделие
Маркировка вторичной упаковки (коробка): название производителя, наименование изделия, ТУ	ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Селективная добавка для выделения возбудителя сибирской язвы к среде "Питательная среда для выделения возбудителя сибирской язвы сухая" Информация о нормативном документе (ТУ) отсутствует	ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Селективная добавка для выделения возбудителя сибирской язвы к среде "Питательная среда для выделения возбудителя сибирской язвы сухая" Указаны ТУ 9398-117-78095326-2010
Маркировка вторичной упаковки (коробка), условия хранения	Хранить при температуре от 2 до 30°С	Хранить при температуре от 2 до 6°С
Маркировка этикетки флакона: наименование изделия, масса	Селективная добавка для выделения сибиреязвенного микроба Полимексина В-сульфат 0,025 г	Селективная добавка для выделения возбудителя сибирской язвы 0,011 г
Инструкция по применению	Ссылка на регистрационное удостоверение отсутствует	Указано регистрационное удостоверение N ФСР 2011/10648 от 27.12.2011

Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения предлагает субъектам обращения медицинской продукции провести проверку наличия в обращении указанных медицинских изделий, в установленном порядке провести мероприятия по предотвращению обращения на территории Российской Федерации фальсифицированных медицинских изделий и о результатах проинформировать соответствующий территориальный орган Росздравнадзора.

Территориальным органам Росздравнадзора информацию о выявлении фактов поставки указанных фальсифицированных медицинских изделий направить в правоохранительные органы и проинформировать Росздравнадзор.

Врио руководителя

М.А. Мурашко

Обзор документа

Сообщается о поступившей информации о выявлении фальсифицированных медицинских изделий. Это - "Питательная среда для культивирования сибиреязвенного микроба, сухая" и "Селективная добавка для выделения возбудителя сибирской язвы".

Перечислены основные отличительные признаки фальсифицированных изделий.

Субъектам обращения медицинской продукции предлагается проверить наличие в обращении указанных изделий, провести мероприятия по предотвращению их обращения в России и о результатах проинформировать территориальный орган Росздравнадзора.

Сибирская язва - острая антропонозная инфекцион­ная болезнь, вызываемая Bacillus anthracis, харак­теризуется тяжелой интоксикацией, поражением кожи, лимфатических узлов.

Таксономия. Возбудитель относится к отделу Firmicutes, роду Bacillus.

Морфологические свойства. Очень крупные грамположительные палочки с обрубленными концами, в мазке из чистой куль­туры располагаются короткими цепочками (стрептобациллы). Неподвижны; образуют расположенные центрально споры, а также капсулу.

Культуральные свойства. Аэробы. Хорошо растут на простых питательных средах в диа­пазоне температур 10—40С, температурный оптимум роста 35С. На жидких средах дают придонный рост; на плот­ных средах образуют крупные, с неровными краями, шерохо­ватые матовые колонии (R-форма). На средах, содер­жащих пени­циллин, через 3ч роста си­биреязвенные бациллы образу­ют сферопласты, расположен­ные цепочкой и напоминаю­щие в мазке жемчужное ожерелье.

Биохимические свой­ства. Ферментативная актив­ность достаточно высока: воз­будители ферментируют до кислоты глюкозу, сахарозу, мальтозу, крахмал, инулин; обладают протеолитической и липолитической активностью. Выделяют желатиназу, обладают слабой гемолитической, лецитиназной и фосфатазной активностью.

Выделяют желатиназу, проявляют низкую гемолитическую, лецитиназную и фосфатазную активность.

Антигены и факторы патогенности. Содержат родовой соматический полисахаридный и видовой белковый капсульный антигены. Образуют белковый экзотоксин, обладающий антигенными свойствами и состоящий из нескольких компонентов (летальный, протективный и вы­зывающий отеки). Вирулентные штаммы в восприимчивом организме синтезируют сложный экзотоксин и большое количество капсульного вещества с выраженной антифагоцитарной активнос­тью.

Резистентность. Вегетативная форма неустойчива к фак­торам окружающей среды, споры чрезвычайно устойчи­вы и сохраняются в окружающей среде, выдержи­вают кипячение. Чувствительны к пенициллину и другим антибиотикам; споры устойчивы к антисептикам.

Эпидемиология и патогенез. Источник инфекции — больные животные, чаще крупный рогатый скот, овцы, свиньи. Человек заражается в основном контактным путем, реже али­ментарно, при уходе за больными животными, переработке животного сырья, употреблении мяса. Входными воротами инфекции в большинстве случаев явля­ются поврежденная кожа, значительно реже слизистые оболоч­ки дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. В основе патогенеза лежит действие экзотоксина, который вызывает коагуляцию белков, отек тканей, приводят к развитию токсико-инфекционного шока.

Клиника. Различают кожную, легочную и кишечную формы сибирской язвы. При кожной (локализованной) форме на месте внедрения возбудителя появляется характерный сибиреязвенный карбункул, сопровождается отеком. Легочная и кишечная формы относятся к генерализованным формам и выражаются геморрагическим и некротическим поражением соответствующих органов.

Иммунитет. После перенесенной болезни развивается стой­кий клеточно-гуморальный иммунитет.

Микробиологическая диагностика:

Наиболее достоверным методом ла­бораторной диагностики сибирской язвы является выделение из исследуемого материала культуры возбудителя. Диагностическую ценность представляют также реакция термопреципитации по Асколи и кожно-аллергическая проба.

Бактериоскопическое исследование. Изучение окрашенных по Граму мазков из патологического материала позволяет обнаружить возбудителя, представляющего собой грамположительную крупную неподвижную стрептобациллу. В организме больных и на белковой питатель­ной среде микроорганизмы образуют капсулу, в поч­ве— споры.

Бактериологическое исследование.Исследуемый материал за­севают на чашки с питательным и кровяным агаром, а также в пробирку с питательным бульоном. Посевы инкубируют при 37С в течение 18ч. В бульоне В. anthracis растет в виде хлопьевидного осадка; на агаре вирулентные штаммы образуют колонии R-формы. Авирулентные или слабовирулентные бактерии образуют S-формы ко­лоний.

Биопроба.Исследуемый материал вводят подкожно морским свинкам кроликам. Готовят мазки из крови и внутренних органов, делают посевы для выделения чистой культуры возбудителя.

Экспресс-диагностикапроводится с помощью реакции термо­преципитации по Асколи и иммунофлюоресцентного метода.

Реакцию Асколи ставят при необходимости диагности­ровать сибирскую язву у павших животных или у умерших людей. Образцы исследуемого материала измельчают и кипятят в пробирке с изотоническим раствором хлорида натрия в течение 10 мин, после чего фильтруют до полной прозрачности.

Метод иммунофлюоресценции позволяет выявить капсульные формы В. anthracis в экссудате. Мазки из экссудата через 5—18 ч после заражения животного обрабатывают капсульной сибиреязвенной антисывороткой, а затем флюоресцирую­щей антикроличьей сывороткой. В препара­тах, содержащих капсульные бациллы, наблюдается желто-зеле­ное свечение возбудителя.

Кожно-аллергическая проба.Ставится на внутренней по­верхности предплечья — внутрикожно вводят 0,1 мл антраксина. При положительной реакции через 24 ч появляются гиперемия и инфильтрат.

Лечение: антибиотики и сибире­язвенный иммуноглобулин. Для антибактериальной терапии препарат выбора – пенициллин.

Профилактика. Для специфической профилактики исполь­зуют живую сибиреязвенную вакцину. Для экстренной профилактики назначают сибиреязвенный иммуноглобулин.

Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка.Получена из крови кролика, гипериммунизированного культурой В. anthracis. Применяется для постановки реакции термопреципитации по Асколи.

Сибиреязвенная живая вакцина СТИ.Высушенную взвесь живых спор В. an­thracis авирулентного бескапсульного штамма. Применяется для профилактики сибирской язвы.

Противосибиреязвенный иммуноглобулин.Гамма-глобулиновая фракция сыворотки крови лошади, гипериммунизированной живой сибиреязвенной вакциной и вирулентным штаммом В.anthracis, используется с профилактической и лечебной целью.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для бактериологической диагностики возбудителя сибирской язвы из объектов внешней среды и инфекционного материала. Среда содержит в качестве питательной основы ферментативный гидролизат казеина, натрий хлористый, калий хлористый, натрий фосфорнокислый 12-водный, агар-агар, полимиксина сульфат, фенолфталеинфосфат натрия, натрий углекислый кислый в заданном соотношении. Изобретение позволяет повысить дифференцирующие свойства питательной среды в отношении Bacillus anthracis. 5 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической и ветеринарной микробиологии, наиболее эффективно может быть использовано для бактериологической диагностики возбудителя сибирской язвы из объектов внешней среды и инфицированного материала и может найти практическое применение в санитарно-эпидемиологических и научно-исследовательских учреждениях Минздрава, Минобороны, МЧС России, занимающихся вопросами лабораторной диагностики возбудителя сибирской язвы.

Сохранение природных очагов сибирской язвы, а следовательно, наличие высокой опасности возникновения болезни обуславливает необходимость совершенствования методов обнаружения и идентификации возбудителя сибирской язвы. Для идентификации и изучения свойств возбудителя необходимым этапом является выделение его чистой культуры на питательной среде (Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. - М,, 2002., Груз Е.В. Изучение и рационализация некоторых лабораторных методов индикации и идентификации В.anthracis. Автореф. дисс.канд. мед, наук. - Одесса, 1965).

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной питательной среды, относится то, что эта среда не позволяет выделять чистую культуру, оценивать морфологию колоний, проводить дифференциацию сибиреязвенного микроба от близкородственных сапрофитов, а также разделять капсульные (вирулентные) и бескапсульные (авирулентные) штаммы В.anthracis.

Известна плотная питательная среда, содержащая питательную основу, бромтимоловый синий, агар-агар и D-сорбит (RU, патент, 2125610 С1, кл. 6 С 12 Q 1/02, 1999).

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной питательной среды, относится то, что эта среда сложна в приготовлении, имеет ограниченные сроки годности (не хранится, используется непосредственно по приготовлению), не содержит ингибиторов посторонней микрофлоры, не обладает способностью выявлять капсулу у В.anthracis.

Пептон Д или ферментолизат	12,0±2,0
Агар-агар	10,0
Натрия хлорид	6,0
Натрия карбонат	0,7
Триметоприм	0,05
Полимиксина М сульфат	0,05

Фенолфталеинфосфата натрия содержится в среде в виде 10%-ного раствора в аммиачном буфере.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной питательной среды, принятой за прототип, относится то, что состав данной среды не обеспечивает возможности выявления капсульных изолятов В.anthracis и не дифференцирует вирулентные и авирулентные штаммы возбудителя.

Технический результат - повышение дифференцирующих свойств питательной среды в отношении В.anthracis.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что диагностическая питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы сухая, содержащая питательную основу, минеральные вещества, агар-агар, фенолфталеинфосфат натрия и ингибитор роста сопутствующей микрофлоры - полимиксина сульфат, дополнительно содержит натрий углекислый кислый, а в качестве питательной основы - ферментативный гидролизат казеина, в качестве источника минеральных веществ - натрий хлористый, калий хлористый, натрий фосфорнокислый 12-водный, при следующем количественном содержании компонентов, г:

Ферментативный гидролизат казеина	34,00
Натрий хлористый	5,00
Калий хлористый	0,20
Натрий фосфорнокислый 12-водный	1,00
Агар-агар	20,00
Полимиксина сульфат	0,05
Фенолфталеинфосфат натрия	2,00
Натрий углекислый кислый	4,00

Только при вышеперечисленных составе и концентрациях компонентов диагностической питательной среды достигается указанный технический результат.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в таблице 1.

Изобретение позволяет повысить дифференцирующие свойства питательной среды в отношении В.anthracis за счет возможности проведения дифференциации капсулообразующих (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) форм возбудителя сибирской язвы.

Использование в составе заявляемой среды натрия углекислого кислого не ухудшает ее качества по селективным и элективным свойствам.

Возможность применения диагностической питательной среды для дифференциации капсульных (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) форм возбудителя сибирской язвы в пробах из объектов внешней среды и инфицирующего материала подтверждена нами экспериментальным путем и неизвестна из доступных источников информации.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами

Пример 1. Приготовление диагностической питательной среды

Диагностическая питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы сухая представляет собой набор, состоящий из основного компонента (флакон №1), содержащего питательную основу, натрий хлористый, калий хлористый, натрий фосфорнокислый 12-водный, агар-агар, фенолфталеинфосфат натрия, полимиксина сульфат и специфических добавок, представляющих собой 10% водный раствор аммиака (флакон №2) и натрий углекислый кислый (флакон №3).

Плотную диагностическую питательную среду готовят из сухой следующим образом.

Содержимое флакона №1 с основным компонентом размешивают в 0,8 дм 3 дистиллированной воды, оставляют для набухания на 30. 40 мин и затем кипятят в течение 5. 10 мин до полного расплавления агара, фильтруют. Доводят объем среды до 1 дм 3 дистиллированной водой. Значение рН-среды после смешения компонентов должно составлять 7,2±0,2. Стерилизуют автоклавированием при 120. 125°С в течение (30±1) мин. Среду делят на две равные части по объему. Содержимое флакона №2 (натрий углекислый кислый) непосредственно вносят в колбу с 0,5 дм 3 охлажденной до температуры (80. 90)°С диагностической питательной средой и перемешивают до его полного растворения. Охлажденную до температуры 45. 50°С среду разливают асептически по 15. 20 см 3 в стерильные чашки Петри с открытыми крышками, которые после застывания среды закрывают.

Для бактериологического контроля диагностической питательной среды, предназначенной для идентификации возбудителя сибирской язвы используют тест-штаммы В.anthracis СТИ-1, В. cereus 8, Pr.vulgaris 19, Е.coli 18 и В.anthracis Ч-7, полученные из ГИСК им Л.А.Тарасевича.

Пример 2. Использование диагностической питательной среды для выращивания В.anthracis.

Для определения ростовых свойств диагностической питательной среды, не содержащей натрий углекислый кислый, используют тест-культуру В.anthracis штамма СТИ-1, которую в количестве 0,1 см 3 из разведения 10 -6 и 10 -5 (1·10 2 и 1·10 1 спор см -3 ) по счету в камере Горяева наносят на поверхность среды (по три чашки Петри на каждую) и распределяют по поверхности среды покачиванием. Культуру выращивают в термостате при температуре (37±1)°С в течение (21±3) ч, после чего визуально производят учет результатов.

Сравнительная оценка ростовых свойств питательных сред представлена в таблице 2.

Из представленных в таблице 2 данных видно, что заявляемая среда обеспечивает рост типичных колоний в достаточном количестве и по своим ростовым свойствам не уступает прототипу.

Пример 3. Использование диагностической питательной среды для дифференциации (селекции) В.anthracis от сопутствующей микрофлоры.

Определение дифференцирующих (селективных) свойств диагностической питательной среды в отношении В.anthracis проводят следующим образом.

На 3 чашки Петри со средами, не содержащими натрий углекислый кислый, приготовленными согласно примеру 1, высевают по 0,1 см 3 и 0,01 см 3 смеси тест-культур: суспензии спор В.anthracis штамма СТИ-1 (1×10 4 спор см -3 ), Е.coli штамма 18 (1×10 4 микробных клеток см -3 ), Pr.vulgaris штамма 19 (1×10 4 микробных клеток см -3 ) с 0,9%-ным раствором хлористого натрия в соотношении 0,5:0,5:0,5:3,5. Смесь равномерно распределяют шпателем по поверхности среды. Чашки с засеянной смесью культур помещают в термостат и выдерживают при температуре (37±1)°С в течение 18. 24 ч, после чего производят учет результатов.

Сравнительная оценка дифференцирующих (селективных) свойств заявляемой и средой прототипом представлена в таблице 3.

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что как заявляемая, так и среда-прототип, с одной стороны, ингибирует рост сапрофитов Pr.vulgaris 19. Е.coli 18, с другой, - не влияет на рост В.anthracis СТИ-1.

Пример 4. Использование диагностической питательной среды для дифференциации В.anthracis от близкородственных сапрофитов.

Определение дифференцирующих свойств проводят визуально, путем изменения окраски колоний тест-культур. Для чего смесь тест-культур в объеме 0,1 см 3 , состоящую из штамма СТИ-1 (1×10 4 микробных клеток см -3 ), В.cereus 8 (1×10 5 микробных клеток см -3 ) и 0,9%-ного раствора хлористого натрия в соотношении 0,5:0,5:4,0 высевают на питательные среды, приготовленные согласно примеру 1, в чашки Петри и равномерно распределяют по поверхности шпателем. Посевы инкубируют при (37±1)°С в течение 36. 48 ч. Для выявления реакции на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри наносят 2. 3 капли 10%-ного раствора аммиака (флакон №3), чашку закрывают и через 5. 10 мин визуально проводят учет результатов по изменению окраски колоний. Реакция считается положительной, если колонии окрашиваются в ярко-розовый или малиновый цвет. Штамм СТИ-1 сибиреязвенного микроба не разлагает фенолфталеинфосфат натрия и его колонии не изменяют свой цвет. Колонии В.cereus 8 окрашиваются в ярко-розовый или малиновый цвет.

Сравнительная оценка дифференцирующих свойств заявляемой и средой-прототипом представлена в таблице 4.

Из представленных в таблице 4 результатов видно, что изученные среды, при выращивании B.anthracis штамма СТИ-1 и B.cereus 8, в равной степени обеспечивают межвидовую дифференциацию бактерий.

Пример 5. Использование диагностической питательной среды для дифференциации капсулообразующих (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) штаммов В.anthracis.

Определение капсулообразующей способности В.asthracis проводят на диагностической питательной среде, содержащей натрий углекислый кислый (приготовленной согласно примеру №1). Для проведения анализа необходим эксикатор.

Рабочую смесь тест-культур В.anthracis в объеме 0,1 см 3 , состоящую из штаммов СТИ-1 и Ч-7 по 20. 50 спор каждого штамма в 0,9%-ном растворе хлористого натрия, высевают на поверхность питательной среды в чашках Петри. Чашки помещают в эксикатор вместимостью 5 дм 3 , на дно которого насыпают 4,6 г натрия углекислого кислого и наливают туда же 30 см 3 5%-ного (объем/объем) раствора серной кислоты и путем притирания плотно закрывают его крышкой. Культуру выращивают в течение 24. 48 ч при (37±1)°С в термостате. Вместо эксикатора можно использовать СО₂-инкубатор с содержанием углекислого газа от 10 до 20% в воздушной смеси.

Учет результатов определения капсулообразующей способности В.anthraeis на питательной среде проводят визуально. Результаты представлены в таблице 5.

Из представленных в таблице 5 данных видно, что заявляемая среда, в отличие от прототипа, позволяет проводить дифференциацию капсулообразующих (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) штаммов сибиреязвенного микроба по морфологии их колоний.

Предлагаемая диагностическая питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы сухая характеризуется перед ранее известными средами следующими преимуществами:

- позволяет стабильно и эффективно проводить одновременно выделение и дифференциацию капсулообразующих (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) форм сибиреязвенного микроба;

- среда может быть использована для бактериологической диагностики возбудителя сибирской язвы из объектов внешней среды и инфицированного материала;

- среда обладает ингибирующими свойствами в отношении микробных сапрофитов;

- среда позволяет проводить как межвидовую дифференциацию бактерий (вид anthraeis от вида cereus), так и внутривидовую - капсулообразующих (вирулентных) и бескапсульных (авирулентных) штаммов сибиреязвенного микроба по цвету и морфологии их колоний;

- использование диагностической питательной среды предполагает ускорение процедуры выделения и идентификации сибиреязвенного микроба;

- сухая форма среды обеспечивает стабильность ее свойств в течение 2-х лет хранения при условии целостности упаковки в помещении с относительной влажностью воздуха не более 70% и температурой не выше 30°С.

Вышеперечисленные преимущества диагностической питательной среды позволяют использовать ее для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы и одновременной дифференциации его от близкородственных споровых бацилл, а также внутривидовой дифференциации между вирулентными капсулообразующими и авирулентными бескапсульными штаммами сибиреязвенного микроба.

Таблица 1Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом
Виды технического результата и их размерность	Показатели фактические или расчетные	Подробное объяснение за счет чего (отличительный признак и (или) их совокупность) стало возможным улучшение предлагаемого объекта по сравнению с прототипом
Прототипа*	Заявляемого объекта
Повышение дифференцирующих свойств питательной среды в отношении В.anthracis	Не проводит дифференциацию капсулообразующих и бескапсульных штаммы возбудителя сибирской язвы	Проводит дифференциацию капсулообразующих и бескапсульных штаммов возбудителя сибирской язвы	Обусловлено тем, что диагностическая питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы сухая дополнительно содержит натрий углекислый кислый, а в качестве питательной основы - ферментативный гидролизат казеина, в качестве источника минеральных веществ - натрий хлористый, калий хлористый, натрий фосфорнокислый 12-водный, при следующем количественном содержании компонентов, г:питательная основа (с аминным азотом 3,5%) - 34,0;натрий хлористый - 5,0;калий хлористый - 0,2;натрий фосфорнокислый 12-водный - 1,0;агар микробиологический - 20,0;полимиксина сульфат - 0,05;фенолфталеинфосфат натрия - 2,0;натрий углекислый кислый - 4,0
* Примечание. В качестве прототипа выбрана среда АДЭСБ (НИПЧИ г.Ростов-на-Дону)

Диагностическая питательная среда для идентификации возбудителя сибирской язвы сухая, содержащая питательную основу, минеральные вещества, агар-агар, фенолфталеинфосфат натрия и ингибитор роста сопутствующей микрофлоры - полимиксина сульфат, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит - ферментативный гидролизат казеина, в качестве источника минеральных веществ - натрий хлористый, калий хлористый, натрий фосфорнокислый 12-водный, а также дополнительно содержит натрий углекислый кислый, при следующем количественном содержании компонентов, г:

Глава 30. Возбудитель сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis включен в семейство Bacillaceae, род Bacillus. Название болезни - "углевик" дано русским врачом Андриевским, который в конце XVIII века изучал это заболевание в Сибири во время большой эпизоотии среди коров.

Возбудитель сибирской язвы был открыт Паллендером в 1849 г. Большой вклад в изучение этого заболевания внесли Р. Кох, Л. Пастер и Л. С. Ценковский.

Морфология. Возбудители сибирской язвы - крупные палочки 6-8 × 1-1,5 мкм с обрубленными или несколько вогнутыми концами. Грамположительны. В организме они располагаются попарно или в виде коротких цепочек. На питательных средах встречаются длинные цепочки. Бациллы сибирской язвы неподвижны. В организме образуют капсулу, окружающую одну, две особи или всю цепочку. Бациллы сибирской язвы образуют споры овальной формы, расположенные в центре и не превышающие поперечника микробной клетки. Спорообразование лучше всего происходит при доступе кислорода и температуре 30-40° С. При температуре выше 43° С и ниже 15° С спорообразование прекращается. В период образования спор цитоплазма клетки почти полностью лизируется, клеточная стенка разрывается и спора выходит наружу (рис. 47).

Рис. 47. Морфологические и культуральные свойства возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis). а - В. anthracis (в крови мыши); б - образование капсул; в - споры; г - рост колонии; д - рост культуры на МПБ; е - рост культуры на желатине

Культивирование. Возбудители сибирской язвы - факультативные анаэробы. Неприхотливы. Растут при температуре 35-38° С и рН среды 7,2-7,6. На МПА образуют крупные колонии с неровными бахромчатыми краями (R-форма). От края колонии отходят пучки нитей. Вид колоний напоминает голову медузы или львиную гриву. R-форма является характерной для вирулентных штаммов сибиреязвенных бацилл. В старых культурах появляются гладкие S-формы колоний - не вирулентные.

В бульоне рост сибиреязвенных бацилл характеризуется придонным ростом. На дне пробирки образуется осадок в виде комка ваты, при этом среда остается прозрачной.

При посеве на 10-12% желатин после 2-3-дневной инкубации появляется рост по ходу укола в виде белых тяжей, уменьшающихся книзу (вид опрокинутой елочки).

При посеве возбудителей на МПА с пенициллином (на пластинчатом агаре) наблюдается распад бацилл на шары, цепь из которых напоминает жемчужное ожерелье. Характер роста на средах имеет диагностическое значение (см. рис. 47).

Ферментативные свойства. Сибиреязвенные бациллы обладают выраженной ферментативной активностью. Сахаролитические свойства: расщепляют глюкозу, лактозу, мальтозу, левулезу и другие сахара до образования кислоты.

Протеолитические свойства выражаются в пептонизации молока, разжижении желатина, свертывании молока (медленно). Они образуют сероводород и аммиак, переводят нитраты в нитриты, гидролизируют крахмал и т. д. Не гемолизируют эритроциты, чем отличаются от Вантракоида. Лизируются противосибиреязвенным фагом. Сибиреязвенные бациллы образуют ферменты: диастазу, пероксидазу, липазу.

Токсинообразование. В. anthracis образует токсин - протеиновый комплекс, содержащий отечный и летальные факторы. Этот токсин называют "мышиный токсин" (ввиду высокой чувствительности мышей). Большая роль в вирулентности сибиреязвенных бацилл принадлежит капсуле, которая связана с токсическим веществом.

Антигенная структура. Бациллы сибирской язвы содержат два антигена: 1) соматический (полисахаридный), который находится в клеточной стенке микроба. Термоустойчив. Против этого антигена антитела не продуцируются. Этот антиген длительно сохраняется в культурах и трупном материале. На его обнаружении основана реакция преципитации Асколи; 2) капсульный (протеиновый) антиген, обусловливающий антифагоцитарное действие.

Находясь в организме или на средах, содержащих экстракты тканей, бациллы сибирской язвы вырабатывают протективный термолабильный антиген, который является атоксичным, но обладает иммунизирующей способностью.

У сибиреязвенных бацилл имеется общий антиген с антракоидом и другими спорообразующими сапрофитами (В subtilis, B. cereus и др.).

Устойчивость к факторам окружающей среды. Вегетативные формы возбудителей сибирской язвы малоустойчивы. При 100° С они погибают мгновенно, температура 55-60° С губит их через 30-40 мин. Обычные концентрации дезинфицирующих растворов убивают их через несколько минут. Капсулы сибиреязвенных бацилл обладают большой устойчивостью. При исследовании трупов животных, подвергнутых действию гнилостной микрофлоры, можно обнаружить пустые капсулы (тени). Споры устойчивы: они выдерживают кипячение на протяжении 15-20 мин. Автоклавирование (120° С) убивает их через 20 мин. К низким температурам не чувствительны. В сухом состоянии сохраняются до 30 лет, в почве - десятилетия.

Обычные растворы дезинфицирующих веществ губят их через 2-3 сут (табл. 46).

Таблица 46. Свойства возбудителей сибирской язвы

Примечание. B. anthracoides обладают слабой подвижностью, вызывают гемолиз эритроцитов, непатогенны для морских свинок.

Восприимчивость животных. К сибиреязвенным бациллам чувствительны коровы, овцы, лошади, олени, свиньи. Заражаются они друг от друга пищевым путем, поглощая с кормом споры возбудителя.

Из лабораторных животных наиболее восприимчивы белые мыши, морские свинки, кролики. Эти животные после заражения погибают через 2-4 сут от септицемии. На месте введения наблюдаются отек и гиперемия. Кровь у погибших животных густая и темно-красного цвета, так как сибиреязвенные бациллы обладают антикоагулирующим действием.

Источники заболевания. Больные животные.

Пути передачи. Контактно-бытовой, воздушно-пыльевой, пищевой (при использовании продуктов, зараженных бациллами сибирской язвы).

Человек от человека обычно не заражается, тем не менее при заболевании человека сибирской язвой принимаются все необходимые меры предосторожности.

Патогенез. Входными воротами являются кожа и слизистые оболочки дыхательных путей и пищеварительного тракта. В зависимости от локализации различают кожную, легочную и кишечную формы. Каждая форма может генерализоваться.

Кожная форма - в месте проникновения появляется покраснение, переходящее в папулу (зудящую). Папула медно-красного цвета переходит в везикулу с серозно-геморрагическим содержимым, после подсыхания образуется черный струп (углевик).

Легочная форма - развивается специфическая пневмония, протекающая по типу отека легких. Обычно заканчивается летально.

Кишечная форма - все вышеописанные явления развиваются в слизистой кишечника. Обычно заканчивается летально.

Иммунитет. Довольно стойкий, антимикробный и антитоксический. Зависит от образования протективных антител. Большая роль принадлежит фагоцитарной реакции. В сыворотке переболевших сибирской язвой обнаруживаются антитела, разрушающие капсульную субстанцию бацилл.

При сибирской язве развивается гиперчувствительность, регистрируемая в аллергической пробе с антраксином.

Профилактика. Все мероприятия по предупреждению сибирской язвы проводят совместно с ветеринарной службой Они предусматривают своевременное выявление, изоляцию больных животных, тщательную дезинфекцию территории.

Специфическая профилактика. В настоящее время используют вакцину СТИ, которая была изготовлена в 1942 г. Н. Н. Гинсбургом из бескапсульной культуры. Вакцинируют обычно людей, которые по характеру своей работы связаны с сельскохозяйственными животными. Для экстренной профилактики (людям, контактировавшим с больными) вводят противосибиреязвенный иммуноглобулин и антибиотики.

Лечение. Противосибиреязвенный иммуноглобулин, антибиотики: пенициллин, стрептомицин, тетрациклин.

1. Опишите морфологию возбудителя сибирской язвы.

2. Опишите культуральные свойства и какая форма: S или R является вирулентной?

3. Какими свойствами обладает сибиреязвенный токсин?

4. Пути передачи и формы заболевания сибирской язвой.

5. Какие факторы обусловливают иммунитет при сибирской язве.

Цель исследования: выявление возбудителей сибирской язвы и дифференциация его от антракоида, выявление антигенов возбудителя.

Работа с возбудителем сибирской язвы проводится в строго режимных условиях!

1. Содержимое везикул, карбункула, отторгнутый струп (кожная форма).

2. Мокрота (легочная форма).

3. Испражнения (кишечная форма).

4. Кровь (септическая форма).

5. Почва, шерсть животных (для постановки реакции Асколи).

Способы сбора материала

5. Реакция преципитации Асколи.

Первый день исследования

1. Посевы вынимают из термостата. Изучают рост на плотной и жидкой питательной среде. Колонии на плотной питательной среде изучают под микроскопом при малом увеличении. При наличии подозрительных колоний выделяют чистую культуру на скошенный МПА. Посевы инкубируют в термостате.

2. Из бульонной культуры (рост в виде комка ваты на дне, бульон прозрачный) делают висячую каплю (для установления неподвижности - дифференциации от антракойда).

3. Ставят тест "жемчужного ожерелья" (ускоренный метод исследования). С этой целью к бульону Хоттингера добавляют 30% инактивированной лошадиной сыворотки и пенициллин из расчета 0,5 ЕД на 1 мл бульона. Приготовленную среду разливают в пробирки по 2-3 мл и в каждую вносят 2 капли исследуемой бульонной культуры. Посевы инкубируют в термостате 3 ч при температуре 37° С. Затем вынимают их из термостата. Из каждой пробирки делают 2-3 мазка, высушивают на воздухе и фиксируют в жидкости Карнуа (6 частей этилового спирта + 3 части хлороформа + 1 часть ледяной уксусной кислоты). Фиксацию проводят до полного испарения жидкости. Полученные мазки окрашивают метиленовым синим и микроскопируют.

В мазках сибиоеязвенные бациллы обнаруживаются в виде цепи шаров, напоминающих жемчужное ожерелье - результат действия пенициллина.

4. Осматривают зараженных животных. Павших животных вскрывают, делают мазки и мазки-отпечатки, которые фиксируют, окрашивают и изучают под микроскопом. При наличии подозрительных палочек производят посевы на МПА и МПБ.

Вынимают посевы из термостата, делают мазки, микроскопируют. На МПА и МПБ бациллы сибирской язвы растут в виде бескапсульных особей. Производят посев на сахара, лакмусовое молоко, желатин, на чашки с 2% кровью и ставят пробу с сибиреязвенным бактериофагом. Посевы инкубируют в термостате.

Вынимают посевы из термостата и учитывают полученные результаты (см. табл. 46).

Исследование мокроты, испражнений и крови после специальной обработки ведут так же.

Для диагностики сибирской язвы используют аллергическую пробу с сибиреязвенным антигеном (антраксин). Для этого внутрикожно на внутренней поверхности предплечья вводят антраксин. Реакцию учитывают через 24-48 ч. Положительная реакция проявляется с первых дней заболевания.

Реакцию ставят для обнаружения специфического антигена бацилл сибирской язвы в шерсти животных, коже, трупах, почве и т. д.

Приготовление антигена: исследуемый материал измельчают в ступке, заливают 25-50-кратным объемом изотонического раствора натрия хлорида и кипятят (антиген термоустойчив). Полученный экстракт фильтруют через смоченную тем же раствором фильтровальную бумагу. Фильтрат-термоэкстракт - прозрачная жидкость. Для реакции используют преципитирующую сибиреязвенную сыворотку и для контроля сибиреязвенный антиген (рис. 48).

Рис. 48. Реакция Асколи. 1 - преципитирующая сыворотка + исследуемый термоэкстракт; 2 - преципитирующая сыворотка + стандартный сибиреязвенный антиген (контроль); 3 - преципитирующая сыворотка + антиген из шерсти здорового животного (чужеродный антиген); 4 - преципитирующая сыворотка + изотонический раствор хлорида натрия; 5 - нормальная сыворотка + испытуемый антиген

Постановка реакции: 1-я пробирка - преципитирующая сыворотка + исследуемый термоэкстракт;

2-я пробирка - преципитирующая сыворотка + стандартный сибиреязвенный антиген (контроль).

3-я пробирка - преципитирующая сыворотка + термоэкстракт из шерсти здорового животного (контроль).

При положительной реакции в первых двух пробирках образуется преципитационное кольцо, в третьей - кольцо отсутствует.

Реакция эта очень чувствительна (см. рис. 48).

МПА, МПБ, желатиновая среда (см. главу 7).

1. Какой материал используют для бактериологического исследования?

2. Основные методы микробиологического исследования.

3. Какие имеются ускоренные методы исследования? Как получить тест "жемчужного ожерелья?"

4. Каким методом можно выявить сибиреязвенные бациллы во внешней среде?

Нарисуйте схему лабораторного исследования сибирской язвы но дням.

Престижные индивидуалки согласны оттянуться в полный рост с вами предельно пышным отдыхом сексуального характера. Они изящные проститутки будут рады, если вы насвистите им в пустое время и посоветуйте увидеть друг друга.