Строение кальциевой АТФазы SERCA и механизм закачивания кальция
Добавил пользователь Дмитрий К. Обновлено: 21.12.2024
Содержание работы
Введение 2
ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА Са-АТФазы 3
СТРОЕНИЕ КАЛЬЦИЕВОЙ АТФазы 4
Регуляция активности транспортных АТФаз 5
Нарушение активности кальциевой АТФазы 6
Заключение 7
Список литературы: 8
Файлы: 1 файл
Кальциевая атфаза готовый (Автосохраненный).docx
Государственное бюджетное образовательное учреждение
Высшего профессионального образования
«Новосибирский медицинский государственный университет
Министерства здравоохранения Российской Федерации»
(ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава России)
КАФЕДРА МЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ
на тему «Кальциевая АТФаза»
Студент 1-го курса группы №18
ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА Са-АТФазы 3
СТРОЕНИЕ КАЛЬЦИЕВОЙ АТФазы 4
Регуляция активности транспортных АТФаз 5
Нарушение активности кальциевой АТФазы 6
Список литературы: 8
Этот процесс в цитоплазме покоящихся клеток создает возможность регуляции клеточных функций путем увеличения проницаемости клеточных мембран для Ca2 +: входя в клетку, эти ионы активируют великое множество различных внутриклеточных процессов. Яркий пример - сокращение мышцы, которое начинается с выхода ионов кальция из саркоплазматического ретикулума и его взаимодействия с сократительными белками. Последующее удаление Ca2 + из цитоплазмы и накопление его в емкостях эндоплазматического ретикулума осуществляются Са-АТФазой и приводят к расслаблению мышцы (рис. 1). В других клетках ионы кальция, входя пассивно через открывающиеся каналы, связанные с различными рецепторами, также играют роль посланников, дающих приказы включить ту или иную внутриклеточную систему. После исполнения приказа "посланников" надо выпроводить из цитоплазмы, что и делают Са-АТФазы, а также Na+-Ca2 +-обменники.
Кальциевые АТФазы, входящие в состав цитоплазматических мембран и внутриклеточных мембран, различаются по ряду свойств. Все Са-АТФазы представляют собой мономерные белки, то есть состоят из единственной полипептидной цепи, но несколько различаются по молекулярной массе. Так, Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума имеет молекулярную массу 108 кД, а плазматическая Са-АТФаза - 120 кД. Лучше всего изучена Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума поперечнополосатых мышц, и именно ее строение и работа будут рассмотрены подробно в данном реферате.
ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА Са-АТФазы
Изучение механизма транспорта Са2 + при работе Са-АТФазы проводилось главным образом на изолированных пузырьках саркоплазматического ретикулума (СР), полученных после гомогенизации тканей путем последовательных центрифугирований. Пузырьки СР в электронном микроскопе выглядят так же, как и другие мембранные структуры. На сколах замороженных суспензий изолированных пузырьков саркоплазматического ретикулума видны внутримембранные частицы диаметром около 9 нм. Эти глобулярные частицы на поверхности скола образуются вследствие внедрения в гидрофобную зону мембраны участков полипептидной цепи Са-АТФазы. Анализ белкового состава пузырьков показывает, что основным белком в ретикулуме является Са-АТФаза (70-80% всех белков). Используя различные приемы, можно очистить Са-АТФазу от других белков. Правда, при очистке обычно повреждается мембрана, и изучать транспортную функцию становится невозможным. Но, добавив фосфолипиды, удается восстановить целостность везикул и получить прекрасный объект для изучения функции Са-АТФазы: фосфолипидные пузырьки со встроенным в них работающим ферментом.
СТРОЕНИЕ КАЛЬЦИЕВОЙ АТФазы
Выражение "О ферментах, как и о людях, судят по их действию" сейчас уже не так бесспорно. Многие ферменты получены в виде кристаллов, и на основании рентгеноструктурного анализа воссоздана их подробная пространственная структура, а подчас и структура их комплексов с субстратами и ингибиторами. К сожалению, транспортные АТФазы, нерастворимые в воде и работающие в составе мембран, не удается получить в виде настоящих кристаллов. Тем не менее многое об их структуре все же известно, включая последовательность аминокислот в полипептидной цепи, локализацию мест связывания ионов и АТФ в полипептидной цепи и расположение определенных участков цепи по отношению к мембране.
На рис. 4 приведено схематическое изображение Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц. Фермент пронизывает мембрану 11-ю a-спиральными участками, большая часть которых соединена снаружи короткими полипептидными связками, за исключением двух протяженных гидрофильных (то есть хорошо растворимых в воде) петель на стороне цитоплазмы. Более короткая петля расположена между a-спиралями М2 и М3, более длинная - между a-спиралями М4 и М5. Длинная петля содержит АТФ-связывающий участок, включающий остаток аспарагиновой кислоты, к которому присоединяется фосфат. Связывание ионов Ca2 + происходит на участке, образованном малой петлей (между a-спиралями М2 и М3), возможно с участием аминокислотных остатков, прилежащих к спиралям М1 и М4. В местах связывания собрано несколько остатков аспарагиновой кислоты, несущих отрицательные заряды.
Регуляция активности транспортных АТФаз
Активность кальциевых АТФаз внутриклеточных депо (например, эндоплазматического ретикулума клеток сердца, печени или эпителия) регулируется особым белком - фосфоламбаном, который связывает участок пептидной цепи АТФазы неподалеку от места фосфорилирования (см. рис. 4) и тормозит работу фермента за счет уменьшения сродства участков связывания Ca2 + к этому иону. При необходимости внутриклеточные регуляторные системы отцепляют фосфоламбан от АТФазы, и ее работа восстанавливается. Это осуществляется за счет фосфорилирования фосфоламбана протеинкиназами. Фосфорилированный фосфоламбан не обладает способностью связываться с Са-АТФазой и снижать ее активность.
Основным регулятором кальциевых АТФаз цитоплазматической мембраны служит другой белок - кальмодулин. Его действие как бы противоположно действию фосфоламбана. Дело в том, что цитоплазматическая Са-АТФаза обладает любопытной способностью ингибировать саму себя. Ее С-конец, экспонированный в цитоплазму, загибается и, подобно жалу скорпиона, поражает Са-АТФазу, блокируя центры связывания кальция. Кальмодулин берет на себя функцию защитника: он связывается с участком вблизи С-конца (см. рис. 4) и снимает ингибирование Са-АТФазы, лишая полипептидный хвост способности связываться с активным участком АТФазы. Таким образом, если фосфоламбан ингибирует эндоплазматическую Са-АТФазу, то кальмодулин реактивирует аутоингибированную цитоплазматическую Са-АТФазу. Несмотря на противоположное действие, кальмодулин и фосфоламбан - родственники: сравнение аминокислотных последовательностей показывает, что многие участки полипептидной цепи у них совпадают. Изобретательная природа сумела один и тот же исходный материал (белок-предшественник, как бы пракальмодулин) приспособить для выполнения противоположных функций.
Нарушение активности кальциевой АТФазы
У экспериментальных животных, страдающих гипертонией, снижена активность кальциевых АТФаз в гладких мышцах стенок кровеносных сосудов. Это снижение активности приводит к повышению содержания внутриклеточного кальция. А поскольку ионы Ca2 + запускают механизм мышечного сокращения, тонус сосудистой стенки будет усилен, что приведет к повышению кровяного давления в целом организме.
В числе причин поражения Са-АТФазы у гипертоников называют активацию процессов с участием свободных радикалов. Действительно, в модельных опытах с изолированными везикулами саркоплазматического ретикулума было показано, что Са-АТФаза очень чувствительна к перекисному окислению липидов, при котором происходит окисление SH-групп, входящих в активный центр фермента. Мало того, что подпорченная таким образом Са-АТФаза перестает качать ионы кальция (рис. 5); из насоса она превращается в канал для кальция, через который эти ионы начинают переноситься не из цитозоля в ретикулум, как им полагается, а, наоборот, из ретикулума, где их концентрация выше, в клеточный сок, где их концентрация ниже (рис. 6).
Превращение Са-АТФазы из помпы в канал предопределено ее структурой. Подобно велосипедному насосу, Са-АТФаза состоит из трубки, поршня и клапанов. Трубка - это ионный канал, состоящий из сравнительно небольшого фрагмента полипептидной цепи, который удалось отделить от остальной части АТФазы обработкой фермента протеазами, выделить и очистить. При встраивании этих фрагментов в липосомы их мембраны становятся проницаемыми для ионов Са2 +. При перекисном окислении липидов, окружающих АТФазу, ее поршень и клапаны, по-видимому, ломаются, и ионы кальция начинают беспрепятственно течь по трубке в сторону меньшей концентрации.
Подобного типа повреждение кальциевых насосов происходит нередко. Хорошо известна роль свободных радикалов в развитии широкого круга так называемых дегенеративных болезней, включая рак, многие интоксикации, болезни, связанные с атеросклерозом и иммунными нарушениями. Во многих случаях повреждение Са-АТФаз свободными радикалами может играть не последнюю роль в зарождении и развитии заболевания.
Следуя из выше сказанного, можно сделать вывод о том, что изменение концентрации ионов кальция внутри клетки играет важнейшую роль во многих процессах жизнедеятельности нейронов, таких как высвобождение медиатора в синаптическую щель, активация ионных каналов в клеточной мембране, а также регуляция целого ряда цитоплазматических ферментов.
В мышечных клетках кальций играет ключевую роль в запуске процесса сокращения мышечного волокна. Все эти функции связаны с кратковременным повышением концентрации кальция в цитоплазме, поэтому важной задачей для клетки является поддержание неизменного уровня кальция в покое. В противном случае различные кальций - зависимые механизмы будут активироваться не в ответ на специфическое раздражение, а постоянно.
Строение кальциевой АТФазы SERCA и механизм закачивания кальция
Регуляция мышечного сокращения ионами кальция
Ионы Са2+ представляют собой вторичный мессенджер, принимающий участие в многочисленных процессах передачи сигнала в различных клетках. У высших организмов внутриклеточный Са2+ участвует в таких разнообразных процессах, как синаптическая передача, мышечное сокращение, секреция инсулина, оплодотворение и экспрессия генов. В данной статье мы рассмотрим вопросы регуляции мышечного сокращения и сердечного ритма ионами Са2+.
Процесс, в результате которого деполяризация мембраны приводит к генерации мышечных усилий, называется сопряжение возбуждения и сокращения. Это фундаментальный механизм, контролирующий функции скелетных и сердечной мышц. В цитозоле клеток покоящихся мышц поддерживается гораздо более низкая концентрация свободного Са2+ (10 -7 М), чем во внеклеточной среде (10 -3 М) и в саркоплазматическом ретикулуме.
В начале процесса сопряжения возбуждения и сокращения ионы Са2+ начинают поступать в цитозоль, а по мере возвращения клетки в состояние покоя выходят оттуда. Такое увеличение и снижение концентрации Са2+ в цитозоле представляют собой фазный момент в процессе сопряжения возбуждения и сокращения. Для его протекания необходимо участие нескольких типов Са2+-транспортных белков.
В клетках сердечной мышцы процесс возбуждения и сокращения подразделяется на четыре стадии.
На первой стадии, при деполяризации плазматической мембраны (сарколеммы) на ней генерируется электрический сигнал. При этом, благодаря входящему потенциалу действия, мембранный потенциал приобретает более положительное значение по сравнению с потенциалом покоя. Потенциал-зависимые Са2+-каналы (которые называются Cav1.2 Са2+-каналы) улавливают эти изменения мембранного потенциала и открываются (фаза 2 потенциала действия клеток миокарда). Небольшой поток ионов Са2+ начинает транспортироваться в клетку в направлении электрохимического градиента.
На второй стадии при поступлении Са2+ через Cav1.2 Са2+-каналы начинается высвобождение Са2+ из саркоплазматического ретикулума, в котором он депонирован в миллимолярных концентрациях. Выход Са2+ из саркоплазматического ретикулума происходит через особые каналы, называемые рианодиновые рецепторы (RyRs). В клетках сердечной мышцы этот процесс носит название Са2+-зависимый выход Са2+. Количество Са2+, выходящее в цитозоль из саркоплазматического ретикулума, в несколько раз превышает поступающее в цитозоль через сарколемму.
Са2+-зависимые Са2+-каналы саркоплазматического ретикулума клеток миокарда называются рианодиновыми рецепторами, поскольку они специфически связывают растительный алкалоид рианодин, блокирующий их действие. В различных клетках экспрессируются разные каналы внутриклеточного высвобождения Са2+, которые открываются в ответ на разнообразные сигналы, вызывающие мышечное сокращение. Основной вид каналов, высвобождающих Са2+ из саркоплазматического ретикулума клеток миокарда, относится к изоформе RyR2.
При генерации и распространении потенциала действия в клетках миокарда концентрация Са2+ в цитозоле увеличивается и снижается.
Это обеспечивается несколькими различными типами белков, транспортирующих Са2+.
На третьей стадии увеличение концентрации ионов Са2+ в цитозоле приводит к активации Са2+-зависимого белка тропонина С, который стимулирует сокращение мышечных волокон. Для эффективной активации всех внутриклеточных микрофиламентов и сокращения сердечной мышцы необходимо увеличение концентрации Са2+ в цитозоле со 100 нМ до 1,0 мкМ.
На четвертой стадии, когда Са2+ вытесняется из цитозоля, наступает расслабление мышцы. Вытеснение Са2+ происходит по нескольким механизмам. Основной из них — мобилизация Са2+ обратно в депо саркоплазматического ретикулума с помощью Са2+-АТФазы. Этот фермент осуществляет функцию насоса и направляет обратно в депо Са2+, который высвободился из саркоплазматического ретикулума при участии RyRs. Наряду с этим, Са2+ удаляется из цитозоля при участии таких Са2+- транспортных белков, как Na+/Са2+-обменник плазматической мембраны.
Этот обменник выводит из цитозоля небольшую часть Са2+, поступившего через потенциал-зависимые Cav1.2 Са2+-каналы. Немного Са2+ также обменивается между цитозолем и митохондриями.
В общем, за небольшими исключениями, процессы возбуждения и сокращения в скелетных и сердечной мышцах сходны. В отличие от клеток миокарда, потенциал-зависимые Са2+-каналы плазматической мембраны скелетных мышц представлены другой изоформой и стимулируют выход Са2+ из саркоплазматического ретикулума при физическом взаимодействии с изоформой рианодинового рецептора — RyRl. Наряду с этим, активация скелетных мышц может постепенно нарастать за счет вовлечения в процесс все большего количества мышечных волокон, что приводит к увеличению силы сокращения.
Таким образом, активация скелетных мышц может варьировать от коротких одиночных до повторяющихся тетанических сокращений и в конце концов ограничивается степенью мышечной усталости.
Предполагаемая структура инозитол-1,4,5-трифосфатного рецептора эндоплазматического ретикулума.
Слева показан Са2+-градиент, создающийся по сторонам мембраны эндоплазматического ретикулума в покоящихся клетках животных.
Каналы высвобождения внутриклеточного Са2+ относятся к числу уникальных ионных каналов. Они подразделяются на две группы: RyRs включаются и выключают ся под действием Са2+ или при прямом взаимодействии с Са2+-каналами плазматической мембраны, и близкие к ним рецепторы инозитол-1,4,5-трифосфата (IP3Rs), которые регулируются IР3. Четыре RyR или IP3R субъединицы собираются в симметрично организованный комплекс, образующий канал. Оба типа каналов состоят из двух доменов: порового и большого цитоплазматического, снабженного воротным механизмом. Предполагается, что канал IP3Rs имеет шесть трансмембранных сегментов и одну поровую петлю на субъединицу. Близкая структура постулируется и для RyRs.
Са2+-каналы RyR представляют собой самые большие из известных ионных каналов. Структура их доменной организации получена при трехмерном моделировании с использованием данных электронно-микроскопических исследований. Эти каналы в 10 раз больше, чем Na+-, Са2+- или К+-каналы. Каждая субъединица RyR состоит примерно из 5000 остатков аминокислот, почти вдвое превышая размер частично гомологичной IP3R субъединицы. Величина поровых доменов RyRs и IP3Rs примерно такая же, как для К+-каналов. Большие цитоплазматические домены RyRs и IP3Rs контролируют открытие-закрытие каналов с помощью Са2+ и IР3, подобно тому, как это имеет место в лиганд-зависимых К+-каналах.
Мутации, нарушающие процессы открывания-закрывания каналов внутриклеточного высвобождения Са2+, приводят к развитию различных заболеваний. Например, миссенс-мутации в гене, кодирующем белок RyR2, связаны с двумя генетическими формами аритмии и внезапной смерти при физической нагрузке. Мутантная форма RyR Са2+-канала обладает пониженным сродством к калстабину 2 (который также называется FKBP12.6). Калстабин2 представляет собой субъединицу Са2+-канала, которая стабилизирует закрытое состояние RyR миокарда, предотвращая его аберрантную активацию.
В результате мутации в белке RyR в фазе покоя или диастолы сердца, из саркоплазматического ретикулума начинается усиленный выход ионов Са2+. Более того, разрегулирование RyR2 при болезнях сердца увеличивает вероятность ухудшения сердечной функции и наступления внезапной смерти. К общему механизму, вероятно, относится внутриклеточная утечка Са2+, которая за счет аберрантной деполяризации мембраны может вызвать угрожающую аритмию.
Мутации в гене, кодирующем RyR-изоформу клеток скелетных мышц, также приводят к аберрантному выходу внутриклеточного кальция, что служит причиной заболевания, известного под названием злокачественная гипертермия. Больные крайне чувствительны к неконтролируемому внутриклеточному выходу Са2+, при этом у них поднимается температура и отмечается генерализованная мышечная контрактура. При применении в ингаляциях некоторых анестетиков и мышечных релаксантов у больных могут наступить серьезные нарушения метаболических процессов, представляющие угрозу для жизни.
Мутации в гене, кодирующем белок потенциал-зависимых Са2+-каналов плазматических мембран скелетных мышц, который физически взаимодействует с RyRs и активирует его, также обеспечивают восприимчивость к развитию злокачественной гипертермии.
Два внутриклеточных канала, высвобождающих Са2+:
IР3-рецептор (IP3R) и рианодиновый рецептор (RyR), и два К+-канала: потенциал-зависимый канал Шейкера и Са2+-зависимый канал MthK различаются по размерам.
Поровые домены обозначены голубым и желтым цветом соответственно.
Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021
• Подобно Na+/К+-АТФазам, реакционный цикл для Ca 2+ -АТФазы включает две основные конформации
• Фосфорилирование субъединиц Ca 2+ -АТФазы приводит к изменениям конформации и к транслокации ионов Ca 2+ через мембрану
Стимуляция клеток, происходящая под действием гормонов или электрического импульса, приложенного к плазматической мембране, проявляется во временном увеличении концентрации в цитозоле ионов Ca 2+ , которые регулируют множество внутриклеточных процессов. Под действием Ca 2+ активируются многие клеточные функции, от транскрипции генов и синтеза белка до регулируемой секреции гормонов, активации иммунного ответа, клеточной подвижности, возбуждения нейронов и сокращения клеток. Почти все клетки для быстрого увеличения концентрации в цитозоле ионов Ca 2+ способны высвобождать их из внутриклеточных депо. Увеличение содержания Ca 2+ в цитозоле зависит от его высвобождения из эндоплазматического ретикулума (ЭПР).
Наряду с функционированием в качестве части секреторного механизма, ЭПР функционирует как депо внутриклеточного Ca 2+ . В эндоплазматическом ретикулуме концентрация Ca 2+ составляет порядка 10-3 М, и между ним и цитозолем, содержащим 10-7 М Ca 2+ , существует крутой электрохимический градиент концентрации. После прохождения кальциевого сигнала в клетке снова устанавливается концентрация Ca 2+ , характерная для состояния покоя. Основным Ca 2+ -транспортным белком, который обеспечивает выход из цитозоля ионов Ca 2+ , является Ca 2+ -АТФаза, различные изоформы которой присутствуют в ЭПР и в плазматической мембране.
В настоящем разделе мы рассмотрим одну из основных Ca 2+ -АТФаз, которая находится в мышечных клетках и нейронах. Клетки скелетных мышц обладают специальной структурой больших внутриклеточных депо Ca 2+ , которые называются саркоплазматическим ретикулумом (СР). Эта структура способна эффективно контролировать внутриклеточный захват Ca 2+ и его выброс в цитозоль.
Выход ионов Ca 2+ из цитозоля мышечных клеток в основном обеспечивается Ca 2+ -АТФазой (SERCA) саркоплазматического ретикулума. Клетки мышц являются одними из крупнейших клеток организма, и для эффективной активации и расслабления сократительных белков по всему объему клетки необходима разветвленная сеть структур, обеспечивающих внутриклеточное высвобождение Ca 2+ и его реабсорбцию в депо.
Цикл транспорта Ca 2+ в саркоплазматический ретикулум (СР) SERCA-насосом.
Ионы Ca 2+ связываются с высоким сродством с переносчиком, который находится в Е1-конформации.
Конформация Е2 обладает низким сродством к Ca 2+ . Макроэргическая фосфатная связь обозначена как Е1~Р.
SERCA-насос представляет собой Ca 2+ -активируемую АТФазу, которая является представителем большого семейства АТФ-зависимых клеточных насосов, известных под названием АТФазы P-типа. Эти АТФазы используют механизм, посредством которого энергия, высвобождающаяся при гидролизе АТФ, расходуется на транспорт ионов Н+, Na+ или Ca 2+ против градиента концентрации. Характерная особенность АТФаз P-типа состоит в том, что в присутствии соответствующего катиона они используют АТФ для фосфорилирования остатка аспарагиновой кислоты, находящегося в структуре этих ферментов. Фосфорилирование приводит к появлению промежуточного макроэргического белка, который попеременно осуществляет связывание Ca 2+ и перенос фосфата в цикле работы насоса.
Таким образом, SERCA-насос использует химическую энергию гидролиза АТФ для быстрого снижения внутриклеточной концентрации Ca 2+ , за счет его реабсорбции в депо саркоплазматического ретикулума (СР).
На рисунке ниже представлены предполагаемые этапы цикла SERCA-насоса. Этот цикл характеризуется двумя основными конформациями фермента:
• конформация Е1, в которой Ca 2+ с высоким сродством связывается с цитоплазматической стороны, и
• конформация Е2, в которой связывание Ca 2+ происходит со значительно меньшим сродством, и поэтому он выходит из мест связывания в люмен СР.
В течение каждого ферментативного цикла два иона Ca 2+ транспортируются в люмен СР, и предполагается, что протоны переносятся в противоположном направлении. При высокоафинном связывании двух атомов Ca 2+ , находящихся в цитозоле, конформация меняется на E1 (2Ca 2+ ). В этой конформации белок подвергается аутофосфорилированию с образованием промежуточного макроэргического белка Е1~Р(2Ca 2+ ). Энергия этого фосфопротеина расходуется на переход в конформацию Е2-Р(2Н+), которая обладает меньшим сродством к ионам Ca 2+ . В этой конформации закрывается вход ионов из цитозоля, снижается сродство к ионам Ca 2+ -транспортных сайтов, и открывается выход ионов в люмен СР. В обмен на связывание Н+, ионы Ca 2+ поступают в депо СР. Затем происходит гидролиз фосфатной группы, и цикл завершается.
Расположение сайта фосфорилирования (Asp351) и ключевых остатков аминокислот, участвующих в связывании Ca 2+ в изоформе SERCA1.
Показан градиент Ca 2+ по сторонам мембраны саркоплазматического ретикулума.
Суммируя, можно отметить, что рабочий цикл SERCA-насоса состоит из последовательных событий фосфорилирования-дефосфорилирования, в результате которых два иона Ca 2+ транспортируются в СР против градиента концентрации в обмен на два иона Н+. При этом происходит гидролиз одной молекулы АТФ.
SERCA-насос характеризуется асимметричным расположением трансмембранных и цитозольных доменов, которые значительно перемещаются при транспорте ионов Ca 2+ . Как следует из рисунка ниже, АТФаза состоит из 10 трансмембранных а-спиралей (М1-М10) и двух больших цитоплазматических петель, расположенных между трансмембранными спиралями, причем одна петля находится между М2 и М3, а другая между М4 и М5. Трансмембранные а-спирали образуют сайты связывания Ca 2+ , которые в конформации Е, кооперативно связывают два атома Ca 2+ из цитозоля. Две цитоплазматические петли образуют три отдельных домена. Петля между спиралями М4 и М3 образует нуклеотид-связывающий домен (N), который связывает АТФ, и P-домен, содержащий сайт фосфорилирования. Петля между М2 и М3 содержит домен (А), который необходим для передачи конформационных изменений между трансмембранным и цитозольным доменами.
На рисунке ниже представлены две кристаллические структуры, соответствующие SERCA-насосу, находящемуся в конформации Е2 (2Н+) и Е1 (2Ca 2+ ). Трансмембранные сегменты содержат гидрофильные остатки, которые образуют транспортный путь для ионов Ca 2+ . Открытие и закрытие транспортного пути, по-видимому, сопряжены с конформационными перестройками цитоплазматических доменов с участием S4 и S5 удлиннений М4 и М5 трансмембранных сегментов. Для структуры, способной с высоким сродством связывать Ca 2+ , характерно наличие широкого промежутка между цитозольными доменами. За счет этого промежутка АТФ связывается с N-доменом. Предполагается, что после того, как ионы Ca 2+ связались с трансмембранными доменами и возникла конформация Е, (2Ca 2+ ), связывание АТФ приводит к фосфорилированию критического остатка аспарагиновой кислоты, Asp351 в Р-домене. Это фосфорилирование индуцирует переход в конформацию Е2 с низким сродством к Ca 2+ .
В этой конформации при перегруппировке трансмембранных доменов разрушаются Ca 2+ связывающие сайты, открываются ворота SERCA-насоса на стороне люмена, и ионы Ca 2+ высвобождаются в просвет саркоплазматического ретикулума. При обратном переходе от Е2 (2Н+) в Е1 (2Ca 2+ ) конформацию происходит значительное перемещение доменов цитозоля, при этом из компактной структуры образуется открытая. Молекулы воды входят в открытую структуру и обеспечивают процесс дефосфорилирования, который является важным этапом на пути возвращения SERCA-насоса в конформационное состояние, при котором он способен связывать ионы Ca 2+ . Сайты связывания Ca 2+ доступны для цитоплазматического Ca 2+ , но не для ионов, содержащихся в люмене, поскольку в течение цикла работы изменяется сродство насоса к кальцию.
Поскольку для прекращения процесса сокращения мышцы и начала ее расслабления требуется снижение внутриклеточной концентрации Ca 2+ , необходимо, чтобы поток Ca 2+ через SERCA направлялся только от цитозоля к депо СР, а не наоборот. Направление потока ионов через Ca 2+ -АТФазы определяется последовательным сопряжением событий гидролиза АТФ и направленного транспорта Ca 2+ . Конформационные изменения в доменах А, N и Р, наступающие при связывании АТФ и фосфорилировании, вызывают растяжение трансмембранных спиралей, перекрывающее путь ионом Ca 2+ со стороны цитоплазмы. При переносе фосфатной группы ворота д ля кальция закрываются. Таким образом, в физиологических условиях не существует обратного потока ионов Ca 2+ от СР в цитозоль.
Для экспорта ионов Ca 2+ из цитозоля и поддержания в нем необходимого в покое уровня этих ионов, SERCA-насос работает совместно с Ca 2+ -АТФазой плазматической мембраны (РСМА). Оба фермента отличаются высоким сродством к ионам Ca 2+ , которое значительно превышает сродство к этому катиону других кальций-связывающих белков и буферных систем цитозоля. РСМА и SERCA насосы имеют близкое строение и сходный механизм действия. Они содержат десять трансмембранных последовательностей и три больших домена в цитозоле. Наряду с различной локализацией в клетке, РМСА-насос отличается от SERCA тем, что в расчете на одну молекулу АТФ переносит один, а не два иона Ca 2+ . Высокая транспортная эффективность и высокая плотность насоса SERCA в мембранах СР возбудимых клеток объясняют его преимущественное участие в выведении Ca 2+ из цитозоля.
Na+/К+-АТФаза и Н+-АТФаза, которые также относятся к семейству АТФаз P-типа, имеют ряд обших структурных особенностей с группой SERCA. Гомологическое сходство между Na+/К+-АТФазой и Ca 2+ -АТФазами выражено в большей степени, чем для других АТФаз, и сравнение их структурных особенностей под держивает точку зрения о том, что эти ферменты обладают общими механизмами сопряжения процессов гидролиза АТФ и транспорта катионов через мембрану. Все три катионных насоса используют одинаковый каталитический цикл, который включает связывание АТФ, конформационные перестройки, приводящие к захвату транспортируемых катионов, их высвобождение с другой стороны мембраны, и дефосфорилирование д ля возвращения фермента в исходную конформацию, способную к связыванию ионов.
Структура E2 не содержит ионов Ca2+, а структура Е1 содержит два связанных иона.
Трансмембранные спирали обозначены различными цветами, от красной Ml до темносиней М10.
Структура SERCA Е2 и кристаллическая структура Е1 построены на основании данных Protein Data Bank files 1EUL и 1IWO соответственно.
Показано предполагаемое положение мембраны.
• Са2+-каналы, расположенные на поверхности клетки, переводят сигналы, получаемые мембраной, во внутриклеточные Са2+-сигналы
• Потенциал-зависимые Са2+-каналы представляют собой асимметричные белковые комплексы, состоящие из пяти различных субъединиц
• Подобно К+-каналу, а-субъединица потенциал-зависимых Са2+-каналов образует пору и содержит структуру поровой петли
• Селективный фильтр Са2+-канала образует электростатическую ловушку
• Са2+-канал стабилизируется в закрытом состоянии с помощью блокаторов канала
Ионы Са2+ представляют собой вторичный мессенджер и контролируют многие клеточные функции, такие как сокращение сердечной и скелетных мышц, зрительный процесс в сетчатке глаза, иммунный ответ Т-клеток, возбудимость нервных клеток и поведенческие реакции, а также секрецию инсулина b-клетками поджелудочной железы. Активация клеточных функций наступает в ответ на изменения концентрации Са2+ в цитозоле покоящейся клетки, которая примерно в 10 000 раз ниже, чем его концентрация во внеклеточной среде.
Запасы Са2+ в эндоплазматическом (ЭПР) и в саркоплазматическом ретикулуме (СР) достигают таких же величин, как его содержание во внеклеточной среде.
Уровень Са2+ в цитозоле регулируется за счет совместного функционирования различных растворимых Са2+ связывающих белков, а также белков, осуществляющих его трансмембранный перенос. Например, различные типы Са2+-каналов в плазматической мембране, в ЭПР и СР катализируют селективный транспорт ионов в цитозоль в направлении их электрохимического градиента. Различные типы каналов характеризуются различными воротными механизмами с участием внеклеточных лигандов, электрического потенциала, или же самих ионов Са2+.
При закрытии Са2+-каналов плазматической мембраны прерывается передача сигнала, и ионы Са2+ начинают выходить из цитозоля при участии специальных транспортных белков. Закрытие Са2+-каналов плазматической мембраны, которое предотвращает попадание в клетку избытка ионов Са2+, происходит с участием двух основных механизмов: Са2+-зависимой и потенциал-зави-симой инактивации. При активации белка калмодули-на, который связывается с внутриклеточным доменом Са2+-канала в ответ на поступление Са2+ в клетку, происходит инактивация многих типов Са2+-каналов по механизму отрицательной обратной связи.
В настоящем разделе мы рассмотрим предполагаемый механизм транспорта ионов через Са2+-каналы, основное внимание уделив потенциал-зависимым Са2+-каналам, и сравним механизмы их функционирования с работой К+-каналов.
Три основных типа каналов транспорта ионов Са2+ из внеклеточной среды в клетку.
Ионные каналы также осуществляют транспорт ионов Са2+ из внутриклеточных депо в цитозоль.
Слева показан градиент ионов Са+, создающийся по обеим сторонам плазматической мембраны и мембраны саркоплазматического ретикулума.
Потенциал-зависимые Са2+-каналы обеспечивают транспорт Са2+ в клетки в тех случаях, когда значения мембранного потенциала изменяются в положительную сторону за счет деполяризации. Эти каналы переводят электрический сигнал плазматической мембраны во внутриклеточный сигнал. Поступление в клетку ионов Са2+ приводит к увеличению его концентрации до определенного уровня и тем самым к запуску различных процессов, таких, как, например, мышечное сокращение, высвобождение гормонов и нейромедиаторов, активация Са2+-зависимых каскадных процессов и транскрипция генов. Существуют различные типы потенциалзависимых Са2+-каналов, которые классифицируются в соответствии с их электрофизиологическими и фармакологическими свойствами.
В данной статье мы рассмотрим Са2+-каналы L-типа, которые были клонированы первыми и остаются наиболее изученными. Каналы этого типа находятся в плазматической мембране скелетных мышц, миокарда и гладких мышц, а также нейронов. Активация их происходит при деполяризации мембраны.
Эти каналы называются каналами L-типа потому, что они в течение долгого времени могут оставаться в открытом состоянии. В клетках скелетных и гладких мышц, миокарда, в нейронах, эндокринных клетках и сетчатке они представлены основными Cavl.X изоформами. Са2+-каналы L-типа представляют собой гетероолигомерные белковые комплексы, состоящие из пяти субъединиц: а1, а2, δ, b и γ. Функционирование канала и его позиционирование на мембране требуют участия всех субъединиц.
Присутствие гидрофобных и гидрофильных последовательностей в составе a1-субъединицы позволяет предполагать существование четырех порообразующих структур, каждая из которых состоит из трансмембранных сегментов 5 и 6 и из поровой петли, входящей в состав селективного фильтра. Также предполагается существование четырех сенсорных сегментов, каждый из которых состоит из трансмембранных сегментов 1-4. Такой тип трансмембранной организации напоминает потенциал-зависимые Na+-каналы. Субъединица b участвует в инактивации и закрытии канала. Вместе с а-субъединицей она может контролировать воротный механизм за счет взаимодействия с порообразующим трансмембранным сегментом S6 домена I.
При использовании метода электронной криомикроскопии были получены данные, позволившие предложить трехмерную структуру, описывающую строение потенциал-зависимого Са2+-канала L-типа. Как показано на рисунке ниже, канал представляет собой асимметричный белок, по форме напоминающий сердце и в широкой части снабженный подобием ручки. Большая часть локализована вне клетки и включает структуру наподобие ручки, а2-субъединицу, N-терминальный участок субъединицы δ и внеклеточные петли субъединиц а1 и у.
Предполагаемая структура субъединиц Са2+-канала L типа.
Внизу на вставке показана трехмерная структура,
полученная с использованием метода электронной криомикроскопии.
Са2+-каналы обладают высокой селективностью по отношению к ионам Са2+ и осуществляют транспорт ионов с высокой скоростью. Ионы Na+ относятся к числу самых распространенных внеклеточных катионов, и их концентрация почти в 100 раз превышает концентрацию ионов Са2+. Диаметр ионов Na+ близок к диаметру ионов Са2+ (2,0 А). Поэтому посредством простого молекулярного сита разделить их невозможно. Каким же образом Са2+-каналы достигают высокой селективности в отношении ионов Са2+ и в то же время обеспечивают их быстрый транспорт?
Поры К+-каналов обладают селективными фильтрами, которые имитируют водное окружение, стабилизирующее транспортируемые ионы. При прохождении через фильтр ионы подвергаются дегидратации. Например, селективные фильтры К+-каналов обладают четырьмя Р-петлями, образующими довольно жесткую структуру, изнутри облицованную атомами кислорода карбонильной группы. Этим достигается определенное расположение ионов К+ на пути транспорта. Селективный фильтр потенциалзависимых Са2+-каналов, вероятно, также образован четырьмя Р-петлями.
Однако полагают, что он представляет собой более гибкую структуру, каждая Р-петля которой содержит глутаминовый остаток, причем транспортный путь ионов облицован атомами кислорода не от карбонильных, а от карбоксильных групп. (Такая конструкция напоминает EF руку сайта связывания Са2+, когда ион располагается в полости, содержащей атомы кислорода, многие из которых относятся к карбоксильным группам.) Четыре глутаминовых остатка образуют т. н. локус ЕЕЕЕ, консервативную структуру, характерную для Са2+-каналов.
Локус ЕЕЕЕ контролирует предпочтительный транспорт ионов Са2+ по сравнению с другими катионами. Замещение любого из четырех остатков глутамата другими аминокислотами резко снижает селективность канала в отношении ионов Са2+. Предполагается, что специфическое связывание именно ионов Са2+ в области устья поры обеспечивается боковыми цепями глутаминовой кислоты. Это подтверждается данными in vitro электрофизиологических измерений, которые демонстрируют, что в отсутствие ионов Са2+ через Са2+-каналы начинают проходить ионы Na+. Ионы Na+ проходят через канал быстрее ионов Са2+. Более низкая скорость транспорта ионов Са2+ позволяет предполагать, что они прочнее связываются с порами канала. Это препятствует входу в пору ионов натрия, несмотря на то что во внеклеточном пространстве их содержится больше, чем ионов Са2+.
Сродство каналов к ионам Са2+ составляет около 10 -6 М. Однако скорость транспорта, рассчитанная на основании этих данных, получается в 1000 раз ниже, чем измеренная, которая составляет 106 в 1 с. Для разрешения этого противоречия была предложена специальная модель. Согласно этой модели, локус ЕЕЕЕ способен связывать несколько ионов Са2+, и входящий в пору ион, благодаря возникающим силам электростатического отталкивания, вызывает высвобождение с внутренней стороны связанного иона Са2+. Таким образом, электростатическое отталкивание помогает преодолеть силу сродства связывания Са2+, которая бы замедлила его транспорт. Эта модель напоминает предложенную для К+-каналов, которые, как показано, обладают несколькими сайтами связывания катиона.
Потенциал-зависимые Са2+-каналы являются основными клиническими мишенями для лекарственных препаратов, используемых при лечении гипертонии и других заболеваний. К числу наиболее часто применяемых лекарственных средств относятся фенилалкиламины, бензотиазепины и дигидропиридины, которые обычно называют кальциевыми антагонистами. Первоначально, Са2+-антагонисты были введены в клиническую практику для лечении гипертонии как сосудорасширяющие средства. Они уменьшали уровень Са2+ в гладких мышцах, например в стенке кровеносных сосудов, приводя к снижению тонуса и кровяного давления.
Эксперименты по сайт-направленному мутагенезу и по связыванию лекарств позволили идентифицировать сайты, связывающие лечебные препараты. Они находятся в сегментах S5 и S6 III домена и в сегменте S6 IV домена, расположены с цитоплазматической стороны селективного фильтра. Ингибиторы ряда фенилалкиламина блокируют Са2+-каналы за счет прямого взаимодействия с остатками глутамата Р-петли селективного фильтра, которые находятся со стороны цитоплазмы, а дигидропиримидины и бензотиазепины проникают в пору канала со стороны наружного устья.
Гипотетический механизм, описывающий транспорт Са2+ через канал с участием ЕЕЕЕ-локуса.
Ионы Са2+ энергетически стабилизируют атомы кислорода карбоксильных групп и предотвращают транспорт ионов Na+,
которые не обладают достаточной величиной положительного заряда, чтобы попасть в локус ЕЕЕЕ и подвергнуться там эффективной дегидратации.
Силы электростатического отталкивания, существующие в поре между ионами Са2+, облегчают быструю диффузию.
Кальциевые насосы функции, типы, структура и работа
кальциевый насос Это структура белковой природы, которая отвечает за транспорт кальция через клеточные мембраны. Эта структура зависит от АТФ и считается белком типа АТФазы, также называемым Са 2+ -АТФазы.
Ca 2+ -АТФаза обнаружена во всех клетках эукариотических организмов и необходима для гомеостаза кальция в клетке. Этот белок осуществляет первичный активный транспорт, так как движение молекул кальция идет против его градиента концентрации.
- 1 Функции кальциевого насоса
- 2 типа
- 3 Структура
- 3.1 Насос PMCA
- 3.2 Насос SERCA
- 4.1 SERCA насосы
- 4.2 Насосы PMCA
Функции кальциевого насоса
Ca 2+ Он выполняет важные функции в клетке, поэтому его регулирование в них является основополагающим для его правильного функционирования. Часто он выступает в качестве второго посланника.
Во внеклеточных пространствах концентрация Ca 2+ это примерно в 10000 раз больше, чем внутри клеток. Увеличение концентрации этого иона в цитоплазме клетки вызывает несколько реакций, таких как мышечные сокращения, высвобождение нейротрансмиттера и деградация гликогена..
Существует несколько способов переноса этих ионов из клеток: пассивный транспорт (неспецифический выход), ионные каналы (движение в пользу его электрохимического градиента), вторичный активный транспорт антипортового типа (Na / Ca) и первичный активный транспорт с помощью насоса. зависит от АТФ.
В отличие от других механизмов вытеснения Са 2+ , насос работает в векторном виде. То есть ион движется только в одном направлении, так что он работает, только вытесняя их.
Клетка чрезвычайно чувствительна к изменениям концентрации Ca 2+ . Поэтому при представлении такой заметной разницы с его внеклеточной концентрацией важно эффективно восстанавливать его нормальные цитозольные уровни..
тип
Три типа Са были описаны 2+ -АТФазы в клетках животных, в зависимости от их расположения в клетках; насосы, расположенные в плазматической мембране (PMCA), насосы, расположенные в эндоплазматической сети и ядерной мембране (SERCA), и насосы, расположенные в мембране аппарата Гольджи (SPCA).
Насосы SPCA также транспортируют ионы Mn 2+ которые являются кофакторами различных ферментов матрицы аппарата Гольджи.
Клетки дрожжей, другие эукариотические организмы и клетки растений представляют другие типы Са 2+ -Спс очень особенный.
структура
Насос PMCA
В плазматической мембране мы обнаружили активный античастичный транспорт Na / Ca, отвечающий за вытеснение значительного количества Ca 2+ в клетках в состоянии покоя и активности. В большинстве клеток в покое ответственность за транспортировку кальция наружу несет насос PMCA.
Эти белки состоят примерно из 1200 аминокислот и имеют 10 трансмембранных сегментов. В цитозоле есть 4 основных блока. Первый блок содержит аминоконцевую группу. Второй обладает основными характеристиками, что позволяет ему связываться с активирующими кислоту фосфолипидами.
В третьем блоке находится аспарагиновая кислота с каталитической функцией, и «ниже по потоку» от этой полосы связывания изотоцианата флуоресцеина в области связывания АТФ.
В четвертом блоке находится домен связывания с кальмодулином, сайты узнавания определенных киназ (А и С) и полосы связывания Са 2+ аллостерическая.
SERCA Pump
Насосы SERCA в большом количестве содержатся в саркоплазматической сети мышечных клеток, и их активность связана с сокращением и расслаблением в цикле мышечных движений. Его функция заключается в транспортировке Ca 2+ от цитозоля клетки к матрице ретикулума.
Эти белки состоят из одной полипептидной цепи с 10 трансмембранными доменами. Его структура в основном такая же, как и у белков PMCA, но отличается тем, что они имеют только три единицы в цитоплазме, а активный сайт находится в третьей единице..
Функционирование этого белка требует баланса нагрузки при транспортировке ионов. Два Ка 2+ (гидролизованным АТФ) вытесняются из цитозоля в матрицу ретикулума против очень высокого градиента концентрации.
Этот транспорт происходит антипортическим способом, потому что в то же время два H + они направлены на цитозоль из матрицы.
Рабочий механизм
Насосы SERCA
Транспортный механизм делится на два состояния E1 и E2. В сайтах связывания E1, которые имеют высокое сродство к Ca 2+ они направлены на цитозоль. В E2 сайты связывания направлены к просвету ретикулума с низким сродством к Ca 2+ . Два иона Са 2+ присоединиться после передачи.
Во время объединения и передачи ча 2+ , происходят конформационные изменения, включая открытие домена М белка, который направлен к цитозолю. Затем ионы легче присоединяются к двум сайтам связывания указанного домена.
Объединение двух ионов Са 2+ способствует серии структурных изменений в белке. Среди них вращение определенных доменов (домен A), который реорганизует узлы насоса, позволяя отверстию в направлении матрицы сетки высвобождать ионы, которые разъединены благодаря уменьшению сродства в сайтах связывания.
H протонов + и молекулы воды стабилизируют сайт связывания Са 2+ , приводя домен А к вращению обратно в исходное состояние, закрывая доступ к эндоплазматической сети.
Насосы PMCA
Этот тип насосов обнаружен во всех эукариотических клетках и отвечает за изгнание Са 2+ к внеклеточному пространству, чтобы поддерживать стабильную концентрацию внутри клеток.
В этом белке транспортируется ион Са 2+ гидролизованным АТФ. Транспорт регулируется уровнями белка кальмодулина в цитоплазме.
Увеличивая концентрацию Ca 2+ цитозольные, повышают уровни кальмодулина, которые связывают ионы кальция. Комплекс Ca 2+ -Затем Calmodulin собирается на место крепления насоса PMCA. В насосе происходит конформационное изменение, которое позволяет отверстию подвергаться воздействию внеклеточного пространства.
Ионы кальция высвобождаются, восстанавливая нормальные уровни внутри клетки. Следовательно, комплекс Ca 2+ -Кальмодулин разобрали, вернув конформацию насоса в исходное состояние.
Читайте также: