Му по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных

Методические указания по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных
(утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ от 30 июня 1999 г. N 13-7-2/643)

1. Общие положения

1.1. Лабораторные методы исследования на хламидийные инфекции животных включают:

- выявление специфических антител в сыворотке крови больных животных в РСК (РДСК) или ИФА;

- обнаружение хламидий и их антигенов в патологическом материале методом световой или люминесцентной микроскопии;

- выделение хламидий на куриных эмбрионах, в культуре клеток или лабораторных животных с последующей их идентификацией;

- выявление ДНК хламидий в патологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.2. В лабораторию для исследования на хламидийные инфекции направляют:

- сыворотку крови в количестве 3-5 куб. см от абортировавших или подозрительных по заболеванию животных, а также во всех случаях, предусмотренных действующей инструкцией. Кровь от абортировавших животных берут дважды: в период клинического проявления болезни и повторно, от них же, через 14-21 день. Сыворотки направляют в лабораторию в количестве 1-2 куб. см. Сыворотки хранят при температуре минус 20°С и исследуют одномоментно. Сыворотки гемолизированные или контаминированные бактериальной и грибковой флорой не пригодны;

- патологический материал (соскобы с конъюнктивы, гениталий, фекалии) берут только одноразовыми или стерильными инструментами в одноразовые пластиковые пробирки с крышками или в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками с физраствором в количестве 1 куб. см и доставляют в лабораторию в емкости со льдом в течение 24 часов. Хранить материал можно не более 7 суток при 4°С и 10-12 мес. при температуре минус 20°С;

- пробы эякулята или замороженной спермы, полученные от производителей, подозрительных по заболеванию. Пробы эякулята направляют для исследования в количестве 1 куб. см; замороженную сперму в количестве не менее 2 гранул доставляют в лабораторию в контейнере с жидким азотом или в пробирке с сухим льдом;

- патологический материал от павших или убитых больных животных (кусочки паренхиматозных органов, лимфатических узлов и семенников), от абортировавших животных (кусочки плаценты);

- абортированные плоды целиком или паренхиматозные органы и сычуг плода.

Патологический материал отбирают в стерильные, герметически закрывающиеся флаконы не позднее двух часов после гибели, убоя животного или аборта.

Флаконы с патматериалом помещают в термос со льдом, а абортированные плоды во влагонепроницаемую тару и в тот же день, но не позже 24 часов, доставляют в лабораторию с соблюдением мер, исключающих распространение возбудителя инфекции.

2. Серологические исследования

2.1. Серологические исследования на хламидийные инфекции основаны на выявлении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента (РДСК) и методом иммуноферментного анализа (ИФА); у абортировавших животных - на установлении нарастания титра антител в 4 и более раз.

Животных, вакцинированных против хламидийного аборта, серологически не исследуют в течение 1 года после вакцинации.

2.2. В РСК, РДСК используют следующие компоненты:

- комплементсвязывающий группоспецифический хламидийный антиген;

- позитивную (иммунную) сыворотку крови овец, содержащую группо-специфические хламидийные антитела;

- негативную (отрицательную) сыворотку крови овец;

- комплемент (свежая, консервированная или лиофильно высушенная сыворотка крови морской свинки);

- гемолизин (сыворотка крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана);

- физиологический раствор, рН 7,0-7,2.

Специфический и контрольный антигены, позитивную и негативную сыворотки изготавливают биофабрики, выпускающие их в специальных наборах.

Антиген разводят в дистиллированной воде и применяют в РСК, РДСК в рабочих титрах, указанных на этикетке.

2.3. Гемолизин в РСК и РДСК используют в удвоенном титре (например, при титре гемолизина 1:1000 его берут 2:1000).

2.4. Эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500-3000 об/мин. в течение 10-15 мин. до полной прозрачности над осад очной жидкости.

Для РСК применяют 2,5%-ную, для РДСК - 3%-ную взвесь эритроцитов из осадка.

Перед работой взвесь эритроцитов и гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах, полученную гемолитическую систему ставят в термостат при 37°С на 20-30 мин. для сенсибилизации. Во время работы гемолитическую систему хранят при комнатной температуре или в холодильнике при 2-4°С.

2.5. Для серологического исследования пригодны лишь свежие испытуемые сыворотки. Допускаются к исследованию и однократно замороженные, а также сыворотки, консервированные борной кислотой (2% к объему) или мертиолятом (1:10000).

Мутные, проросшие или гемолизированные сыворотки для исследования непригодны.

2.6. Физиологический раствор для разведения компонентов (0,85% раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде, рН 7,2-7,4) готовят и кипятят в течение 5 минут за день или в день постановки реакции.

2.7. Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

2.7.1. Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента). Комплемент титруют каждый раз перед постановкой главного опыта на позитивной и 1-2 испытуемых сыворотках.

Каждую сыворотку, разведенную 1:5 (1 куб. см сыворотки + 4 куб. см физиологического раствора) инактивируют при 58-60°С 30 мин, разливают по 0,2 куб. см в два ряда пробирок штатива Флоринского. Титрование комплемента начинают с дозы 0,02 куб. см до 0,2 куб. см с интервалом по 0,02 куб. см. Для этого в дополнительный ряд пробирок вносят разведенный 1:20 комплемент в десятикратном объеме в дозах 0,2; 0,4;0,6; и т.д. до 2,0 куб. см и добавляют в каждую пробирку недостающее до 2 куб. см количество физиологического раствора, т.е. 1,8; 1,6; 1,4; и т.д. Затем из первого разведения комплемента переносят по 0,2 куб. см в первые пробирки всех сывороток, из второго разведения соответственно во вторые и т.д. (это можно выполнять аппаратом Флоринского с мерными пипетками по 0,2 куб. см). Первые ряды пробирок с позитивной и испытуемыми сыворотками (взятыми из опыта) разливают специфический антиген в рабочем разведении в антигенные ряды по 0,2 куб. см, а во вторые ряды - по 0,2 куб. см физраствора. Пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 60 мин. при 37-38°С.

Затем во все пробирки разливают гемолитическую систему по 0,4 куб. см, встряхивают и ставят в водяную баню на 20 мин при 37-38°С (схему титрования комплемента см. в таблице 1).

Титром (единицей) комплемента считают наименьшую дозу его, которая дает полный гемолиз эритроцитов с испытуемыми сыворотками в пробирках первого и второго рядов и позитивной сывороткой - в пробирках второго ряда (без антигена).

В примере, приведенном в таблице 2, титр комплемента, разведенного 1:20, равен 0,1 куб. см, что и будет является его рабочей дозой.

Примечание : если в первом ряду пробирок с сыворотками из опыта получена ясно выраженная задержка гемолиза эритроцитов более, чем на два интервала по сравнению с безантигенным рядом, это значит, что испытуемые сыворотки содержат специфические к данному антигену антитела и, в таком случае, рабочую дозу комплемента определяют по безантигенным рядам позитивной и испытуемых сывороток.

Расчет количества чистого комплемента необходимого для постановки главного опыта, делают по формуле:

где А - рабочая доза комплемента;

В - количество пробирок, занятых в реакции;

С - основное разведение комплемента.

Пример : (0,1 х 100):20 = 0,5.

Количество разведенного комплемента, требуемое для всей реакции (в данном примере 100 пробирок), равно 20 куб. см (0,2 х 100), поэтому к 0,5 куб. см чистого комплемента следует добавить 19,5 куб. см физиологического раствора.

2.7.3. Главный опыт РСК. Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1:5 и 1:10 (доза сыворотки 0,04 куб. см и 0,02 куб. см со специфическим антигеном, в разведении 1:5 с контрольным антигеном (на специфичность) и без антигена (на антикомплементарность).

Испытуемые и контрольные сыворотки инактивируют в день постановки реакции в разведенном виде при 56-65 °С (в зависимости от вида животных) в течение 30 мин. (также в РДСК).

Оба этапа реакции проводят в водяной бане при 37-38°С, бактериолитическую систему выдерживают 60 мин, второй этап реакции (с гемолитической системой) - 20 мин.

Контроли главного опыта РСК:

- позитивная сыворотка в разведении 1:5 без антигена и с контрольным антигеном; в разведениях от 1:5 до ее титра со специфическим антигеном;

- негативная сыворотка в разведениях 1:5 и 1:10 со специфическим антигеном, в разведении 1:5 с контрольным антигеном и без антигена - антигены специфический и контрольный в двойной дозе - на антикомплементарность (комплемент +) и на гемотоксичность (комплемент -);

- гемолитическая система на гемотоксичность (комплемент -).

Схема постановки главного опыта представлена в таблице 3.

2.8. Постановка реакции длительного связывания комплемента (РДСК).

2.8.1. Первую фазу реакции проводят в холодильнике при 2-6°С в течение 16-18 час., вторую фазу в водяной бане 20 мин при 37-38°С.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:30 (при определении его рабочего разведения). Если рабочий титр комплемента неизвестен или вызывает сомнение, перед титрованием гемолитической системы для РДСК определяют его рабочее разведение по схеме, представленной в таблице 4.

2.8.2. Титрование гемолитической системы. Дозу гемолитической системы для главного опыта РДСК определяют путем титрования ее на 3-4 сыворотках: позитивной и 1-2 испытуемых из партии, поступившей на исследование.

Инактивированные сыворотки (позитивную и испытуемые) в разведении 1:5 разливают каждую в два ряда пробирок штатива Флоринского по 0,2 куб. см.

Затем в первые ряды пробирок каждой сыворотки вносят по 0,2 куб. см антигена в рабочем разведении, а во вторые ряды - 0,2 куб. см физиологического раствора; во все пробирки разливают по 0,2 куб. см комплемента в зависимости от его рабочего разведения, встряхивают и помещают в холодильник на 16-18 час. при температуре 2-6°С.

На следующий день штативы вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20-30 мин. при комнатной температуре.

Затем в первые пробирки с позитивной и испытуемыми сыворотками разливают гемолитическую систему (приготовленную согласно пунктам 2.3 и 2.4) по 0,1 куб. см, во вторые пробирки - по 0,2 куб. см, в третьи - по 0,3 куб. см и т.д. до 1 куб. см.

Пробирки встряхивают, ставят в водяную баню на 20 мин. при 37-38°С, после чего определяют титр гемолитической системы.

Схема титрования гемолитической системы представлена в таблице 5.

Титром гемолитической системы считают наибольшее ее количество, в котором получен полный гемолиз эритроцитов в обоих рядах пробирок с негативной и испытуемой сыворотками и в безантигенном ряду с позитивной сывороткой, при полной задержке гемолиза в ряду с позитивной сывороткой и антигеном. В приведенном примере (таблица 5) титр гемолитической системы равен 0,6 куб. см.

2.8.3. Главный опыт РДСК. В первый день одновременно с разливом сывороток для титрования гемолитической системы, разливают сыворотки и антиген для главного опыта, как указано в пункте 2.7.3.

Затем во все пробирки главного опыта и соответствующих контролей разливают комплемент по 0,2 куб. см в зависимости от его рабочего разведения, пробирки встряхивают и помещают в холодильник на 16-18 час. при 2-6°С.

На следующий день штативы с первой фазой вынимают из холодильника и после выдерживания в течение 20-30 мин. при комнатной температуре во все пробирки разливают гемолитическую систему в дозе, полученной при титровании (в приведенном примере - 0,6 куб. см). Штативы встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин. при 37-38°С.

Схема главного опыта РДСК представлена в таблице 6.

2.9. При массовых постановках РДСК испытуемые сыворотки исследуют только со специфическим антигеном в разведении сыворотки 1:5 (0,05 куб. см сыворотки + 0,2 куб. см физиологического раствора), с последующей перестановкой сомнительно и положительно реагирующих проб, как указано в п. 2.7 и 2.8.

- при работе с аппаратом Флоринского для разведения сыворотки 1:5 к 0,05 куб. см сыворотки добавлять 0,2 куб. см физраствора;

- перед разливом компонентов в РСК и РДСК - смешивание равных объемов антигена и комплемента в рабочих разведениях.

2.10. Учет результатов РСК, РДСК проводят дважды: первый раз - сразу после водяной бани, второй - после оседания эритроцитов на дно пробирки (через 3-4 часа после водяной бани) или на следующий день при хранении в холодильнике от 2° до 6°С.

Для объективного определения результатов реакции оценку рекомендуется проводить в процентах гемолиза. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным (100%) гемолизом и жидкость из них сливают в одну пробирку. Из нее готовят разведения с меньшим процентом гемолиза по следующей схеме:

Постановка окончательного диагноза на инфекционные болезни невозможна без обнаружения ее возбудителя.

Лабораторная диагностика хламидиоза

сыворотку крови в количестве 3-5 см3 от абортировавших или подозрительных по заболеванию животных, а также во всех случаях, предусмотренных действующей инструкцией. Кровь от абортировавших животных берут дважды: в период клинического проявления болезни и повторно, от них же, через 14-21 день. Сыворотки направляют в лабораторию в количестве 1-2 см3;
патологический материал (соскобы с конъюнктивы, гениталий, фекалии берут только одноразовыми или стерильными инструментами в одноразовые пластиковые пробирки с крышками или в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками с физраствором в количестве 1 см3 и доставляют в лабораторию в емкости со льдом в течение 24 часов. Хранить материал можно не более 7 суток при 4 оС и 10-12 мес при температуре минус 20 оС;
пробы эякулята или замороженной спермы, полученные от производителей, подозрительных по заболеванию. Пробы эякулята направляют для исследования в количестве 1 см3; замороженную сперму в количестве не менее 2 гранул доставляют в лабораторию в контейнере с жидким азотом или в пробирке с сухим льдом;
патологический материал от павших или убитых больных животных (кусочки паренхиматозных органов, лимфатических узлов и семенников), от абортировавших животных (кусочки плаценты);
абортированные плоды целиком или паренхиматозные органы и сычуг плода.

Данные о существующих методах диагностики хламидиозов, используемом материале и продолжительности исследования приведены в таблице.

Методы лабораторной диагностики хламидиозов

метод материал для исследования срок исследования диагноз выявление специфических антител в РСК (РДСК), ИФА сыворотка крови от 1 до 5 дней предварительный, необходимо повторное исследование животного прямым методом световая микроскопия мазки или мазки отпечатки из патологического материала окрашенные по Романовскому-Гимзе от 30 мин до 2 час предварительный люминесцентная микроскопия, прямая и непрямая иммунофлюоресценция мазки с конъюнктивы и гениталий около 40 мин окончательный выделение хламидий на куриных эмбрионах, в культуре клеток или лабораторных животных и последующая их идентификация пробы спермы, влагалищной слизи, соскобы со слизистых, суспензия паренхиматозных органов от 7 до 30 дней окончательный выявление ДНК хламидий методом ПЦР соскобы с конъюнктивы, урогенитального тракта, моча, паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных, кусочки плодовых оболочек и паренхиматозных органов абортированых плодов от 4 до 5 час окончательный

Диагноз на хламидийные инфекции считают предварительным при выявлении специфических антител в сыворотке крови в РСК (РДСК) или ИФА. Диагноз на хламидийные инфекции считают окончательным при применении любого прямого метода диагностики, который выявляет хламидии, антигены хламидий или ДНК хламидий в исследуемом материале.
Не рекомендуем применять световую микроскопия хламидиоза в связи с высоким процентом ложноположительных результатов, причиной которых является наличие другой микрофлоры. Эта методика обладает недостаточной специфичностью, особенно в случаях малой распространенности возбудителя в слизистых.

быстрота – вся диагностическая процедура с использованием моноклональных антител в среднем от момента забора материала до постановки диагноза занимает не более 40 мин.;
возможность интерпретации результатов на основе регистрации элементарных и ретикулярных телец, расположенных внутри- и внеклеточно при сохранении высокой степени чувствительности и специфичности;
относительная проста техники проведения анализа.

Однако этот метод дает в ряде случаев ложноотрицательные результаты, связанные с неправильной техникой забора образцов для исследования и с диагностикой хронических и вялотекущих форм хламидиоза, когда возбудитель, прячась от антител и антибиотиков уходит в подслизистый слой, где вокруг него начинает формироваться воспалительный вал из нейтрофилов и возбудитель оказывается внутри инкапсулированного пространства.

Отбор материала – один из самых ответственных этапов диагностики хламидиоза. Правильный отбор материала - это задача ветеринарного врача в клинике, а дальнейшая обработка материала осуществляется в лаборатории. Мазки готовят непосредственно после взятия материала с конъюнктивы и гениталий животных, используя одноразовый зонд, имеющий ватный тампон с повышенной адсорбцией. Материал отбирают вращательным движением тампона и переносят в лунку предметного стекла. Предметное стекло заранее маркируют. Приготовленный мазок высушивают на воздухе. Высушенный мазок фиксируют в 96% этаноле в течение 5 минут или наносят на мазок 2-3 капли ацетона до полного его испарения. Фиксированный препарат может храниться при температуре 18-20 градусов С в течение 5 суток.

Ложноположительные результаты возможны при наличии в образце нежизнеспособных возбудителей или их антигенных структур, а также других бактерий, имеющих перекрестно-реагирующие антигены с антигенами хламидий. Следующей причиной, которая может привести к ошибке, является наличие острого воспалительного процесса на слизистой, когда за счет большого количества лейкоцитов и белка ИФА дает ложноположительные результаты.

Сегодня одним из наиболее перспективных подходов к прямой диагностике инфекций считают специфическую амплификацию нуклеиновых кислот in vitro и, в частности, наиболее разработанный вариант такой амплификации – метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий в пробирке всего за несколько часов произвести изолированное умножение (амплификацию) любого гена или его фрагмента во много миллионов раз (Обухов И.Л. и др., 1996).

ПЦР, являясь самым чувствительным на сегодняшний день методом прямого обнаружения хламидий, не требует иммунологического ответа на проникновение возбудителя в организм хозяина, что дает возможность следить за ранними стадиями развития инфекции.

Для выявления патогенных микроорганизмов методом ПЦР не требуется их размножения, следовательно, так можно диагностировать инфекцию в латентной стадии. Необходимо также отметить простоту отбора материала для проведения ПЦР-диагностики на хламидиоз, т.к. можно достоверно судить об инфицированности животного по исследованию соскобов с конъюнктивы или слизистых урогенитального тракта. Клинический материал для ПЦР отбирают в пробирки с буферным раствором.

На сегодняшний день производятся тест-системы для выявления хламидий методом ПЦР, которые обладают 100% специфичностью и чувствительностью 10 копий ДНК на 1 мл образца (Обухов И.Л., 1994). Таким образом, ПЦР превосходит все биохимические и иммуноферментные методы лабораторной диагностики инфекций, в частности хламидиоза, т.к. позволяет определять единичные копии инфекционного возбудителя в исследуемом образце клинического материала.

Высокая чувствительность ПЦР становится недостатком, когда при исследовании животных после курса лечения появляются ложноположительные результаты в связи с невозможностью оценить жизнеспособность и патогенность клетки только на основании выявления фрагмента ее генома.

В связи с вышеизложенным, рекомендуем для лабораторной диагностики хламидиозов отбирать материал и направлять его для исследования, используя ИФА + ПЦР, а для контроля результатов лечения после курса терапии – ИФА.

УТВЕРЖДАЮ Заместитель руководителя Департамента ветеринарии В.В.Селиверстов 30 июня 1999 г. N 13-7-2/643

1. Общие положения

1.1. Лабораторные методы исследования на хламидийные инфекции животных включают:

- выявление специфических антител в сыворотке крови больных животных в РСК (РДСК) или ИФА;

- обнаружение хламидий и их антигенов в патологическом материале методом световой или люминесцентной микроскопии;

- выделение хламидий на куриных эмбрионах в культуре клеток или лабораторных животных с последующей их идентификацией;

- выявление ДНК хламидий в патологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.2. В лабораторию для исследования на хламидийные инфекции направляют:

- сыворотку крови в количестве 3-5 см от абортировавших или подозрительных по заболеванию животных, а также во всех случаях, предусмотренных действующей инструкцией. Кровь от абортировавших животных берут дважды: в период клинического проявления болезни и повторно, от них же, через 14-21 день. Сыворотки направляют в лабораторию в количестве 1-2 см . Сыворотки хранят при температуре минус 20°С и исследуют одномоментно. Сыворотки гемолизированные или контаминированные бактериальной и грибковой флорой непригодны;

- патологический материал (соскобы с конъюнктивы, гениталий, фекалии) берут только одноразовыми или стерильными инструментами в одноразовые пластиковые пробирки с крышками или в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками с физраствором в количестве 1 см и доставляют в лабораторию в емкости со льдом в течение 24 часов. Хранить материал можно не более 7 суток при 4°С и 10-12 мес при температуре минус 20°С;

- пробы эякулята или замороженной спермы, полученные от производителей, подозрительных по заболеванию. Пробы эякулята направляют для исследования в количестве 1 см ; замороженную сперму в количестве не менее 2 гранул доставляют в лабораторию в контейнере с жидким азотом или в пробирке с сухим льдом;

- патологический материал от павших или убитых больных животных (кусочки паренхиматозных органов, лимфатических узлов и семенников), от абортировавших животных (кусочки плаценты);

- абортированные плоды целиком или паренхиматозные органы и сычуг плода.

Патологический материал отбирают в стерильные, герметически закрывающиеся флаконы не позднее двух часов после гибели, убоя животного или аборта.

Флаконы с патматериалом помещают в термос со льдом, а абортированные плоды во влагонепроницаемую тару и в тот же день, но не позже 24 часов, доставляют в лабораторию с соблюдением мер, исключающих распространение возбудителя инфекции.

2. Серологические исследования

2.1. Серологические исследования на хламидийные инфекции основаны на выявлении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента (РДСК) и методом иммуноферментного анализа (ИФА), у абортировавших животных - на установлении нарастания титра антител в 4 и более раз.

Животных, вакцинированных против хламидийного аборта, серологически не исследуют в течение 1 года после вакцинации.

2.2. В РСК, РДСК используют следующие компоненты:

- комплементсвязывающий группоспецифический хламидийный антиген;

- контрольный антиген;

- позитивную (иммунную) сыворотку крови овец, содержащую группоспецифические хламидийные антитела;

- негативную (отрицательную) сыворотку крови овец;

- комплемент (свежая, консервированная или лиофильно высушенная сыворотка крови морской свинки);

- гемолизин (сыворотка крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана);

- эритроциты барана;

- испытуемые сыворотки;

- физиологический раствор, рН 7,0-7,2.

Специфический и контрольный антигены, позитивную и негативную сыворотки изготавливают биофабрики, выпускающие их в специальных наборах.

Антиген разводят в дистиллированной воде и применяют в РСК, РДСК в рабочих титрах, указанных на этикетке.

2.3. Гемолизин в РСК и РДСК используют в удвоенном титре (например, при титре гемолизина 1:1000 его берут 2:1000).

2.4. Эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500-3000 об./мин в течение 10-15 мин до полной прозрачности надосадочной жидкости.

Для РСК применяют 2,5%-ную, для РДСК - 3%-ную взвесь эритроцитов из осадка.

Перед работой взвесь эритроцитов и гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах, полученную гемолитическую систему ставят в термостат при 37°С на 20-30 мин для сенсибилизации. Во время работы гемолитическую систему хранят при комнатной температуре или в холодильнике при 2-4°С.

Мутные, проросшие или гемолизированные сыворотки для исследования непригодны.

2.7. Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

2.7.1. Реакцию ставят в объеме 1 см (по 0,2 см каждого компонента).

Комплемент титруют каждый раз перед постановкой главного опыта на позитивной и 1-2 испытуемых сыворотках.

2.7.2. Титрование комплемента. Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором до первоначального объема, указанного на этикетке, и готовят основное разведение 1:20.

Каждую сыворотку, разведенную 1:5 (1 см сыворотки + 4 см физиологического раствора) инактивируют при 58-60°С 30 мин, разливают по 0,2 см в два ряда пробирок штатива Флоринского. Титрование комплемента начинают с дозы 0,02 см до 0,2 см с интервалом по 0,02 см . Для этого в дополнительный ряд пробирок вносят разведенный 1:20 комплемент в десятикратном объеме в дозах 0,2; 0,4; 0,6 и т.д. до 2,0 см и добавляют в каждую пробирку недостающее до 2 см количество физиологического раствора, т.е. 1,8; 1,6; 1,4 и т.д. Затем из первого разведения комплемента переносят по 0,2 см в первые пробирки всех сывороток, из второго разведения соответственно во вторые и т.д. (это можно выполнять аппаратом Флоринского с мерными пипетками по 0,2 см ).

Первые ряды пробирок с позитивной и испытуемыми сыворотками (взятыми из опыта) разливают специфический антиген в рабочем разведении в антигенные ряды по 0,2 см , а во вторые ряды - по 0,2 см физраствора. Пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 60 мин при 37-38°С.

Затем во все пробирки разливают гемолитическую систему по 0,4 см , встряхивают и ставят в водяную баню на 20 мин при 37-38°С (схему титрования комплемента см. в таблице 1).

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (ПО ПЕРВОМУ РЯДУ ПРОБИРОК)

Диагностика хламидиоза базируется на проведении комплексных исследований и наблюдений. При постановке диагноза учитывают эпизоотологические данные, клиническую, патологоанатомическую картину, результаты гистологических исследований. Решающее значение имеет лабораторная диагностика болезни.

Диагностика хламидиоза включает:

Микроскопический метод- обнаружение хламидий в исследуемом материале с помощью световой и люминесцентной микроскопии (флуорохромированием и иммунофлуоресценцией);

Метод выделения и культивирования хламидийна куриных эмбрионах, культуре клеток, в организме восприимчивых животных с последующей идентификацией возбудителя;

Серологический метод- выявление нарастания титра антител в парных пробах сыворотки больных или переболевших животных в: РСК (реакция связывания комплемента), РДСК (реакция длительного связывания комплемента), РНСК (реакция непрямого связывания комплемента), РНГА (реакция непрямой гемагглютинации), ИФА (иммуноферментный анализ);

Молекулярно-генетический методидентификации хламидий – ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Диагностика микроскопическим, серологическим и молекулярно-генетическим методами проводится согласно инструкциям по применению соответствующих диагностикумов и тест-систем.

Материал для исследования.

От больных и подозрительных по заболеванию животных берут фекалии, соскобы с конъюнктивы, гениталий, используя при этом стерильные инструменты, посуду или упаковочную тару. Исследуемый материал вносят в стерильные пробирки с физиологическим раствором в количестве 1 мл. Пробирки помещают в сосуд со льдом и направляют нарочным в лабораторию. Материал должен быть доставлен в лабораторию в течение 24 часов.

От подозрительных по заболеванию и абортировавших животных берут кровь дважды: первый раз в период клинического проявления болезни, второй – спустя 14 - 21 день после первого взятия с целью получения сыворотки. Сыворотку крови получают по общепринятой методике, и в количестве 1 - 2 мл направляют в лабораторию, где её хранят при - 20С. Сыворотку, полученную от первого и второго взятия крови, исследуют одномоментно. Гемолизированная, проросшая сыворотка исследованию не подлежит.

От абортировавших маток направляют в лабораторию кусочки плаценты, влагалищную слизь. Абортированные плоды можно отсылать целиком или же их паренхиматозные органы и желудок.

От павших или вынужденно убитых животных посылают кусочки паренхиматозных органов, семенников, головной мозг, пораженные суставы. Материал для исследования отбирают не позднее 2 часов после гибели, аборта или вынужденного убоя животных.

Пробы эякулята или сперму в количестве 1 мл доставляют в лабораторию в пробирках с сухим льдом или в контейнере с жидким азотом.

Доставку исследуемого материала в лабораторию осуществляют с соблюдением правил, исключающих распространение возбудителя болезни.

Световая микроскопия.Из исследуемого материала готовят препараты-отпечатки или препараты-мазки. Препараты окрашивают по Стемпу, Маккиавелло, Романовскому-Гимзе, по Маккиавелло в модификации Здродовского, по модифицированному методу Гименеж (см. приложение 1). В препаратах хламидии, располагаются отдельно или скоплениями внутри и вне клеток. При окраске по Стемпу хламидии ярко-красные, цитоплазма клеток бледно-зеленая, ядра клеток окрашены в бледно-зеленый цвет несколько интенсивнее, чем цитоплазма. При окраске по Маккиавелло хламидии приобретают рубиново-красный цвет, цитоплазма клеток – светло-синяя, ядра – темно-синие, а по Романовскому-Гимзе – возбудитель хламидиоза окрашивается в темно-фиолетовый цвет, цитоплазма клеток фиолетово-голубая, ядра сине-фиолетовые.

Успех микроскопического исследования во многом зависит от качества приготовленных препаратов, возможностей и технического состояния светового микроскопа и опыта бактериолога. Для работы необходимо использовать микроскопы с высоким разрешением (0,14 – 0,2 мкм) и общим увеличением в 1350 – 2000 раз.

Люминесцентная микроскопия. Для индикации хламидий в исследуемом материале используют метод флуорохромирования. Техника окраски: препараты (мазки) фиксируют жидкостью Корнуа в течение 5 мин; двукратно отмывают фосфатно-цитратным буфером по 2 — 4 мин; наносят рабочий раствор акридинового оранжевого на 10 — 20 мин; трижды отмывают фосфатно-цитратным буфером по 2 мин и больше; заключают в этот буфер, прикрепляя покровное стекло парафином.

Исследуют в люминесцентном микроскопе (лучше в падающем свете) с комбинацией фильтров СЗС, БС, ФС.

Элементарные тельца хламидий флуоресцируют ярко-зеленым светом, их промежуточные формы — от соломенно-темного до оранжевого свечения. Подобные структуры обнаруживают, как внутри, так и вне клеток.

Метод дает хорошие результаты при исследовании мазков из патологического материала, особенно плодовых оболочек абортировавших животных (см. приложение 2).

Идентификация хламидий проводится с помощью реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Используют прямой и непрямой варианты.

Для приготовления препаратов используют стекла с матовой площадкой у края и надписи ведут простым карандашом.

Прямой метод иммунофлуоресценции. Фиксированные холодным ацетоном препараты после промывания ФСБР обрабатывают синькой Эванса 30-40 с, промывают водопроводной водой.

При отсутствии синьки Эванса препараты обрабатывают смесью в равных объемах, состоящей из флуоресцирующей хламидийной сыворотки (содержит антитела против хламидий, меченые ФИТЦ) и бычьего альбумина, меченного родамином, взятого в удвоенном титре.

В случае применения синьки Эванса препараты обрабатывают только меченой флуоресцирующей хламидийной сывороткой (в термостате при +37°С в течение 30-40 мин во влажной камере). Тщательно промывают ФСБР, наносят каплю забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом, исследуют под люминесцентным микроскопом.

Непрямой вариант реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Готовят следующие растворы: фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) —6,8 г NаС1, 0,63 г КН₂РО₄ и 1,48 г Nа₂НРО₄ последовательно растворяют в 1 л дистиллированной воды рН 7,2; забуференный глицерин - смешивают одну часть ФСБР с девятью частями глицерина; раствор синьки Эванса: 1 г синьки растворяют в 100 мл дистиллированной воды во флаконе из темного стекла. Для приготовления рабочего раствора красителя (1: 10000) берут 0,1 мл раствора 1: 100 и объем доводят дистиллированной водой до 10 мл.

Техника окраски: мазки из патологического материала, инфицированных клеточных культур и т. п. фиксируют ацетоном на холоде в течение 5—10 мин, промывают ФСБР и подсушивают на воздухе. Для устранения неспецифической люминесценции фона на мазки на 30- 40 с наносят рабочий раствор синьки Эванса (1 : 10000), которую смывают слабой струей водопроводной воды. Наносят на каждый препарат 1-2 капли кроличьей (или другого вида животного) иммунной антихламидийной сыворотки, содержащей обычные немеченные антитела против хламидий в титре не ниже 1:32-1:64. Препарат помещают во влажную камеру и помещают в термостат при температуре - 37°С на 30-40 мин.

Затем тщательно промывают ФСБР три раза по 5—10 мин; на препараты наносят антивидовую (содержащую меченые ФИТЦ антитела против глобулинов того вида животного, с использованием которого получена первая иммунная сыворотка) сыворотку, выдерживают в термостате при температуре +37°С во влажной камере 30-40 минут. Тщательно промывают ФСБР. На каждый препарат наносят по капле забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом, которое прикрепляют расплавленным парафином. Препараты исследуют под люминесцентным микроскопом в падающем свете при комбинации светофильтров ФС 1-2, БС-8-2, СЗС 7-2 и запирающем ЖС 18, объектив иммерсионный.

Препараты, обработанные синькой Эванса, в ультрафиолетовых или сине-фиолетовых лучах, имеют красный фон разных оттенков, тогда как элементарные тельца хламидий, их колонии (включения) флуоресцируют зеленым изумрудным светом.

При отсутствии синьки Эванса можно использовать для контрастирования фона бычий альбумин, меченный родамином, который в удвоенном титре смешивают с первой сывороткой 1:1.

Бычий альбумин уступает синьке Эванса в том смысле, что каждый раз дополнительно необходимо определять его рабочую дозу методом титрации.

Фон препаратов, обработанных меченым бычьим альбумином, оранжевый, хламидийные структуры — изумрудно-зеленые.

Контроли: первый тест блокировки — после обработки препарата обычной иммунной (немеченой) хламидийной антисывороткой, флуоресцирующая хламидийная сыворотка не должна вызвать свечения хламидиозного антигена (элементарных телец, промежуточных форм хламидий или их включений);

второй тест нейтрализации — после инкубации со специфическим (хламидийным) антигеном, флуоресцирующая хламидийная сыворотка не должна давать заметного окрашивания хламидийного антигена;

третий — нормальная, не иммунная меченная ФИТЦ сыворотка того же вида животного, продуцента иммунной хламидийной антисыворотки, не должна окрашивать хламидийный антиген;

четвертый — в контрольных препаратах, приготовленных из тканей заведомо здоровых животных, флуоресцирующая хламидийная антисыворотка не должна окрашивать цитоплазму клеток.

Метод выделения и культивирования хламидий.

Выделение хламидий из исследуемого материала проводят на куриных эмбрионах, культуре клеток. Чаще всего для выделения хламидий используют заражение куриных эмбрионов суспензией исследуемого материала.

Исследуемый материал (пробы паренхиматозных органов, лимфоузлов и других тканевых материалов) нарезают мелкими кусочками в стерильную фарфоровую ступку, используя стерильные инструменты. В ступку добавляют стерильный песок и растирают пестиком до получения однородной кашицы. Затем, путем добавления физиологического раствора получают 10 - 20% -ную суспензию. Для удаления грубых частиц суспензию фильтруют, фильтрат центрифугируют при 2 - 3 тыс. об/мин. в течение 25 - 30 минут. Надосадочную жидкость обрабатывают пенициллином из расчета 100 ЕД/мл, стрептомицином 500 ЕД/мл и гентамицином 150 мкг/мл.

Пробы спермы, эякулята, влагалищной слизи используют в неразведенном виде или разводят 1:2 физраствором и обрабатывают антибиотиками. Надосадочную жидкость, пробы спермы, эякулята, влагалищной слизи высевают на МПБ, МПА, среду Китта-Тароцци и выдерживают посевы в термостате 48-72 часа для исключения бактериального загрязнения. При отсутствии роста микрофлоры на питательных средах материал используют для заражения куриных эмбрионов.

Куриные эмбрионы заражают в желточный мешок или хорион-аллантоисную оболочку, Яйца должны быть получены от кур, в рацион которых не добавляли антибиотики. Оптимальный возраст эмбрионов для заражения 6-7 суток. Доза для заражения составляет 0,2 - 0,5 мл исследуемого материала. Эмбрионы инкубируют в термостате при 37С и овоскопируют ежедневно. Гибель эмбрионов в 1-ые двое суток считают неспецифической. Специфическая гибель их начинается на 3 - 4-ые сутки и может регистрироваться до 10 - 12-ого дня.

При отсутствии специфической гибели эмбрионы на 12-й день вскрывают и проводят пассаж по описанной выше методике. Рекомендуется проводить не менее трех последовательных пассажей, используя при этом центрифугат 10 - 15% суспензии желточных мешков.

Погибшие эмбрионы вскрывают, желточные мешки отбирают и готовят из них препараты-отпечатки. Аллантоисную жидкость проверяют на стерильность путем высева на обычные питательные среды.

Препараты окрашивают и микроскопируют. Результат считают положительным в случае обнаружения хламидий в препаратах, приготовленных из желточных мешков куриных эмбрионов любого из 3-х пассажей.

Хламидии из исследуемого материала можно выделять путем внутрибрюшинного, интраназального, интрацеребрального, интраторакального заражения морских свинок. Наиболее приемлемым является внутрибрюшинный способ заражения в дозе 0,5 мл 10%-ной суспензией паренхиматозных органов, приготовленной по методике описанной выше (как для заражения куриных эмбрионов).

Лабораторные животные гибнут на 5 - 10 сутки после заражения. В случае выживания животных, их убивают, из паренхиматозных органов делают 10%-ную суспензию, которой заражают новую партию морских свинок. Необходимо провести не менее 3-х последовательных пассажей, как и на куриных эмбрионах.

Результат исследования считают положительным при обнаружении хламидий в препаратах-отпечатках из органов павших лабораторных животных в любом из 3-х последовательных пассажей с помощью световой и люминесцентной микроскопии.

Для культивирования хламидий используют первичные и перевиваемые культуры клеток (McCoy, L-929, HeLa). Заражение культуры клеток проводят материалом, полученным соскобом со слизистых оболочек или суспензией из паренхиматозных органов. Исследуемый материал помещают во флаконы со стеклянными бусами, содержащими: 2 мл среды 199 с 5% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 45% 0,5М раствора глюкозы. Для подавления бактериальной микрофлоры в исследуемый материал добавляют стрептомицин (200 мкг/мл), канамицин (100 мкг/мл), нистатин (25 мкг/мл). Экспозиция с антибиотиками составляет от 3 до 18 часов, при температуре 4С, после чего материал вносят по 0,3 мл в пробирки с монослоем клеток. На каждую пробу используют не менее 4-х пробирок с культурой клеток. Одновременно ставят контроли:

контроль монослоя в норме;

контроль монослоя, инфицированного эталонным штаммом;

контроль монослоя, зараженного экстрактом ткани аналогичной исследуемому материалу, но не содержащей хламидий.

Культуры клеток ежедневно микроскопируют с целью обнаружения цитопатического действия (ЦПД).

Хламидии имеют групповой термостабильный антиген, который выявляют в серологических реакциях: РСК, РДСК, РНСК, РНГА, ИФА. Наибольшее применение в практике получила РДСК, основанная на выявлении специфических антител в сыворотке крови абортировавших животных (нарастание титра в 2 и более раза). Абортировавших свиноматок исследуют дважды. Кровь от свиноматок берут в день аборта и спустя 21 день после него. С помощью РСК проводят массовое обследование поголовья, что позволяет выявлять бактерионосителей и оценивать эпизоотическую ситуацию в хозяйстве. Наличие комплементсвязывающих антител к хламидийному антигену в низких титрах – показатель инфицированности животных.

В случае нарастания титра антител при исследовании в РНСК парных проб сывороток в два и более раза диагноз считается установленным серологическим методом.

Иммуноферментный анализприменяют для ретроспективной диагностики хламидиоза. Используют твердофазный метод в направлении идентификации антигена и антител.

Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным вызывать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.

Интерпретация результатов ИФА.

Основанием для постановки предварительного диагноза на хламидиоз является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-4 раза. При этом учитывается эпизоотическая ситуация в хозяйстве, наличие клинических и патологоанатомических признаков заболевания.

Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному исследованию и при подтверждении первоначального результата считаются положительными.

Животных, с сыворотками крови которых получены положительные и сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диагностики для постановки окончательного диагноза.

Метод предназначен для выявления ДНК хламидий с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в патологическом материале от животных.

Суть ПЦР заключается в амплификации, т.е. увеличении числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК или РНК (праймеров) искомого агента invitroс последующей индикацией амплификона (амплифицируемый участок ДНК) методом электрофореза или другим методом.

ПЦР позволяет идентифицировать возбудитель в количестве 1 бакт. клетки в пробе, специфичность 100%.

Идентифицируют хламидии и их антигены методами световой и люминесцентной микроскопии (РИФ), в РДСК, РНСК, РНГА, ИФА или с помощью ПЦР.

Диагноз на хламидиоз считают установленным в одном из следующих случаев:

1. При выделении возбудителя из исследуемого материала и его идентификации;

2. При получении нарастания титра антител в парных пробах сыворотки крови больных или переболевших животных в РДСК, РНСК, РНГА, ИФА в два и более раз;

3. При выявлении ДНК хламидий в ПЦР.

При диагностике хламидиоза предусмотрены следующие сроки исследований:

выявление специфических антител – от 1 до 5 дней;

световая микроскопия – от 30 минут до 2 часов;

люминесцентная микроскопия – до 3 часов;

выделение и идентификация хламидий – от 7 до 40 дней;

выявление ДНК хламидий - от 4 часов до 2 суток.

Читайте также: