Набор для пцр на вич

Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.

Что предлагает ВОЗ

Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.

Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.

Как работает ПЦР-тест

Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.

Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.

В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.

Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.

Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.

Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.

Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.

Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.

На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.

По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.

Новые разработки за рубежом

Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.

Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.

Еще более оперативный тест на COVID-19 разработали в Великобритании. Он позволяет выявить COVID-19 всего за 30 минут. Чтобы провести его, достаточно портативного оборудования стоимостью около $120 и набора полосок для мазков из носа и горла по $5 каждая. Одновременно проходить тест могут до шести человек.

FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.

Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.

Quantitative Detection of Human Immunodeficiency Virus type 1 RNA (PCR)

Информация об исследовании

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) – это возбудитель хронической системной вирусной инфекции (ВИЧ-инфекции). Его относят к семейству ретровирусов, или Retroviridae. Вирусная частица представляет собой генетический материал (РНК), упакованный в белковую капсулу – капсид вируса, которая в свою очередь покрыта вирусной оболочкой, или суперкапсидом. На сегодняшний день известны два типа вируса – ВИЧ-1 и ВИЧ-2. ВИЧ-2 распространен преимущественно в западноафриканских странах.

ВИЧ-инфекция – медленно прогрессирующее заболевание, при котором происходит поражение иммунной системы с развитием синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа). СПИД – это терминальная стадия развития ВИЧ-инфекции, которая сопровождается широким спектром вторичных (оппортунистических) заболеваний. При СПИДе оппортунистические инфекции поражают все органы и системы ВИЧ-инфицированных.

Вирус проникает в клетки, на поверхности которых представлен рецептор CD4 (кластер дифференцировки 4) – трансмембранная гликопротеиновая молекула. Такой рецептор есть только у одного типа клеток – Т-хелперов. Это популяция белых клеток крови (Т-лимфоцитов), которая играет ключевую роль в поддержании необходимого уровня адаптивного иммунного ответа, то есть реакции организма на чужеродные агенты. Это приводит к нарушению функции иммунной системы у ВИЧ-инфицированных.

Вакцины, предотвращающей заражение ВИЧ-инфекцией, не существует. Однако разработаны препараты для антиретровирусной терапии, которая позволяет остановить развитие ВИЧ-инфекции и предотвратить иммунодефицитное состояние.

Для принятия решения о назначении антиретровирусной терапии или для изменения схемы терапии крайне важны два показателя: уровень CD4+ клеток и вирусная нагрузка (количественная концентрация вирусных частиц в крови). Оценить вирусную нагрузку позволяет количественное ПЦР-исследование плазмы крови на наличие РНК возбудителя ВИЧ-инфекции.

Анонимный анализ на ВИЧ

Согласно п.2, ст.8 ФЗ РФ № 38-ФЗ, пациент может анонимно сдать анализ на ВИЧ и получить результат по индивидуальному номеру заказа, не подлежащему разглашению. Тем, кто по каким-либо причинам не имеет возможности приехать на обследование в одно из отделений Лаборатории Гемотест, мы рекомендуем воспользоваться услугой по выезду медсестры для взятия крови с последующей регистрацией взятой пробы как анонимного заказа.

Обращаем Ваше внимание: результаты анонимных анализов на СПИД (ВИЧ) не могут быть использованы для профессиональных осмотров, госпитализации или предоставления лечащему врачу в поликлинике.

Результаты исследования на ВИЧ независимо от их результата выдаются только при личном обращении пациента в лабораторное отделение. При обследовании несовершеннолетних (до 14 лет) детей - законному представителю, указанному в заказе.

Результаты выдаются при предъявлении договора, сметы и документа, удостоверяющего личность самого пациента или представителя пациента, указанного в заказе.

По телефону и электронной почте результаты исследований не сообщаются.

ЕСЛИ АНАЛИЗ НА ВИЧ НАЗНАЧЕН В ЦЕЛЯХ ПОДГОТОВКИ К ГОСПИТАЛИЗАЦИИ ИЛИ ДЛЯ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ В ЛПУ, РЕГИСТРАЦИЯ ЗАЯВОК НА ЕГО ПРОВЕДЕНИЕ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ при обязательном предоставлении пациентом следующих данных:

1) Для жителей Москвы и Московской области

• Фамилия, имя, отчество
• День, месяц и год рождения
• Сведения о регистрации
• Паспорт

2) Для жителей других регионов РФ и иностранных граждан дополнительно – ксерокопию (скан) паспорта.

• Фамилия, имя, отчество
• День, месяц и год рождения
• Сведения о регистрации
• Ксерокопия (скан) паспорта

Сколько делают анализы на ВИЧ?

Результаты теста ИФА можно получить через 1 рабочий день, но не ранее 1,5-3 месяцев с момента предполагаемого заражения, результат ПЦР-диагностики можно узнать уже через 10 дней с момента предполагаемого заражения. Срок исполнения теста по методу Real-Time ПЦР составляет 3 рабочих дней.

Первичный анализ на ВИЧ - ВИЧ (АТ и АГ к ВИЧ 1/2 скрининг) .

Показания к назначению исследования

• Прогнозирование течения заболевания у пациентов, инфицированных ВИЧ-1
• Оценка эффективности антиретровирусной терапии

Противопоказания и ограничения.

Абсолютных противопоказаний нет.

Подготовка к исследованию

Специальной подготовки не требуется. Необходимо соблюдать общие требования подготовки к исследованиям.

Материал для исследования.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Тест-система: Реал ВИЧ ПЦР Вектор-Бест (Россия)

Формат представления результатов, единицы измерения.

Методические рекомендации предназначены для специалистов медицинских учреждений, осуществляющих лабораторный мониторинг эффективности антиретровирусной терапии и аккредитованных для проведения генотипического исследования по определению лекарственной устойчивости ВИЧ.

Определение лекарственной устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам (АРВП) является важным дополнением в общей схеме противовирусной терапии, так как в большинстве случаев позволяет объяснить причину неэффективности терапии и назначить оптимальную комбинацию препаратов. Смена терапии без учета данных о развившейся устойчивости к используемым препаратам приводит к развитию перекрестной резистентности ВИЧ к большинству известных лекарств, что создает огромную проблему в выборе эффективной схемы лечения Для определения лекарственной устойчивости ВИЧ наибольшее распространение получили молекулярные тесты, основанные на секвенировании ДНК. Секвенирование ДНК позволяет получить информацию обо всех нуклеотидных заменах в выбранном фрагменте генома ВИЧ, в том числе о мутациях, вызывающих устойчивость к АРВП. Поскольку основными АРВП для лечения ВИЧ-инфекции являются ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы, то появление мутаций именно в этих генах приводит к развитию лекарственной устойчивости.

Основным недостатком генотипического подхода (в частности, секвенирования ДНК) является сложная интерпретация результатов. Решением этой проблемы стала разработка программ, которые позволяют сопоставлять данные нуклеотидной последовательности вируса, полученного от пациента, с международной базой данных генотипов и фенотипов. С помощью таких программ можно количественно оценить вклад каждой выявленной мутации, а также возможные влияния одних мутаций на другие. Такое усовершенствование генотипического подхода называют виртуальным фенотипированием. Мутации включены в алгоритм виртуально фенотипирования на основании:

1. Данных FDA.
2. Рекомендаций Международного общества США по СПИДу.
3. Рекомендаций Объединенной группы по устойчивости.
4. Базы данных Стэнфордского университета (http://hivdb.stanford.edu/).

Показания к применению охватывают следующие группы:

1. ВИЧ-инфицированные при неэффективности АРВ терапии, если нет других явных причин неэффективности терапии (нарушение приема АРВ препаратов, нарушение всасывания препарата). Вирусологическими критериями неэффективности терапии являются:
   • отсутствие снижения концентрации РНК ВИЧ до недетектируемого уровня через 24 недели лечения, если не было перерыва в приеме препарата;
   • выявление РНК ВИЧ (в двух определениях с интервалом 1 месяц) после исходной супрессии до недетектируемого уровня, если не было перерыва в приеме препарата.
2. ВИЧ-инфицированные в период острой инфекции перед началом АРВ терапии, если заражение ВИЧ произошло от партнера с неэффективной АРВтерапией. В остальных случаях острой инфекции проведение исследования до начала АРВ-терапии не рекомендуется до тех пор, пока уровень первичной резистентности в регионе не достигнет 5%.

Противопоказания к применению метода:

1. Показатель вирусной нагрузки меньше чувствительности используемого теста по определению резистентности.
2. После отмены препарата, т.к. штаммы, обуславливающие резистентность, могут стать минорными, и поэтому не будут выявляться существующими тестами.

Рабочая зона лаборатории для молекулярного тестирования в соответствии с этапами анализа должна включать определенный набор последовательно расположенных самостоятельных помещений:

• для подготовки проб, выделения РНК (зона 1);
• для приготовления реакционных смесей, проведения реакций обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) (зона 2).

В случае использовании тест-систем, включающих методику Nested-ПЦР (двухраундовая), необходимо использование отдельного помещения или ПЦР-бокса с отдельным комплектом лабораторной одежды, автоматических пипеток, вспомогательных материалов и оборудования;

• для проведения секвенирования (зона 3).

Сертифицированные тест-системы для генотипирования ВИЧ-1 методом ПЦР с дальнейшим секвенированием ДНК.

ЗОНА 1. Для этапа выделения РНК из клинического материала требуются:

ЗОНА 2. Для проведения реакции обратной транскрипции и этапа амплификации требуются:

1. Амплификатор.
2. Стерильный ламинарный шкаф.
3. Стерильный ламинарный шкаф для Nested-ПЦР.
4. Вортекс.
5. Дополнительный вортекс для Nested-ПЦР.
6. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема: — 0,5–10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью ± 0,8%; — 20–200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью ± 0,6%; — 100–1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью ± 3%.
7. Дополнительный набор автоматических пипеток переменного объема для Nested-ПЦР:
   • 0,5–10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью ± 0,8%;
   • 20–200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью ± 0,6%;
   • 100–1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью ± 3%.
8. Штативы для микропробирок на 0,5 (0,2) мл и наконечников.
9. Дополнительные штативы для микропробирок на 0,5 (0,2) мл и наконечников для Nested-ПЦР.
10. Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР на 0,5 (0,2) мл.
11. Одноразовые наконечники для микропипеток с аэрозольным барьером до 10, 200 и 1000 мкл.
12. Дополнительные одноразовые наконечники для микропипеток с аэрозольным барьером до 10, 200 и 1000 мкл для Nested-ПЦР.
13. Холодильник от +2 до +8°С и на минус 18 ± 2°С.
14. Отдельный халат и одноразовые перчатки.
15. Емкость для сброса наконечников с дезинфицирующим раствором.

ЗОНА 3. Для проведения секвенирования

Для проведения тестирования по определению чувствительности ВИЧ к лекарственным препаратам может быть использована только плазма крови. Цельная кровь в количестве не менее 5 мл должна собираться в одноразовую пробирку с 3процентной ЭДТА в соотношении 1:20. После забора пробирка с кровью закрывается крышкой, перемешивается переворачиванием 3–4 раза и хранится при температуре от +2 до +8°С не более 24 часов. Плазма крови должна быть отобрана не позднее 24 часов после забора крови. Для этого пробирку с цельной кровью необходимо центрифугировать при 800–1600 g в течение 20 минут. Хранить плазму можно не более 3 дней при +4°С и длительно при температуре минус 70°С. Не рекомендуется замораживать/оттаивать плазму более 2 раз.

Для повышения чувствительности тест-систем рекомендуется использовать методику предварительного ультрацентрифугирования плазмы крови. Для этого 0,5–1 мл плазмы крови пациента центрифугируют в течение 1 часа при температуре от +2 до +8 градусов при 24.000 g в ультрацентрифуге, супернатант удаляют, а полученный осадок вирусных частиц выделяют по описанной в тест-системе методике.

Выделение РНК ВИЧ-1 из плазмы крови может быть проведено с помощью двух методик. Одна методика основана на специфической обратимой сорбции РНК в присутствии хаотропных солей (гуанидинтиоцианат) на частицах силикагеля и последующей отмывке сорбента с РНК от белков, солей и других ингибиторов ПЦР.

Другая методика основана на осаждении вирусной РНК изопропанолом и последующей очистке 70-процентным этанолом.

Из-за нестабильности выделенной РНК не рекомендуется ее длительное хранение.

В некоторых тест-системах возможно хранение выделенной РНК при температуре минус 70°С не более двух недель.

Для проведения реакции обратной транскрипции выделенная РНК инкубируется в реакционном буфере, содержащем фермент обратную транскриптазу, например, Moloney Murine Leukemia Virus (MuLV) для получения однонитевой комплементарной ДНК (кДНК).

Полученную кДНК можно хранить в холодильнике при температуре от -15°С до -25°С до проведения ПЦР не более двух недель или при -70°С — длительно.

В ходе ПЦР может нарабатываться как один общий фрагмент, включающий ген протеазы и 2/3 гена обратной транскриптазы, так и несколько фрагментов (например, фрагмент гена протеазы и фрагмент 2/3 гена обратной транскриптазы). Кроме того, наработка ампликона может проходить в один раунд либо в два раунда (так называемая Nested-ПЦР). Во втором раунде ПЦР используется дополнительная пара праймеров, которая локализуется внутри ампликона, полученного в первом раунде.

Так как при использовании Nested-ПЦР возрастает опасность контаминации амп ликонами первого раунда, необходимо использовать не менее двух отрицательных контролей на панель из 10 образцов и соблюдать правила работы в боксе для Nested-ПЦР (см. пункт 3).

Продукты амплификации могут храниться в течение недели при 2–8°С и длительно при -20°С.

Полученный ампликон поступает в 3-ю зону для проведения реакции секвенирования.

Реакция циклического секвенирования включает 4 стадии:

ОЧИСТКА ПЦР-ПРОДУКТА
Очистка ПЦР-продукта необходима для освобождения полученного ампликона от нуклеотидов и праймеров и может проводиться двумя способами:

1. Очистка путем сорбции на силикагеле (см. п. 6).
2. Очистка с использованием колонок основана на использовании ультрафильтрующей мембраны, которая пропускает малые по размеру нуклеотиды и праймеры, а крупные по размеру фрагменты ДНК (ампликоны) задерживаются на поверхности фильтра.

ПОДСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА ДНК
Полученный в ПЦР и очищенный ПЦР-продукт анализируют методом электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием. Одновременно с продуктами амплификации в агарозный гель вносится маркерная ДНК, которая включает фрагменты различной длины с известной концентрацией. Количество ДНК в каждом образце можно полуколичественно оценить, сравнивая интенсивность полосы, соответствующей определенному образцу, с интенсивностью маркерной ДНК. После чего выбирается схема для последующего разбавления образцов для циклического секвенирования по инструкции к тест-системе.

ЦИКЛИЧЕСКОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ
Реакционная смесь для секвенирования содержит нуклеотиды, меченные флуорофором, ДНК-полимеразу, праймер для секвенирования. Для каждого исследуемого образца ставится несколько реакций секвенирования в зависимости от количества и длины получаемых в ПЦР продуктов амплификации. Для длинных фрагментов необходимо поставить несколько реакций секвенирования с разными затравочными праймерами.

Секвенирование проводят на амплификаторе, рекомендуемом производителем тест-системы.

Принцип циклического секвенирования основан на встраивании цветных флуоресцентных меток в растущую цепь ДНК за счет терминирующих нуклеотидов.

Каждый из четырех терминирующих нуклеотидов содержит метку, флуоресцирующую определенным цветом. Растущая цепь одновременно терминируется и метится в момент присоединения нуклеотидов. В ходе такого процесса образуется каскад последовательностей ДНК, причем каждый синтезированный ДНК-продукт на одно основание длиннее последующего.

ОЧИСТКА ПРОДУКТОВ РЕАКЦИИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ
Продукт реакции секвенирования подвергается очистке от невключенных нуклеотидов с флуорофорами. Для этого используется методика двукратного осаждения 70–75-процентным раствором изопропанола.

Автоматическая детекция продуктов реакции секвенирования осуществляется в капиллярных секвенаторах, рекомендуемых производителем тест-системы. В процессе детекции отрицательно заряженные фрагменты каскадной ДНК, полученной в ходе циклического секвенирования, мигрируют в полиакриламидном геле или полимере в капилляре под действием электрического поля. При этом фрагменты малого размера мигрируют быстрее крупных. Каждый фрагмент возбуждается аргоновым лазером, сигнал флуоресценции детектируется CCD-камерой. Дальнейший сбор и преобразование данных осуществляется автоматически.

— Первый вопрос: а как вообще выглядит тест на коронавирус? Экспресс-тест на ВИЧ мы все видели: белая лопаточка с ручкой и пробирка с реагентом. Через 15 минут готов результат. Новый коронавирус тестируется по методу полимеразной цепной реакции (ПЦР). Насколько вообще его сложно производить?

— Выглядит тест на коронавирус как пробирки с прозрачными жидкостями в коробочке или пакетике, как-то так. Но чтобы провести саму реакцию и получить результат, нужно еще специальное оборудование.

Производить тест умеренно сложно, это высокие технологии, но очень хорошо отлаженные за много лет. Ограничения — как на любом производстве: реагенты и материалы, производственные мощности и должная культура производства — не надо объяснять, что будет, если чихнуть в пробирку, — плюс кадры. Каких объемов реально достигнуть — зависит от того, какие мощности будут задействованы: если, например, какие-то линии, которые сейчас производят ПЦР-тесты для других инфекционных заболеваний, волевым решением перебросить на SARS-CoV-2, производство возрастет.

— Почему сейчас тестируют коронавирус именно по методу ПЦР, а не иммуноферментного анализа, например, как ВИЧ? С ИФА диагностика была бы быстрее, дешевле? Или это вообще не имеет значения?

За подробностями лучше обратиться к специалистам в области молекулярной диагностики. Но, на мой взгляд, ПЦР с обратной транскрипцией, а именно он используется в случае с COVID-19, — хороший метод. Для ПЦР-тестов характерна высокая чувствительность. В их основе лежит амплификация нуклеиновой кислоты, то есть даже при малом количестве копий в образце можно получить хороший сигнал. Кроме того, для разработки таких тестов нужен, по большому счету, только геном вируса или часть генома.

— По факту ПЦР-тесты для COVID-19 появились почти сразу после того, как китайцы опубликовали расшифровку генома вируса. То есть для того, чтобы начать их разработку, не нужно было никаких образцов, хватило журнальной публикации и специалистов, способных быстро разработать технологию.

— Да. В том и прелесть ПЦР-теста, что для него достаточно генома вируса. Зимой, как только первый геном был опубликован, специалисты во всех странах начали заказывать синтез генетического материала nCoV-19. Зная нуклеотидную последовательность генома, в лаборатории можно получить участок этого генома и дальше экспериментировать уже с ним. В частности, проверить чувствительность и специфичность теста, используя вместо клинических образцов растворы ДНК.

В январе у ученых большинства стран вообще и не было другого выхода, настоящие пациенты имелись только в Китае. К такому методу могут быть претензии. Например, если чувствительность теста проверяется по растворам кДНК, не учитываются потери при обратной транскрипции. Тут разные другие тонкости. Но в целом ученые сработали очень оперативно.

КАК УСТРОЕН МЕТОД ПЦР?

ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом.

Как это работает?

Сначала вирусную ДНК выделяют из материала, представленного в лабораторию, денатурируют: на этом этапе двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C, чтобы цепи ДНК разошлись. Затем добавляют так называемые праймеры — начальные звенья цепочки, которые необходимы для старта синтеза новой копии, и так называемую полимеразу — тот самый фермент, который и будет заниматься репликацией ДНК.

Как правило, для лабораторной ПЦР используются ДНК-полимеразы из термофильных бактерий, поскольку в течение реакции смесь многократно охлаждают и нагревают. На следующем этапе в смесь из ДНК, полимеразы и праймеров добавляются нуклеотиды — то есть строительный материал для воспроизводства, после чего емкость с нею нагревается до 37°C, и процесс запускается.

На последующей стадии элонгации полимераза начинает синтез на каждой из двух цепочек разделенной ДНК недостающей пары. Происходит это по принципу комплементарности: фермент присоединяет напротив каждого нуклеотида, из которых состоят ДНК, противоположный. По завершении реакции цикл неоднократно повторяется (см. видео ниже).

Ингибиторы обратной транскриптазы — одни из самых распространенных видов лекарств от ВИЧ-инфекции. К ним относятся, например, зидовудин и ламивудин — самые первые препараты АРВТ, разработанные еще в 80-х.

Производится ПЦР на специальных приборах, амплификаторах, или так называемых термоциклерах (Thermal cycler).

Наглядно, как работает метод ПЦР, можно посмотреть на приведенном ниже видео.

— Что касается ИФА-тестов для коронавируса, их разработать так и не успели?

— Почему? Тесты на определение антител к антигенам SARS-CoV-2 в крови существуют. У теста на антитела свои преимущества. Но я бы сказала так: они с ПЦР-тестом дополняют друг друга. Тест на антитела лучше работает на поздних стадиях. Антитела в крови сохраняются и тогда, когда вирус исчезает из организма, то есть с помощью такого теста можно узнать, кто переболел COVID-19 в прошлом.

— Даже если у пациента не было выраженных симптомов и дело обошлось без госпитализации?

— А что за организации, кто в нашей стране занимается этими тестами? Роспотребнадзор?

У каждого теста есть погрешность. При низкой заболеваемости ложноположительных результатов может быть намного больше, чем выявленных реальных пациентов, даже если тест вполне хороший.

На первом заседании координационного совета по борьбе с коронавирусом вице-премьер РФ Татьяна Голикова сказала, что правительство ждет от регионов предложений о том, на базе каких еще лабораторий можно будет проводить эти исследования. Частные компании тоже смогут делать тесты на коронавирус на платной основе. Возможно, в самом скором времени будет новая информация о том, как все это будет происходить.

— На 15 марта появилась информация, что в России было произведено почти 110 тысяч тестов на коронавирус. Это много для наших масштабов или мало?

— По поводу возможности произвести достаточное количество тестов — тут много вопросов: производственные мощности, которыми мы располагаем, количество реагентов, которые понадобятся, наконец, лаборатории с необходимой техникой и обученным персоналом, где эти тесты проводить. Мало нам будет пользы и от миллиона тестов, если не хватит рук, чтобы эти тесты запускать. Все эти вопросы надо исследовать.