Иммунофенотипирование при остром миелоидном лейкозе

Добавил пользователь Alex
Обновлено: 21.12.2024

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) представляет собой биологически и клинически гетерогенную группу заболеваний, характеризующихся клональной пролиферацией незрелых гемопоэтических клеток. Диагностика и классификация ОЛЛ представляет собой многоступенчатый процесс, базирующийся на следующих исследованиях:

морфологическом,
имунофенотипическом,
цитогенетическом,
молекулярно-генетическом,
исследовании реарранжировок тяжелых цепей иммуноглобулинов (Ig) и Т-клеточного рецептора (TCR),
изучении профиля генной экспрессии,

и является результатом одновременного применения нескольких видов исследования.

Морфология

Диагноз ОЛ устаноавливается при обнаружении более 30% лимфоидых бластных клеток в костном мозге или периферической крови (по классификации Франко-Американско-Британской Кооперативной группы ФАБ) или более 20% – по классификации, предложенной Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ).

В отличие от острого миелоидного лейкоза, для ОЛЛ не существует единственного диагностически специфического цитохимического теста; тем не менее, по определению, бластные клетки при ОЛЛ должны быть негативны при окраске на миелопероксидазу и не окрашиваться анти-МПО антителами. Морфологическое и цитохимическое исследование выделяет 3 морфологических типа ОЛЛ: L1, L2, L3, однако, только L3 тип ОЛЛ имеет определенные уникальные морфологические, иммунофенотипические и генотипические черты.

Имунофенотип

Иммунофенотипирование является обязательным компонентом первичной диагностики ОЛЛ и, кроме того, методом, позволяющим контролировать минимальную остаточную болезнь (МОБ) во время лечения и по его окончании. Иммунофенотипическая характеристика бластных клеток имеет несколько целей:

охарактеризовать линейную принадлежность,
исследовать степень дифференцировки,
выявить аберрации фенотипа,

Необходимым и достаточным для диагностики является следующий ряд антител: cyMPO, D117, TdT, cyCD3, CD7, cyCD79a, CD19

Для более точного установления диагноза рекомендуется двухступенчатое исследование:

Первый шаг:
cyMPO, D117, TdT, cyCD3, CD7, cyCD79a, CD19, CD33, CD34
Второй, после установления диагноза ОЛЛ:
Для Т-клеточного ОЛЛ: CD1a, CD2, CD3, CD5, CD4, CD8, CD52
Для B-клеточного ОЛЛ: CD10, CD20, CD22, cyIgM, sIg, CD52

В-клеточный ОЛЛ (70-80% случаев) классифицируется в 4 группы, соответственно экспрессии В-клеточных дифференцировочных антигенов, а также цитоплазматических и поверхностных иммуноглобулинов. Т-клеточный ОЛЛ (15-25% случаев) тоже классифицируется на 4 группы согласно экспрессии дифференцировочных антигенов. Т-ОЛЛ может быть также классифицирован по подтипу определяемого Т-клеточного рецептора.

Другие маркеры используются для оценки зрелости бластных клеток и выявления атипичного или аберрантного фенотипа. Довольно большой процент ОЛЛ экспрессирует нелинейные маркеры, например миелоидные или CD34. Частота ОЛЛ с экспрессией миелоидных маркеров варьирует от 15 до 40%, наиболее часто выявляются CD33 (около 25%) и CD13 (примерно 20%); CD15 и в CD14 определяются примерно в 15% случаев, в то время, как CD11с редко встречается при ОЛЛ. Миелоидные антигены могут использоваться как маркеры для иммунофенотипического мониторинга МОБ. CD34 является наиболее частым маркером, используемым для выявления незрелых гемопоэтических клеток, и около 70% случаев ОЛЛ позитивны по этому антигену. CD34 чаще экспрессируется при В-ОЛЛ (70-80%), чем при Т-ОЛЛ (20-30%), его экспрессия выявляется в большинстве случаев ОЛЛ с Ph-хромосомой.

Определение уровня экспрессии в лейкемической популяции может иметь терапевтическое применение. Так, например, это относится к антигенам CD20, CD22, CD52, для которых разработаны препараты, содержащие специфические антитела. Позитивность по этим антигенам и степень их экспрессии важны для планирования использования антител в терапии ОЛЛ.

Цитогенетический и молекулярный анализ

Цитогенетическое исследование является базисным для выявления молекулярных событий, участвующих в канцерогенезе при ОЛЛ, таких, как образование химерных транскриптов при транслокациях, потеря генов-супрессоров опухоли или генов-регуляторов клеточного цикла при делециях. Частота хромосомных аномалий при ОЛЛ может быть установлена лишь приблизительно, Это связано как с различиями в используемых методиках, так и со значительным процентом неудачных исследований. Зачастую бластные клетки при ОЛЛ плохо делятся в культуре и из-за малого количества метафаз важные хромосомные перестройки могут не быть обнаружены. Хромосомные аберрации при ОЛЛ могут быть числовые, структурные, а также сочетаться – и те, и другие.

В настоящее время разработаны новые методы молекулярной цитогенетики, позволяющие выявлять генетические нарушения, не обнаруживаемые при стандартном исследовании:

флюоресцентная гибридизация in situ (FISH): преимуществом метода является выявление известных последовательностей ДНК в неделящихся клетках, а также совмещение чувствительности молекулярных методов с наглядностью цитогенетики;
сравнительная геномная гибридизация (CGH): нормальная и опухолевая ДНК окрашивается различными флюоресцентными красителями; участки хромосом с повышенным свечением (добавленные последовательности) или пониженным свечением (утерянные последовательности) видны в тестируемом геноме в соответствующем цвете;
спектральное кариотипирование (SKY): эта методика позволяет выявить на хромосомах полосы неизвестного происхождения, включая транслокации, инсерции и комплексные реарранжировки.

Хромосомные аномалии представляют собой очень значимый независимый фактор прогноза при ОЛЛ. Большинство наиболее часто встречающихся структурных реарранжировок изучены на молекулярном уровне. Хромосомные аномалии или их субмикроскопические эквиваленты можно, в целом, разделить на две группы: качественные, когда поломка возникает в гене-мишени и приводит к образованию химерного протеина и количественная, к которым относятся нарушения реарранжировки Ig или TCR. Результатом качественных нарушений является функционирующий химерный ген, самым ярким примером образования которого является транслокация t(9;22)(q34,q11), ведущая к формированию гена BCR-ABL. К количественным аномалиям относятся происходящие при перемещении протоонкогена под регуляторные последовательности реарранжированного Ig или TCR, что приводит к бесконтрольной экспрессии протеина. Примером такой перестройки может служить SIL-TAL1/TAL1 делеции на хромосоме 1q32 при Т-ОЛЛ.

Детекция клональных генетических маркеров при лейкозах на молекулярном уровне является предметом молекулярно-биологических исследований. В большинстве случаев используется обратно-транскриптазная полимеразно-цепная реакция (ОТ-ПЦР). Исследуется два типа характерных последовательностей: участки, близкие к точке разрыва в химерных онкогенах (при транслокациях, делециях, инверсиях) или регионы клонально перестроенных Ig или TCR. В настоящее время для детекции все чаще стала использоваться ПЦР в реальном времени.

Основные генетические аномалии, исследуемые при В-ОЛЛ:

BCR-ABL/t(9;22)(q34;q11)
MLL-AF4/t(4;11)(q21;q23)
TEL-AML1/t(12;21)(q13;q22)
E2A-PBХ1/t(1;19)(q23;p13)
E2A-HLF/t(17;19)(q22;p13)
MLL-v/t(11;v)(q23;v)
c-MYC-IgH/t(8;14)(q24;q32)
IL3-IgH/t(5;14)q31;q32)

Основные генетические аномалии, исследуемые при Т-ОЛЛ:

SIL-TAL1/TAL1 deletion
C-MYC-TCRα/δ /t(8;14)(q24;q11)
HOX11- TCRα/δ /t(10;11)(q24;q11)
LMO1- TCRα/δ /t(11;14)(p15;q11)
LMO2- TCRα/δ /t(11;14)(p13;q11)
TAL1- TCRα/δ /t(1;14)(p32;q11)
TCL1- TCRα/δ /inv(14)(q13;q32)

Минимальная остаточная болезнь

Лейкемические клетки могут быть отличены от нормальных с помощью морфологического и цитохимического исследования, а также с помощью иммунофенотипирования, исследования генетических аномалий, перестройки Ig/TCR. Все эти методы используются для возможного определения малых количеств бластных клеток у больных в ремиссии – минимальной остаточной болезни (МОБ). Классическими критериями ремиссии у пациентов с острым лейкозом базируются на морфологическом исследовании костного мозга. Считается, что в костном мозге больного в ремиссии должно выявляться не более 5% бластных клеток. Однако во время морфологической ремиссии уровень МОБ может значительно варьировать.

Методы исследования МОБ включают:

стандартную цитогенетику
FISH
молекулярно-биологические методы (блот по Саузерну, ПЦР)
иммунофенотипирование

Возможность использования методики для исследования МОБ основана на следующих параметрах:

специфичность, исключающая ложно-положительные результаты;
чувствительность, не менее 1 клетки на 103;
воспроизводимость и относительная простота в исполнении, позволяющая провести стандартизацию и использовать метод для клинических нужд.

Только у части больных с ОЛЛ обнаруживается специфический молекулярный маркер, такой как хромосомные транслокации, например, t(9;22), t(4;11), t(1;19). Стандартный цитогенетический анализ может использоваться для мониторирования МОБ при наличии аномалий кариотипа при первичной диагностике. Однако этот метод обладает достаточно низкой чувствительностью, учитывая частое отсутствие метафаз. Основным преимуществом метода FISH является возможность исследовать неделящиеся клетки, однако его чувствительность зачастую бывает недостаточно для выявления МОБ. Иммунофенотипирование, а именно метод мультипараметрической многоцветовой проточной цитофлюорометрии, базируется на определении аберрантной экспрессии антигенов на клетках лейкемической популяции. Этот метод применим для мониторирования МОБ в 85-90% случаев. Детекция клональных перестроек на генетическом уровне основана на методе ПЦР и используется в настоящее время очень широко.

Таким образом, три метода способны выявлять МОБ у больных ОЛЛ с достаточной степенью чувствительности (103-106):

проточная цитофлюорометрия, определяющая аберрантный фенотип;
ПЦР, выявляющая специфические генетические нарушения;
детекция клональных перестроек Ig/TCR с помощью ПЦР.

Одной из целей исследования МОБ является измерение количества остаточной лейкемической популяции, поэтому в настоящее время широкое распространение получила количественная ПЦР в реальном времени.

Самым большим препятствием к использованию любой их этих методик для исследования МОБ является отсутствие универсального метода, одинаково успешно применимого для всех пациентов. Так как ПЦР может выявить остаточную лейкемическую популяцию, не определяемую цитометрией (а иногда – наоборот), по возможности, нужно использовать оба этих метода.

Анализ профилей генной экспрессии

Исследование профиля генной экспрессии стало реальностью, которая, возможно, значительно изменит практику ведения больных с ОЛЛ. Изучение иерархии кластеров экспрессирующихся генов при ОЛЛ взрослых позволило выделить две четко разделяющиеся группы, точно коррелирующих с Т- или В-фенотипом лейкемических клеток. Дальнейший анализ идентифицировал профили генной экспрессии, специфичные для определенных генных перестроек, таких, как MLL-AF4, BCR-ABL, E2A-PBХ1. Более того, интегрированный анализ случаев взрослых и детских ОЛЛ выявил значительное совпадение профилей генной экспрессии между случаями заболевания с одинаковыми хромосомными аберрациями, независимо от возраста пациентов.

Использование этого метода показало, что данные генетические нарушения определяют экспрессию различных генных кластеров. Возможно, в отдельных случаях определенные генетические аберрации могут быть определены с помощью изучения профиля экспрессии, даже в случаях негативных результатов ПЦР. В ближайшее время станет понятным, внесет ли эта инновационная технология свой вклад в классификацию лейкозов.

Информация, полученная в результате исследований кариотипа, молекулярной генетики, иммунофенотипирования, а в дальнейшем – профиля генной экспрессии, поможет лучшему пониманию биологии ОЛЛ. Таким образом, будут достигнуты следующие цели:

выявлены новые аберрации;
адекватно установлен диагноз во всех случаях;
исследовано значение каждого молекулярного маркера;
установлен мониторинг минимальной болезни соответственно первичной аномалии;
изучена возможность дфференцированной терапии согласно прогностическим факторам.

Иммунофенотипирование при остром миелоидном лейкозе

АНМО «Ставропольский краевой клинический консультативно-диагностический центр»:

355017, г. Ставрополь, ул. Ленина 304

(8652) 951-951, (8652) 35-61-49 (факс)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (справочная служба)

Обособленное подразделение «Диагностический центр на Западном обходе»:

355029 г. Ставрополь, ул. Западный обход, 64

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (контактный телефон)

Клиника семейного врача:

355017 г. Ставрополь, пр. К. Маркса, 110 (за ЦУМом)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (контактный телефон)

(8652) 31-50-60 (регистратура)

357107, г. Невинномысск, ул. Низяева 1

(86554) 95-777, 96-127, 95-873 (регистратура)

Обособленное структурное подразделение в г. Черкесске :

369000, г. Черкесск, пр-т. Ленина, 85А

Обособленное структурное подразделение в г. Элисте :

358000, г. Элиста, ул. Республиканская, 47

ЗАО "Краевой клинический диагностический центр":

355017 г. Ставрополь, ул. Ленина 304

(8652) 951-951, (8652) 35-61-49 (факс)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (справочная служба)

Обособленное структурное подразделение на ул. Доваторцев, 52А:

355037, г. Ставрополь, ул. Доваторцев, 52А

8 (8652) 316-845 (контактный телефон)

Обособленное структурное подразделение на ул. Пригородная, 193:

355026, г. Ставрополь, ул. Пригородная, 193

8 (8652) 316-843 (контактный телефон)

Обособленное структурное подразделение на ул. Савченко, 38 корп. 9:

355021, г. Ставрополь, ул. Савченко, 38, корп. 9

8 (8652) 316-847 (контактный телефон)

Обособленное структурное подразделение на ул. Чехова, 77 :

355000, г. Ставрополь, ул. Чехова, 77

Обособленное структурное подразделение в г. Михайловске:

358000, г. Михайловск, ул. Ленина, 201 (в новом жилом районе «Акварель»).

Иммунофенотипирование клеток — это определение маркеров, кластеров дифференцировки (CD) на поверхности клеток и внутриклеточно с целью определения линейности, принадлежности клеток к той или иной субпопуляции. Иммунофенотипирование проводится методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител к различным CD. Метод иммунофенотипирования гемобластозов основан на сопоставлении морфофункциональных характеристик бластных клеток и нормальных клеток иммунопоэза. По набору мембранных и цитоплазматических антигенов (СD) можно установить линейную принадлежность и стадию дифференцировки бластов. В результате проведения данного исследования выявляется фенотип бластных клеток и возможно определение варианта лейкоза. Назначение данного вида исследования должно проводиться врачом- гематологом. Иммунофенотипирование острых лейкозов является дополнительным методом исследования. Исследование периферической крови проводится при наличии бластных клеток в общем анализе крови! Для диагностики лейкозов в настоящее время нет стандартизованного набора моноклональных антител (МАТ) для выявления CD. Иммунофенотипирование включает набор АГ (панель) для диагностики: 1.Линейно неограниченные антигены: - CD34,CD38,HLA- DR.2. Миелоидные антигены:- CD13,CD33,CD117,CD153. Моноцитарные антигены:- CD36,CD14,CD644.В- лимфоидные антигены:CD19,CD22,CD10,CD20,тяжелая цепь иммуноглобулинов М; 5.Т- лимфоидные антигены:CD7,CD2,CD1a,CD5,CD3,CD4,CD8 6.Определение линейности (миелоидная, В- лимфоидная, Т- лимфоидная):cytМРО/cyt79а/cytCD3; 7.CD235 (Гликофорин А), CD41 — для дифференциальной диагностики эритромиелоза и мегакариобластного лейкоза.

Иммунофенотипическая характеристика острого мегакариобластного лейкоза у детей

Острый мегакариобластный лейкоз (ОМКЛ) – разновидность острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), в основе которого лежит избыточная пролиферация мегакариобластов в костном мозге. ОМКЛ – редкий вариант ОМЛ как среди детей, так и среди взрослых, но характеризуется высокой частотой среди пациентов с синдромом Дауна. Морфологическая диагностика ОМКЛ сопряжена с рядом трудностей, поэтому ключевую роль в диагностике играет иммунофенотипирование. Данное исследование поддержано Независимым этическим комитетом и утверждено решением Ученого совета НМИЦ ДГОИ. Цель исследования – комплексная оценка иммунофенотипа опухолевых клеток у детей с ОМКЛ. Исследуемую группу составили 103 образца костного мозга детей с ОМКЛ. Иммунофенотипирование проводили методом проточной цитометрии. По результатам исследования выявлено три группы пациентов с разным уровнем экспрессии CD45, при этом большинство пациентов (74%) имело высокую экспрессию данного маркера. При комплексной оценке фенотипа выявлен ряд других достоверных отличий между этими группами. У 56% больных ОМКЛ была обнаружена трисомия 21 хромосомы в костном мозге, при этом именно дети с трисомией составили большинство в группе пациентов с высокой экспрессией CD45 (64% в группе и 86% всех пациентов с трисомией). Кроме того, выявлен ряд достоверных фенотипических отличий у пациентов с трисомией и без нее в рамках группы с высокой экспрессией CD45. Данное исследование продемонстрировало существенную иммунофенотипическую гетерогенность ОМКЛ. В целом выявленное разнообразие, очевидно, отражает биологическую неоднородность данной группы пациентов с ОМЛ.

Ключевые слова

Об авторах

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России
Россия
Москва

ГАУЗ СО «Областная детская клиническая больница»; ГАУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий»
Россия
Екатеринбург

ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России
Россия
Ростов-на-Дону

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России
Россия

Попов Александр Михайлович, кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией иммунофенотипирования гемобластозов

117997, Москва, ГСП-7, ул. Саморы Машела, 1

Список литературы

1. Gruber T.A., Downing J.R. The biology of pediatric acute megakaryoblastic leukemia. Blood 2016; 126 (8): 943–9.

2. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L., Jaffe E.S., Pileri S.A., Stein H., et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon: IARC; 2008.

3. Mejía-Aranguré J. M. (ed.). Etiology of Acute Leukemias in Children. Springer International Publishing Switzerland; 2016.

4. Roy A., Roberts I., Norton A., Vyas P. Acute megakaryoblastic leukaemia (AMKL) and transient myeloproliferative disorder (TMD) in Down syndrome: a multi-step model of myeloid leukaemogenesis. Br J Haematol 2009; 147 (1): 3–12.

5. Илларионова О.И., Горчакова М.В., Русанова Е.Б., Прохорова Ю.А., Салогуб Г.Н., Осипова Е.Ю. и соавт. Конспект клинической цитометрии: острый мегакариобластный лейкоз. Клиническая лабораторная диагностика 2015; 60 (7): 42–9.

6. Karandikar N.J., Aquino D.B., McKenna R.W., Kroft S.H. Transient myeloproliferative disorder and acute myeloid leukemia in Down syndrome. An immunophenotypic analysis. Am J Clin Pathol 2001 Aug; 116 (2): 204–10.

7. Bene M., Castoldi G., Knapp W., Ludwig W.D., Matutes E., Orfao A., et al. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia 1995; 9 (10): 1783–6.

8. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet 1971; 298 (7731): 971–2.

9. Новикова И.А., Вержбицкая Т.Ю., Мовчан Л.В., Цаур Г.А., Белевцев М.В., Попов А.М. Стандарт россий-ско-белорусской кооперативной группы по иммунофенотипированию острого лимфобластного лейкоза у детей. Онкогематология 2018; 13 (1): 73–82.

10. Boztug H., Schumich A., Pötschger U., Mühlegger N., Kolenova A., Reinhardt K., et al. Blast cell deficiency of CD11a as a marker of acute megakaryoblastic leukemia and transient myeloproliferative disease in children with and without Down syndrome. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2013; 84B: 370–8.

Рецензия

Для цитирования:

For citation:

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

Иммунофенотипирование при остром миелоидном лейкозе

В статье представлены результаты исследований иммунотипирования(ИФТ) с помощью метода проточной цитофлуориметрии и определена частота выявляемости среди больных детей острого миелоидного лейкоза. Диагноз острый миелобластный лейкоз может быть установлен при наличии иммунофенотипа миелопероксидазы (МРО) и в случае отсутствии, а бластные клетки экспрессируют другие, менее специфичные миелоидные маркеры и исключен вариант острого лимфобластного лейкоза. При ИФТ методом проточной цитофлуориметрии, острый миелоидный лейкоз выявляется во всех детских возрастах, но при нашем наблюдении в возрастах от 12 лет до 12 лет 11 месяцев и от 16 лет – 16 лет 11 месяцев не выявлено ни среди женского, ни среди мужского пола – 0 % случаев. Выявлено, в Кыргызской Республике среди больных детей наиболее распространенные варианты лейкозов: острый миелобластный лейкоз (М2) в 53 % случаев и острый миеломонобластный лейкоз (М4) в 20 % случаев и реже выявляется острый миелобластный лейкоз (М1) в10 % случаев, острый промиелоцитарный лейкоз (М3) в 10 % и острый монобластный лейкоз(M5а, M5b) в 7 % случаев. Выявляется острый миелоидный лейкоз среди больных детей женского пола киргизской национальности в 78 % случаев, среди мужского пола в 83 % случаев, и у больных детей женского пола среди жителей русскоязычного населения Кыргызской Республики в 22 % случаев, мужского пола в 17 % случаев. Чаще обнаруживается у больных детей киргизской национальности острый миелобластный лейкоз(M2) в 69 % случаев, острый промиелобластный лейкоз(М3) в 67 % случаев , а среди больных детей жителей русскоязычного населения Кыргызской Республики острый миелобластный лейкоз(М1) в 68 % случаев, острый миелобластный лейкоз (М4) в 68 % случаев и острый монобластный лейкоз(М5a, M5b) в 100 % случаев. ИФТ по результатам дает свою целенаправленную характеристику бластных клеток и индивидуально с учетом предельной чувствительности методики.

1. Gorczyca W. Flow cytometry neoplastic hematology. Morphologic-immunophenotypic correlation. Informa healthcare. 2014. Р. 20–45.

2. Dohner H., Estey E., Grimwade D. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood 2017. vol. 129. P. 421–447.

3. Van Dongen J.M., Lhermitte I., Bottcher S. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. 14th EHA Congress. Berlin. 2009. Р. 10–155.

4. Bene M.C., Gastoldi G., Knapp W. Proposals for the immunological classification of acute leukemia European Group for the Immunological Characterization of Leukemia (EGIL) Leukemia. 1995. vol. 9. P. 1783–1786.

5. Swerdlow S.H., Compo E., Harris N. World Health Organization(WHO)Classification of Tumors of Hematopoietic and Lymphoid Tissues.International Agency for Research on cancer. 2017. P. 1–100.

6. Rohrs S., Scherr M., Romani J. Cd7 in acute myeloid leukemia: correlation with loss of wild – type CEBPA, consequence of epigenetic regulation. Journal Hematology Oncology. 2010. P. 3–15.

7. Baratova D.А., Toichubaev M.A. Immunogenetic indicators of placental blood on the system HLA-main complex histocompatibility (192nd Scientific Federation Conference, 4th Global Conference and Expo on Vaccines Research& Development, February 10–11, 2020. Lisbon, Portugal). P. 50–51.

Острый лейкоз – это острое злокачественное заболевание системы крови, с поражением на уровне детерминированных родоначальных стволовых клеток или ранних клеточных предшественников, характеризующийся наличием бластных клеток в костномозговом пунктате или в периферической крови от 20 % и более.

При постановке диагноза острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) цитогенетические, морфологические исследования по настоящее время остаются мощным инструментом в клинической практике, но для подробного изучения клеток костного мозга, метод проточная цитофлуометрия имеет свои, несомненно, большие преимущества.

На сегодняшний день, при постановке диагноза острого миелоидного лейкоза с помощью метода проточной цитофлуометрии, необходимо оценить иммунофенотипические особенности бластных клеток и определить вариант направленности миелоидной клеточной линейности и исключить Т и В-линейной или редкие варианты неясной линейности.

Клетки миелоидной линии развиваются в костном мозге из общего кроветворного предшественника. Ранними клетками моноцитарного ряда – это монобласты и промоноциты. В норме их содержание в костном мозге, крайне низкое.

По данным автора [1] монобласты экспрессируют маркеры предшественников СD34, CD117 и HLA-DR, в последовательности появляются СD4, CD64, СD36, CD33, СD11с, CD11b, СD15, CD14 и в стадии промоноцита интенсивность экспрессии данных маркеров увеличивается, а антигены ранней стадии дифференцировки (СD34, CD117) медленно исчезают. При диагностике острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), наиболее специфичным является обнаружение миелопероксидазы в цитоплазме опухолевых клеток.

Миелопероксидаза – линейно-специфический маркер миелоидной линии, лизосомальный фермент гранулоцитов. При иммунофенотипировании в случае не выявления миелопероксидазы, то для установления миелоидного варианта острого лейкоза, необходимо исследовать другие миелоидные антигены, включая маркеры редких форм ОМЛ (эритроидный, мегакариобластный), а также исключить лимфоидный вариант дифференцировки опухолевых клеток. С диагностической целью применяются определение линейной принадлежности опухолевых клеток наборы антител рекомендованные Международной группой экспертов Европейской сети лейкемии (ELN) [2], консорциума Еврофлоу[3], и для дифференциальной диагностики классификации European Group for the Immunological Characterization of Leukemia (EGIL) [4] и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [5].

Для подтверждения миелоидной направленности опухолевых(бластных) клеток необходимо оценить экспрессию миелоидных антигенов.

Как отмечают авторы [5], бластные клетки при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) чаще всего экспрессируют маркеры предшественников (CD34, CD117, HLA-DR) и в редких случаях терминальную дезоксинуклеотидил трансферазу-TdT (Тerminal deoxynucleotidyl Тransferase), специализированная ДНК-полимераза, которая в норме добавляет N-нуклеотиды при реоранжировке генов Т и В клеточных рецепторов, увеличивая их вариабельность.

Встречается в 30 % случаев при остром миелоидном лейкозе СD7, экспрессия данного антигена может коррелировать с неблагоприятным прогнозом [6].

Как отмечают авторы [7], в будущем найдет свое мощное направление иммунотерапия, вакцинотерапия, гаплоидентичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при лечении острых лейкозов и других злокачественных онкогематологических заболеваниях.

На сегодняшний день, при правильном постановке диагноза «острый лейкоз», с определением направленности миелоидного варианта линейности и своевременном подборе ПХТ, необходимо провести аллогенную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток. Своевременное проведение высокотехнологичного метода терапии гаплоидентичной (родитель, брат, сестра или плацентарная кровь) [7], или близкородственной, неродственной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, позволяет при наличии совместимого HLA–идентичного здорового донора [8].

Целью нашего исследования является выявление частоты распространенности и своевременный диагностический анализ иммунофенотипа опухолевой (бластной) клеточной линейности при остром миелоидном лейкозе у больных детей в Кыргызской Республике (Киргизии).

Материалы и методы исследования

В группу исследования с ноября 2016 г. по декабрь 2019 г. вошли 30 пациентов детей (женского пола – 16, мужского пола – 14) с острым миелоидном лейкозом, из них больные дети киргизской национальности – 24 (женского пола – 14 и мужского пола – 10) и жителей русскоязычного населения (смешанная нация и разной национальности) Кыргызской Республики (Киргизии) – 6 пациентов детей, из них детей (женского пола – 2, мужского пола – 4), все граждане Кыргызской Республики (Киргизии), в возрасте от 1,5 года до16 лет, проходившие обследование в отделении детской онкологии Национального центра онкологии и гематологии Министерства здравоохранения Кыргызской Республики и в отделении детской гематологии Ошской межобластной клинической детской больницы г. Ош, в г. Санкт-Петербурге больные консультированы врачами гематологами на базе Евразийского центра онкогематологии, иммунологии и терапии.

Метод с помощью проточной цитофлуориметрии использовался впервые, и проводилось иммунофенотипирование в г. Бишкек (Кыргызская Республика (Киргизия).

Метод с помощью проточной цитофлуориметрии

Материалом для исследования был костный мозг. Больным произведена пункция грудины. При получении материала, необходимо соблюдать технику сбора и для получения качественного результата, пункционный анализ не должен быть с примесью крови и механически в пробирке с ЭДТА не разрушать клетки во время пробоподготовки к иммунофенотипированию. Иммунофенотипирование лейкозных (бластных) клеток проводят на проточном цитофлуометре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител Beckman Coulter.

Статистическая обработка полученных результатов включала в себя анализ стандартных критериев. X2-квадрат, использовали для оценки достоверности различий по встречаемости определенных признаков между исследуемой группой. Определение величины «р», соответствующей найденному значению. X2-квадрат, велось на компьютерной программе с учетом одной степени свободы. Все математические расчеты и общий статистический анализ полученных исследований проводили с помощью персонального компьютера с использованием пакета прикладных программ для Электронных Таблиц Microsoft – ExcelM Версия 7,0 для Windows 95, для Windows-2010, Statistica-5.

Результаты исследования и их обсуждение

При проведении нами исследований, диагноз острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) устанавли вался на основании клинических данных и комплексных ряда общих и специальных лабораторно-диагностических показателей.

По результатам наших исследований в Кыргызской Республике (Киргизии) с острым миелоидным лейкозом(ОМЛ) у больных детей по возрастным показателям среди мужского пола выявляется в возрастах от 1,5 года до 1 года 11 месяцев, от 3лет – 3лет 11 месяцев, 8 лет – 8 лет 11 месяцев, 10 лет – 10 лет 11 месяцев и от 14 лет до 14 лет 11 месяцев и среди женского пола от 7 лет до 7 лет 11 месяцев, 9 лет – 9 лет 11 месяцев, 11 лет – 11 лет 11 месяцев и от 13 лет до 13 лет 11 месяцев, практически в 100 % случаев. Выявляются среди женского пола в возрастах от 2-х лет до 2 лет 11 месяцев в 77 % случаев, в 4 года до 4 года 11 месяцев в 50 % случаев, от 5 лет – 5 лет 11 месяцев в 32 % случаев, в 6 лет – 6 лет 11 месяцев в 50 % случаев и в 15 лет – 15 лет 11 месяцев в 50 % случаев, а среди мужского пола в возрастах от 2-х лет – 2 лет 11 месяцев в 23 % случаев, в 4 года – 4 года 11 месяцев в 50 % случаев, в 5 лет – 5 лет 11 месяцев в 68 % случаев, в 6 лет – 6 лет 11 месяцев в 50 % случаев, в 15 лет – 15 лет 11 месяцев в 50 % случаев.

При нашем наблюдении в возрастах от 12 лет до 12 лет 11 месяцев и от 16 лет до 16 лет 11 месяцев не выявлено ни среди женского пола, ни среди мужского пола – 0 % случаев, данные представлены на рис. 1.

Рис. 1. Сравнительная возрастная характеристика частоты выявляемости в Кыргызской Республике у больных детей женского и мужского пола острого миелоидного лейкоза

По значимости отличий, в Кыргызской Республике (Киргизии) острый миелоидный лейкоз у больных детей чаще выявляется среди мужского пола по сравнению с контрольной группой (женского пола) и имеет статистически достоверные различия, где р < 0,005.

По частоте распространенности среди больных детей киргизской национальности выявляется острый миелобластный лейкоз (вариант М1) в 32 % случаев, острый миелобластный лейкоз (вариант M2) в 69 % случаев, острый промиелобластный лейкоз (вариант М3) в 67 % случаев, острый миелобластный лейкоз (вариант М4) в 32 % случаев, острый монобластный лейкоз (вариант М5a, M5b) в 0 % случаев, данные представлены на рис. 2. В сравнении среди больных детей жителей русскоязычного населения Кыргызской Республики (Киргизии) выявляется острый миелобластный лейкоз (вариант М1) в 68 %случаев острый миелобластный лейкоз (вариант M2) в 31 % случаев, острый промиелобластный лейкоз (вариант М3) в 33 % случаев, острый миелобластный лейкоз (вариант М4) в 68 % случаев, острый монобластный лейкоз (вариант М5a, M5b) в 100 % случаев.

Рис. 2. Варианты острого миелоидного лейкоза(ОМЛ) среди больных детей киргизской национальности и жителей русскоязычного населения Кыргызской Республики(Киргизии)

По значимости отличий, в Кыргызской Республике(Киргизии) по вариантам течения заболевания острый миелобластный лейкоз (вариант М1) и острый миелобластный лейкоз (вариант М4) реже выявляется и практически не выявляется острый монобластный лейкоз (вариант М5a, M5b) среди больных детей киргизской национальности по сравнению с больными детьми жителей русскоязычного населения Киргизии, и имеют статистически высоко достоверные различия, где р < 0,0001.

Как видно, из представленного рис. 3, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) у больных детей среди женского пола киргизской национальности выявляется в 78 % случаев, а среди мужского пола в 83 % случаев.

Рис. 3. Распространенность среди женского и мужского пола у больных детей острого миелоидного лейкоза в Кыргызской Республике (Киргизии)

Рис. 4. Частота распространенности в Кыргызской Республике среди больных детей иммунологических вариантов острого миелоидного лейкоза (ОМЛ)

А среди больных детей женского пола жителей русскоязычного населения Кыргызской Республики (Киргизии) выявляется в 22 % случаев, среди мужского пола в 17 % случаев.

По значимости различий, по распространенности в Кыргызской Республике (Киргизии) острый миелоидный лейкоз чаще диагностируется среди больных детей (женского и мужского пола) киргизской национальности по сравнению с контрольной группой (женского и мужского пола больными детьми жителей русскоязычного населения Кыргызской Республики (Киргизии) и имеют статистически достоверные различия р < 0,005.

По данным наших исследований, как видно из представленного рис. 4, выявляются среди больных детей в Кыргызской Республики (Киргизии) наиболее распространенные – острый миелобластный лейкоз (М2) в 53 % случаев, острый миеломонобластный лейкоз (М4) в 20 % случаев и несколько реже выявляется острый промиелоцитарный лейкоз (М3) в 10 % случаев, острый миелобластный лейкоз (М1) в10 % случаев и острый монобластный лейкоз (5а, 5b) в 7 % случаев.

По значимости различий между вариантами ОМЛ и частоты выявляемости, наиболее распространенный и чаще диагностируется острый миелобластный лейкоз (вариант М2) и имеет статистически высоко достоверное различие, где р < 0,005.

Заключение

Таким образом, при остром миелоидном лейкозе важно выявление миелоидных маркеров, которые отражают ранние степени дифференцировки клеток для установления диагноза острого лейкоза. Иммунофенотипирование в диагностике вариантов миелоидной направленности опухолевых (бластных) клеток, для подтверждения миелоидной направленности необходимо оценить экспрессию миелоидных антигенов. Иммунофенотипирование с помощью проточной цитофлуориметрии при остром миелоидном лейкозе является одним из чувствительным методом в дифференциальной диагностике с учетом правильной, подробной характеристики десятки и сотни бластных клеток, и для постановки диагноза, позволяет выявить характерный иммунофенотип наличие миелопероксидазы (МРО), что диктует о необходимости своевременного подбора эффективной программы химиотерапии и после проведенной терапии при достижении полной ремиссии, выявления минимальной остаточной болезни.

Для определения варианта линейности и выявление частоты распространенности, и особенности течения острого миелоидного лейкоза у детей в Кыргызской Республике (Киргизии), необходимо проводить исследование методом с помощью проточной цитофлуориметрии. При остром миелоидном лейкозе, несмотря на изучение подробной характеристики бластных клеток, позволяющий выявить характерный иммунофенотип с помощью метода проточной цитофлуометрии, для подтверждения диагноза необходимо параллельно проводить цитогенетические, молекулярно-генетические и морфологические исследования.

По частоте распространенности острый миелоидный лейкоз встречается у больных детей и среди женского, и среди мужского пола, и течение заболевания более агрессивное, в связи, с чем необходимо при своевременной установке диагноза, определить направленность миелоидной линейности. Подбор и проведение полихимиотерапии, и пересадка гемопоэтических стволовых клеток, в частности у детей дает наилучшие результаты при наличии HLA-идентичного здорового донора.

Выводы

1. Исследовать костный мозг у больных детей с острым миелоидным лейкозом с помощью метода проточной цитофлуориметрии и параллельно проводить цитогенетические, цитохимические, морфологические исследования.

2. Скрининговое исследование опухолевых (бластных) клеток для определения линейной направленности.

3. Определить направленность – вариант миелоидной линейности и исключить лимфоидный вариант линейности.

4. Иммунофенотипирование методом проточной цитофлуориметрии позволяет выявить характерный миелоидной линейности иммунофенотип опухолевых (бластных) клеток и своевременно выбрать эффективную программу химиотерапии.

Иммунофенотипирование при остром миелоидном лейкозе

Иммунологический фенотип бластных клеток при миелоидных лейкозах очень разнообразен, и чаще всего (у 80 % больных) определяется аберрантная экспрессия антигенов.

Иными словами, типичные маркеры миелоидной направленности (CD11, CD13, CD14, CD15, CD33, CD36, CD41, CD42, CD65, HLA-DR; антиген ранних клеток-предшественниц CD34) могут экспрессироваться, во-первых, совместно с антигенами, характерными для лимфоидных клеток; во-вторых, их экспрессия может быть аномальной по сочетанию ранних и поздних маркеров клеточной дифференцировки; в-третьих, может отмечаться избыточная экспрессия какого-либо антигена (например, CD34); в-четвертых, может отсутствовать экспрессии какого-либо антигена (например, экспрессируется CD13, но нет CD33). Именно аберрантный иммунофенотип служит маркером при мониторинге минимальной остаточной болезни в период ремиссии.

Иммунофенотипирование бластных клеток при остром миелоидном лейкозе имеет принципиальное значение, пожалуй, только для определения вариантов М0 (недифференцируемый с миелоидной направленностью) и М7 (мегакариобластный).

В остальных случаях обнаружение тех или иных антигенов на лейкемических клетках свидетельствует лишь об аберрантном иммунофенотипе и в ряде случаев коррелирует с прогнозом.

Так, например, при остром миелоидном лейкозе лимфоидные маркеры встречаются у 14—60 % больных. По данным немецких исследователей, антиген CD2 экспрессировался на бластных клетках у 57 % больных, CD5-y 60%, CD7-y 37%.

Исследование американской группы CALGB по определению иммунофенотипа у 339 больных острым миелоидным лейкозом выявило следующую частоту встречаемости лимфоидных маркеров: CD2 (маркер Т-клеток) обнаружен в 21 % случаев (у 45 из 211 больных), CD19 (маркер В - клеток) — в 14 % (у 41 из 298 больных), CD2 и CD19, исследованные в сочетании,— в 33 % случаев (у 56 из 170 пациентов). Интересно, что при промиелоцитарном лейкозе сочетание с лимфоидными маркерами отмечается в 2 раза чаще, а при миеломонобластном лейкозе с эозинофилией (М4эо) — в 8 раз чаще, чем при других миелоидных лейкозах.

Известно, что и М3, и М4эо являются наиболее благоприятными вариантами острого миелоидного лейкоза по результативности лечения, поэтому неудивительно, что у больных, лейкемические клетки которых экспрессируют наряду с миелоидными и лимфоидные маркеры, процент ремиссий оказался достоверно выше (75 против 59 %; р = 0,04) и общая выживаемость в течение 2 лет лучше (43,8 ± 6,3 % против 29,8 ± 3,8 %; р = 0,02). Прогностическую значимость имеет также обнаружение раннего антигена кроветворных клеток CD34: прогноз у больных, клетки которых несут данный маркер, существенно хуже, чем у тех, у кого он отсутствует. Следует отметить, что данный маркер наиболее часто определяется у пожилых больных осрым миелоидным лейкозом.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Читайте также: