Тест-системы для диагностики бруцеллеза животных в ра рск и рдск
Message: Undefined index: id
Содержание декларации РОСС RU ФВ01 Д12482
Кто декларант?
Производитель контакты
Продукция и предоставленные документы
Кем осуществлялась сертификация?
Информация о документе
Получить консультацию от эксперта
Бесплатная консультация от эксперта Кизьяков Анатолий Петрович, старший специалист органа по сертификации Получить консультацию
Проверить наличие скан копии для декларации РОСС RU.ФВ01.Д12482
К сожалению декларации по номеру: РОСС RU.ФВ01.Д12482 у нас нет в базе. Если она появится мы можем прислать вам его на почту
Состав:
Инактивированная нагреванием и фенолом стандартизированная культура бруцелл штамма Brucella abortus 19 в физиологическом растворе, который содержит 0,5% фенола.
Фармацевтическая форма:
Суспензия.
Вид животных:
Крупный рогатый скот, овцы, козы, кони, свиньи, верблюды и северные олени.
Предостережение при применении:
При наличии в антигене посторонних примесей, плесени, пленок, хлопьев, которые не разбиваются при встряхивании, гнилостного запаха, нарушения закупорки, целостности флакона, отсутствия этикетки или с недостаточными сведениями на ней, а также при неиспользовании антигена в течении 12 часов после открытия флакона или замороженного антигена применение его запрещается.
Показание к применению:
Применяют для серологической диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных методом реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК), и реакции длительного связывания комплемента (РДСК). Серологические исследования на бруцеллез проводят не раньше чем через 45 суток после последней прививки против инфекционных заболеваний, против паразитарных и других ветеринарных обработок.
Взаимодействие с другими средствами :
Не известно.
Применение во время беременности, лактации:
Без предостережений.
Суть реакции:
Суть реакции агглютинации состоит в том, что при объединении антигена с сывороткой крови, которая содержит специфические антитела, происходит их склеивание, образование комков, грудок, хлопьев, которые со временем оседают на дно пробирки, формируют характерный осадок - агглютинат, а жидкость над ним просветляется.
В основу реакций связывания комплемента легло два явления - бактериолиза и гемолиза. В их появлении принимает участие комплемент. Поэтому в РСК применяют две системы компонентов: одна обеспечивает феномен бактериолиза и применяется для диагностических целей, вторая - гемолитическая, индикаторная вспомогательная, которая позволяет установить, связался или не связался комплемент в первой системе. В качестве антигена выступает взвесь бактерий, поэтому первая система названа бактериолитической (в положительных случаях происходит лизис бактерий).
Реакция длительного связывания комплемента более эффективная по чувствительности, чем обычная РСК. Суть реакции состоит в том, что бактериолитическую систему выдерживают при трех разных температурных режимах: после смешивания компонентов - при комнатной температуре на протяжении 15 минут, потом при низкой температуре (на холоде) 18-20 часов и на водяной бане 15 минут. После этого прибавляют гемолитическую систему, встряхивают, вновь размещают в водяной бане и делают учет реакции, как при РСК.
Постановка РА, РСК, РДСК:
РА, РСК, РДСК в ветеринарных лабораториях ставят согласно утвержденной инструкции (10.02.98г. № 15-14/55) относительно постановки и учета этих реакций при диагностике бруцеллеза.
Рабочие титры антигена для РА 1:10, для РСК, РДСК 1:75.
Неспецифичные реакции:
Отсутствуют
Специальные предостережения при использовании:
Персонал перед постановкой реакции должен одеть спецодежду. При попадании препарата на кожу необходимо тщательно промыть водой.
Особые меры безопасности при обращении с неиспользованным ВИП, способы его обезвреживания утилизации:
Остатки обезвреживают путем кипячения на протяжении 30-40 мин.
Срок годности:
2 года со дня изготовления. После открытия флакона - 12 часов.
Особые предостережения относительно хранения:
Сохранять в темном сухом помещении при температуре от 4°С до 12°С. Не замораживать.
Упаковка и фасовка:
Флаконы с нейтрального стекла емкостью 1 см 3 , 5 см 3 , 10 см 3 , 15 см 3 , 20 см 3 , 25 см 3 , 30 см 3 , 50 см 3 , 100 см 3 , закрытые резиновыми пробками и обкатанные алюминиевыми колпачками.
Дополнительная информация:
Если препарат не отвечает требованиям листка - вкладыша или возникли осложнения, применение этой серии немедленно прекращают и уведомляют Государственный научно-контрольный институт биотехнологии и штаммов микроорганизмов (ГНКИБШМ) и поставщика (производителя). Одновременно с посланцем в ГНКИБШМ направляют, согласно "Указания о порядке предъявления рекламаций на биологические препараты, которые предназначены для применения в ветеринарной медицине" от 03.06.98 № 2 три нераскрытых флакона этой серии препарата по адресу: 03151, г. Киев, ул. Донецкая, 30.
Название и постоянный адрес владельца регистрационного свидетельства и производителя:
Херсонское государственное предприятие - биологическая фабрика, Украина, 73011, г. Херсон, ул. Адмирала Макарова, 9.
Основными тестами при массовых диагностических исследованиях являются пробирочная РА, РА на стекле (Роз-бенгал проба), РСК и РДСК, кольцевая реакция с молоком, реакция диффузионной преципитации.
При обнаружении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота (ранее иммунизированного или не иммунизированного) животных с уровнем антител 100 ME и более их признают больными,
50 ME — результат РА сомнительный. В случае сомнительной РА животных исследуют через 15-30 суток повторно и при вторичном сомнительном результате животных признают больными.
При исследовании в РА невакцинированных баранов-производителей, пробников, ярок, козлов, содержащихся в благополучных отарах, где проводилась иммунизация, РА оценивают как положительную при уровне антител 100 ME и более, сомнительной — 50 ME. В последнем случае животных через 15-30 суток исследуют повторно, и, если содержание антител не увеличилось, их признают здоровыми.
Роз-бенгал проба (РБП).РА на стекле с корпускулярным антигеном, окрашенным розовым бенгальским, используют для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и северных оленей. Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре не ниже 18°С. Исследуемые сыворотки в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки, затем в лунку рядом с сывороткой помещают при исследовании крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней 0,03 мл антигена, сывороток овец, коз, буйволов и северных оленей — 0,015 мл антигена. Компоненты должны иметь температуру не ниже 18°С.
Кольцевая реакция с молоком (КР).Реакцию применяют для проверки благополучных по бруцеллезу стад крупного рогатого скота и молока на рынках.
КР на 2-3 креста считают положительной, 1 крест — сомнительной. При положительной КР от всех животных стада берут кровь для исследования в РА или РСК (РДСК) или РА и РИД. Если получают их отрицательный результат, то независимо от позитивной КР животных признают здоровыми.
При диагностике бруцеллеза северных оленей для оценки эпизоотического состояния стад, благополучных по бруцеллезу, вакцинированных против бруцеллеза; для исследования на бруцеллез не ранее чем через два месяца после применения вакцин; для дифференциации неспецифических реакций.
Техника проведения РИД. Расплавленный агар разливают по 2,5 мл на предметные стекла, пластинки размером 6x9 см —12 мл, стандартные чашки Петри слоем не менее 2 мм, которые предварительно размещают на строго горизонтальной поверхности. В застывшем агаровом геле штампом делают лунки: центральную диаметром 5 мм и шесть переферических по 3 мм.
В центральную лунку вносят 20 мкл О-полисахаридного антигена, в периферические — 40 мкл исследуемых сывороток крови. Одновременно на каждой пластинке (чашке Петри) ставят контроль с позитивной сывороткой крови. Затем стекла (чашки Петри) выдерживают во влажной камере при температуре не ниже 18° С и учитывают результат в косопроходящем свете через 24 и 48 часов. Как положительный результат оценивают наличие линии преципитации, появившейся через 24 часа. Сыворотки крови, давшие реакцию преципитации через 48 часов, исследуют повторно и при получении линии преципитации через 24 или 48 часов результат реакции признают положительным.
Печеночно-сывороточный или печеночно-аминопептидный агар.Готовят печеночный отвар: 500 г свежего фарша говяжьей печени смешивают с 500 мл воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют в автоклаве, смешивают равные объемы печеночного отвара и водопроводной воды, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2% агар-агара. На 1000 мл смеси вносят 17 мл 10%-ной двууглекислой соды, автоклавируют 20-25 минут при 115° С, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,0-7,2, добавляют 1% глюкозы и 2% глицерина, разливают по колбам и стерилизуют 20-25 минут при 110° С. Перед использованием агар расплавляют, остужают до 50° С, добавляют 10-20% сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота (печеночно-сывороточ-иый агар) или 10-15% аминопептида (печеночно-аминопептидный агар) и разливают по чашкам или пробиркам. Также готовят полужидкие агары, внося 0,15-0,2% агар-агара. Рекомендуют среды данного типа для культивирования В. ovis.
Печеночный агар Хеддльсона.В 500 мл воды вносят 10 г пентона,
5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, автоклавируют 30 минут, добавляют 500 мл печеночного отвара, охлаждают до 60° С, устанавливают рН 7,0. К 1 л среды добавляют один яичный белок, автоклавируют 30 минут при 120° С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,0, разливают по емкостям и стерилизуют 30 минут при 115° С.
Плотный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (ППГГА). 400 г свежей говяжьей печени освобождают от жира и пленок, измельчают, добавляют 500 мл водопроводной воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр. Полученный печеночный отвар разводят водопроводной водой 1:1, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2,5% агара и
17 мл 10%-ного раствора гидрокарбоната натрия на 1000 мл. Среду автоклавируют 20 минут при 115° С, отстаивают в автоклаве 3-4 часа, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,2. Затем в среду вносят 1% глюкозы и 2-3% глицерина, разливают по пробиркам, колбам, стерилизуют 20-25 минут при 110° С. Данную среду рекомендуется применять для культивирования В. abortus, В. melitensis и В. suis, при бактериостатическом методе дифференциации бруцелл. ППГГБ готовят так же, но агар не добавляют.
Сывороточно-декстрозиый агар.К 835 мл дистиллированной воды добавляют 15г агар-агара, 10г пептона, 5 г химически чистого натрия хлорида и 165 мл мягкой воды. Прогревают 1 час текучим паром, устанавливают рН 7,8, автоклавируют 30 мин при 127° С, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,4. Среду разливают по сосудам и стерилизуют при 116° С 15 минут. Перед использованием среду расплавляют, охлаждают до 50° С, добавляют стерилизованные фильтрованием сыворотку крови лошади или крупного рогатого скота до концентрации 5% и раствор декстрозы до уровня 1%. Среда рекомендуется для первичного выделения бруцелл.
Сывороточно-декстрозный бульон.Готовят так же, как сывороточно-декстрозный агар, но без добавления агар-агара.
Альбими-агар.В 1000 мл дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,3, все компоненты растворяют в аппарате Коха, фильтруют через ватный фильтр. Вносят 1 г глюкозы, 0,2 г бисульфита натрия, устанавливают рН 7,2 0-7,3, разливают по колбам и стерилизуют 40 минут текучим паром, затем 20 минут в автоклаве при 110° С. Дрожжевую воду получают путем кипячения 1 кг хлебных дрожжей в 1000 мл дистиллированной воды, затем фильтруют через полотно и хранят под флороформом в темноте (не более 15 дней).
Телефон горячей линии на время ЧМ по футболу +7 (495) 700-01-37
Бруцеллез считается актуальной болезнью для животноводства нашей страны и многих зарубежных стран. Человек также подвержен этому заболеванию. Учреждениями Россельхознадзора ежегодно осуществляется эпизоотологический мониторинг по всей территории Российской Федерации. По результатам мониторинга и плановых противоэпизоотических мероприятий выявляются животные с наличием антител к бруцеллам, также выделяются возбудители бруцеллеза из биологического и патологического материала. Наибольшее количество неблагополучных по бруцеллезу животных пунктов выявляется в Северо- Кавказском федеральном округе.
Бруцеллы существует в двух основных формах - гладкой S-форме и шероховатой R-форме. Они различаются между собой по антигенной структуре клеток и характеру метаболизма.
Главным антигенным отличием является отсутствие у R-вариантов полисахаридной цепи S-эндотоксина, в которой антигенными детерминантами, определяющими бруцеллезную специфичность, являются структуры альфа-2-маннопиранозы.
Средства и методы диагностики бруцеллеза, применяемые в Российской Федерации:
1. Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК, РДСК (реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента *(РСК);
2. Набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) (реакция непрямой гемагглютинации (РНГА);
3. Набор для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота иммуноферментным методом (непрямой иммуноферментный анализ (ИФА);
5. Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в роз бенгал пробе (роз бенгал проба (РБП) (экспресс-тест);
6. Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в кольцевой реакции с молоком (кольцевая реакция с молоком (КР);
7. Тест-система для диагностики
бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота, и северных оленей в РИД (реакция иммунодиффузии в агаровом геле с О-ПС –антигеном);
9. Бруцеллин ВИЭВ (аллергическое исследование)
Вакцины против бруцеллеза, выпускаемые и применяемые в Российской Федерации для иммунизации крупного рогатого скота:
- Вакцина против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма Бруцелла абортус № 82 живая сухая;
- живая сухая вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма B.abortus 19;
- вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота из штамма B.abortus 75/79-АВ живая сухая;
- адъювант-вакцина из штамма B.abortus КВ 17/100 против бруцеллеза крупного рогатого скота.
Вакцины для иммунизации мелкого рогатого скота:
- Вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма B.abortus 19 живая сухая;
- вакцина против бруцеллеза овец и коз, и инфекционного эпидидимита баранов из штамма Brucella melitensis REV-1 живая сухая.
Разработанная и внедренная в нашей стране с учетом мирового опыта система мер борьбы с бруцеллезом, предусматривающая иммунизацию животных противобруцеллезными вакцинами, позволила значительно снизить количество неблагополучных пунктов, полностью оздоровить от бруцеллеза ряд регионов страны и снизить заболеваемость людей. Тем не менее, с учетом относительной иммуногенной эффективности всех известных на сегодняшний день в мире противобруцеллезных вакцин в случае абортов в хозяйствах, контакта животных с вирулентным возбудителем в большой инфицируемой дозе, не стоит рассчитывать на их успешное применение без соблюдения ветеринарно-санитарных правил при содержании животных. Опыт профилактики и борьбы с бруцеллезом показывает, что проблему бруцеллеза невозможно разрешить, ограничиваясь реализацией только специальных ветеринарных мероприятий.
Существует ряд проблем, затрудняющие искоренение бруцеллеза в Российской Федерации:
- несанкционированное перемещения животных на территории страны;
- торговля вакцинированными животными из субъектов неблагополучных по бруцеллезу, в субъекты благополучные, в которых вакцины не применяют;
- не применение экономических санкций к субъектам неблагополучным по бруцеллезу;
- отсутствие в большинстве субъектов России мясокомбинатов и боен, выполняющих убой больных бруцеллезом животных (что обусловливает несвоевременный убой больных животных);
- неэффективное проведение организационно-хозяйственных мероприятий при бруцеллезе (без наложения ограничений, оздоровление неблагополучных по бруцеллезу хозяйств по правилам для инфицированных В.abortus, введение нетелей и ярок в стада и отары взрослых животных, концентрация поголовья в хозяйствах молочного направления, продолжительное применения способа оздоровления путем периодических исследований и вакцинации в стадах где реагировало на бруцеллез более 20 % животных);
Первостепенное значение для успешной борьбы с бруцеллезом имеет решение проблемы компенсации владельцам убытка, неизбежного при изъятии больных животных, в первую очередь, в условиях отгонного животноводства.
4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических
антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции
связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),
пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба - РБП) и в молоке
коров - кольцевой реакции (КР).
4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).
4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при
диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,
собак, пушных зверей и животных других видов.
4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:
испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);
позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от
больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА
и РСК и дату изготовления;
негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием
или полученная в лаборатории;
антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);
раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,
верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и
антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида
натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов - 5-процентный
и оленей - 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).
4.2.3. Постановка реакции агглютинации.
Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:
при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак - 1:25, 1:50, 1:100 и
крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов - 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
пушных зверей и морских свинок - 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.
Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или
групповыми дозаторами Флоринского.
Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках
первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,
лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл
соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови
овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего
раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок
берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).
Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда
штатива (по 10 проб в ряду).
После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,
четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из
пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго
и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках
третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления
переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда - в пятый. Из пробирок
пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные
разведения одновременно 10 сывороток.
После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными
сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего
устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим
раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке
удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,
1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества
сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты
реакции агглютинации не учитывают.
При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)
или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки
крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток
овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,
разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения
сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.
При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят
с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;
с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.
После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками
осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 - 38 °С на 16 - 20 часов, затем выдерживают
при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.
4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в
крестах по следующей схеме:
++++ (4 креста) - полное просветление жидкости, микробные тела
осели на дно пробирки в виде "зонтика", при легком
встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья и
а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);
+++ (3 креста) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный
"зонтик" (75% агглютинации);
++ (2 креста) - просветление жидкости, "зонтик" умеренно выражен
+ (1 крест) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик"
слабо, при встряхивании заметно небольшое
хлопьев или комочков (25% агглютинации);
- (знак минус) - просветления жидкости и образования "зонтика" не
наступило, на дне пробирки виден "пунктик" осевших
микробов антигена, при легком встряхивании
За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла
агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц
(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,
1:200 - 200 ME и т.п.).
Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,
соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.
В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем
в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного
физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания
пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по
0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50
и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.
Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате
одновременно с основной реакцией.
Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем
сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.
При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие
агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,
исследуют повторно в четырех разведениях.
4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.
Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного
рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME - международных единиц
антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак - с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских
свинок - с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.
Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с
сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с
сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.
При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного
исследуют повторно через 3 - 4 недели.
На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет
получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.
В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая
оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)
сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах
(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или
более - "положительная 100 ME"; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более -
"сомнительная 50 ME").
Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его
годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических
4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного
связывания комплемента на холоде (РДСК).
4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного
рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.
Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо
РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике
инфекционного эпидидимита баранов.
4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:
испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);
позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная
от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату
негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике
или полученная в лаборатории.
Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной
бане в день постановки реакции: для РСК - при 60 - 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов
и мулов - при 64 - 65 °С, буйволов - при 62 - 64 °С в течение 30 мин., свиней - при 60 - 62° в течение
50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов - при 63 - 64 °С в течение 30 мин.;
антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,
указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);
комплемент - сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%
борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей
или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента
проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N
Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на
этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для
проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну
пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для
титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 - 4 °С;
гемолитическая сыворотка (гемолизин) - для РСК в удвоенном титре, для РДСК - в утроенном.
Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой
новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);
эритроциты барана - 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе
для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).
Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и
гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в
термостате при 37 °С в течение 15 - 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь
физиологический раствор - 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в
дистиллированной воде рН = 7,3 - 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и
кальция (см. Приложение N 2, п. 2).
Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции
и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:
¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦ - ¦ -
¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ - ¦ 0,2 ¦ - ¦ -
¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ - ¦ - ¦ 0,4 ¦ -
¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2
¦ Физиологический раствор ¦ - ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2
¦ водяная баня 10 минут при 37 -
¦ Результат: гемолиз полная задержка
В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и
4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.
Реакцию проводят в водяной бане при 37 - 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента -
сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).
Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической
системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,
которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.
Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл
физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в
два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в
возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой
пробирке) количество физиологического раствора.
После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл
антигена в рабочем разведении, а во второй ряд - по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки
ставят в водяную баню при 37 - 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл
гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего
Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной
Читайте также: