Сыворотка для определения сифилиса

Торговое название: Сыворотка для диагностики сифилиса контрольная, положительная для РСК

Международное название: Диагностикум сифилиса&

Фармакологическая группа: МИБП-диагностикум

Фармакологическая группа по АТХ: V04CX. Другие диагностические средства

Фармакологическое действие: диагностикум сифилиса, ИФС для выявления антител к Treponema pallidum

Сыворотки для диагностики сифилиса контрольные, положительная и слабоположительная получены из крови кроликов, зараженных патогенной бледной трепонемой (штамм Никольса).

Сыворотки представляют собой пористую аморфную массу в виде таблетки светло-розового цвета.

Показания к применению:

В качестве контроля при диагностике сифилиса в РСК..

Методы применения и принцип действия:

Содержимое ампулы непосредственно перед постановкой РСК растворить в 1 мл раствора натрия хлорида изотонического 0,9 % (рН 7,3+/-0,1). После полного растворения сыворотка представляют собой прозрачную жидкость светло-розового цвета. Контрольные сыворотки инактивировать на водяной бане при 56 град.С в течение 30 мин и использовать в качестве контролей параллельно с исследованием испытуемых сывороток больных сифилисом в РСК.

Для постановки реакции связывания комплемента контрольную сыворотку (отрицательную, положительную, слабоположительную), разведенную 1:5 раствором натрия хлорида изотоническим 0,9 %, разливают в 3 пробирки (по 0,25 мл в каждую), в первую пробирку добавляют 0,25 мл разведенного по титру антигена трепонемного ультраозвученного, во вторую - 0,25 мл разведенного по титру антигена кардиолипинового, в третью (контрольную) - 0,25 мл 0,9 % раствора натрия хлорида изотонического. Затем во все пробирки вносят по 0,25 мл комплемента (для проведения постановки с контрольными сыворотками приготовить раствор комплемента с 30 - 50 % надбавкой к титру).

Через 45 мин инкубации в термостате при температуре 37 град.С во все пробирки вносят по 0,5 мл гемолитической системы. Пробирки вновь помещают в термостат на 45 - 60 мин до наступления гемолиза в контрольных пробирках.

Для оценки результатов связывания комплемента используют систему четырех плюсов:

4 + - (резко положительная реакция) полная задержка гемолиза.

3 + - (положительная реакция) значительная задержка гемолиза.

2 + - (слабоположительная реакция) частичная задержка гемолиза.

1 + - (сомнительная реакция) незначительная задержка гемолиза.

Отрицательный результат - полный гемолиз эритроцитов.

Сыворотка для диагностики сифилиса контрольная положительная в РСК с кардиолипиновым и трепонемным антигенами должна давать задержку гемолиза на 3 - 4 плюса.

При наличии задержки гемолиза в контроле сыворотки крови (третья пробирка, не содержащая антигена) исследование всей аналитической серии необходимо полностью повторить.

Срок годности - 2 года. Препарат с истекшим сроком годности использованию не подлежит..

Препарат хранят в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 в недоступном для детей месте при температуре от 2 до 8град.С.

Транспортируют в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 9 до 25град.С не более 48 час.

Дата актуализации инструкции 13.11.2013

Владелец регистрационного удостоверения: Микроген НПО ФГУП Минздрава России, Россия

Формы выпуска: лиофилизат [для диагностических целей], ампулы

Состав: сыворотка крови кроликов зараженных патогенной бледной трепонемой [задержка гемолиза в РСК в разведении не менее 1:10]

Условия отпуска: для лечебно-профилактических учреждений

Данные гос. регистрации: ЛС-002085 от 13.10.2006

Состояние регистрационного удостоверения: окончание срока действия 13.10.2011

Номер фармстатьи: ФСП 42-0504-7316-05

Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Описание

Сыворотка для диагностики сифилиса слабоположительная

Наборы реагентов Сыворотка для диагностики сифилиса контрольная, положительная для РСК, Сыворотка для диагностики сифилиса контрольная слабоположительная для РСК, Сыворотка для диагностики сифилиса контрольная, отрицательная для РСК предназначены для контроля правильности результатов при постановке реакции связывания комплемента (РСК) с сыворотками больных сифилисом.

1. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
2. 1. Принцип действия.

Контрольные сыворотки дают заведомо известные результаты в реакции связывания комплемента (РСК) в присутствии кардиолипинового и трепонемного ультраозвученного антигенов.

Представляют собой сухие кроличьи сыворотки, имеющие заведомо известный титр противотрепонемных антител, отрицательная сыворотка не содержит противотрепонемных антител.

1. 2. Состав набора.

Каждый набор содержит сыворотку для диагностики сифилиса контрольную положительную, или слабоположительную, или отрицательную.

Сыворотки лиофилизированы в ампулах из объема 1 мл, имеют вид пористой аморфной массы в виде таблетки белого или светло-розового цвета.

По 10 ампул в пачке из картона с инструкцией по применению.

1. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Набор реагентов Сыворотка для диагностики сифилиса контрольная, положительная для РСК в реакции связывания комплемента должен давать задержку гемолиза на 3-4 плюса с кардиолипиновым и трепонемным ультраозвученным антигенами.

Набор реагентов Сыворотка для диагностики сифилиса контрольная, слабоположительная для РСК в реакции связывания комплемента должен давать задержку гемолиза на 2 плюса с кардиолипиновым и трепонемным ультраозвученным антигенами.

Набор реагентов Сыворотка для диагностики сифилиса контрольная, отрицательная для РСК в реакции связывания комплемента должен давать полный гемолиз в опытных пробирках с кардиолипиновым и трепонемным ультраозвученным антигенами.

1. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

1. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

— пипетки стеклянные градуированные (1,2,5 мл);

— пробирки стеклянные вместимостью 5 мл, 10 мл;

— стаканы стеклянные химические, объем 100 мл;

— водяная баня (температура (56 ±0,2) °С);

— центрифуга лабораторная (2500-3000 об/мин);

— термостат (температура (37 ±2) °С);

— раствор натрия хлорида 0,9 % изотонический.

1. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

Исследуемые сыворотки на сифилис в клинической серологии.

1. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

7.1 Приготовление рабочего раствора реагента.

Содержание ампулы непосредственно перед постановкой РСК растворить в 1 мл раствора натрия хлорида 0,9 % (рН 7,3±0,1). После полного растворения, сыворотки инактивировать на водяной бане при (56±0,1) °С в течение 30 минут и использовать в качестве контрольных, параллельно с исследованием испытуемых сывороток больных сифилисом в РСК.

7.2. Проведение анализа.

Для постановки реакции связывания комплемента сыворотку (отрицательную, слабоположительную, положительную), разведенную 1:5 раствором натрия хлорида 0,9 %, разливают в 3 пробирки (по 0,25 мл в каждую), в первую пробирку добавляют 0,25 мл разведенного по титру антигена трепонемного ультраозвученного, во вторую – 0,25 мл разведенного по титру антигена кардиолипинового, а в третью (контрольную) – 0,25 мл раствора натрия хлорида 0,9 % изотонического. Затем во все пробирки вносят 0,25 мл комплемента (для проведения постановки РСК с контрольными сыворотками приготовить раствор комплемента с 30-50 % надбавкой к титру). Через 45 минут инкубации в термостате при температуре (37±1) °С во все пробирки вносят по 0,5 мл гемолитической системы. Пробирки вновь помещают в термостат на 45-60 минут до наступления гемолиза в контрольных пробирках.

1. РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для оценки результатов РСК используют систему четырех плюсов:

4+ — (резко положительная реакция) полная задержка гемолиза.

3+ -(положительная реакция) значительная задержка гемолиза.

2+ — (слабоположительная реакция) частичная задержка гемолиза.

1+ -(сомнительная реакция) незначительная задержка гемолиза.

Отрицательный результат – полный гемолиз эритроцитов.

Скачать Инструкцию Сыворотка для диагностики сифилиса слабоположительная

Скачать РУ Сыворотка для диагностики сифилиса слабоположительная

Проведение исследований на сифилис – неотъемлемая часть предоперационной подготовки, отбора доноров, ведения беременных.

Также обследованию подвергаются лица определенной профессиональной занятости (врачи, сотрудники МВД, лица, занятые в пищевой промышленности). Подозрение на инфицированность бледной трепонемой (указание на половые или бытовые контакты с больными, наличие симптомов) – также повод для начала диагностического поиска.

Наиболее часто диагностика включает в себя модифицированную реакцию Вассермана, анализ ПЦР и исследование суммарных антител.

Проба Вассермана представляет собой реакцию связывания комплемента, которая выполняется для венозной крови обследуемого. В ходе анализа ведется поиск антител к возбудителю (бледной трепонеме). Ищутся иммуноглобулины М и G, которые высвобождаются из поврежденных трепонемой клеток.

Для того, чтобы поставить этот тест (рекомендованный Минздравом РФ в качестве скренингового для выявления болезни и контроля за терапией больного сифилисом) пользуются наборами сывороток.

В стандартный набор включают положительную, слабоположительную и отрицательную сыворотку. Они готовятся из высушенной сыворотки кролика, поэтому выглядят аналогично пористой розоватой или коричневатой массе. Выпускаются в ампулах и имеют стандартный известный титр, то есть разведение антитрепонемных антител. Отрицательный сывороточный контроль от антител свободен.

Сыворотки контрольные для диагностики сифилиса – это контрольные жидкости, с которыми сравнивают те реакции, которые протекают с кровью обследуемого.

Когда выполняется РСК, из кардиолипинового антигена и антител сыворотки пациента формируется иммунный комплекс. Когда он связывается с комплементом морских свинок, при добавлении эритроцитов барана, тормозится разрушение последних. Процесс развала эритроцитов носит название гемолиза.

Его отсутствие воспринимается как положительная реакция. То есть считается, что в сыворотке пациента имеются антитела против бледной трепонемы, образовавшиеся в результате инфицирования возбудителем сифилиса. Если же эритроциты барана разваливаются (проходит гемолиз), то комплемент свободен и не связался с комплексом антиген-антитело.

Это происходит в силу того, что антител в сыворотке пациента просто нет в силу того, что организм исследуемого не сталкивался с бледной трепонемой и не инфицирован.

Степень позитивности пробы Вассермана обозначается в крестах.

• Максимальная степень выраженности – четыре креста (гемолиза не происходит совсем). Такая реакция – резко положительная.
• Тремя крестами обозначается положительный вариант при значительной задержке распада бараньих эритроцитов
• Когда неизмененными остается лишь часть эритроцитов, пишут два креста и считают анализ слабо положительным.
• Один крест соответствует сомнительному результату (гемолитические изменения незначительны).
• Когда разваливаются все эритроциты, это идентично отрицательному результату.

Кроме качественного теста возможен и количественный вариант реакции связывания комплемента.

Контрольные сыворотки на сифилис используют в реакциях, выполняемых параллельно с исследованием сыворотки пациента.

• Сыворотка контрольная положительная для диагностики сифилиса должна тормозить гемолиз на три-четыре плюса.
• Слабоположительная сыворотка вызывает реакцию, характерную для двух плюсового гемолиза.
• Отрицательная же сыворотка гемолиз не тормозит вовсе.

При необходимости диагностики сифилиса, обращайтесь к грамотным венерологам.

Обычно РВ ставится с двумя или тремя антигенами. Наиболее часто применяется отличающийся высокой чувствительностью кардиолипиновый антиген (экстракт из сердца быка, обогащенный холестерином и лецитином) и трепонемный антиген (обработанная ультразвуком взвесь анатогенных культуральных бледных трепонем). Совместно с реагинами сыворотки крови больного эти антигены образуют иммунный комплекс, способный адсорбировать и связывать комплемент. Для визуального определения образованного комплекса (реагины + антиген + комплемент) в качестве индикатора применяется гемолитическая система (смесь эритроцитов барана с гемолитической сывороткой). Если комплемент связан в 1 фазе реакции (реагины + антиген + комплемент), гемолиз не наступает - эритроциты выпадают в легко заметный осадок (РВ положительная). Если в 1 фазе комплемент не связан вследствие отсутствия в испытуемой сыворотке реагинов, он будет использован гемолитической системой и произойдет гемолиз (РВ отрицательная). Степень выраженности гемолиза при постановке РВ оценивается плюсами: полное отсутствие гемолиза ++++ или 4+ (РВ резкоположительная); едва начавшийся гемолиз +++ или 3+ (РВ положительная); значительный гемолиз ++ или 2+ (РВ слабоположительная); непонятная картина гемолиза ± (РВ сомнительная); полный гемолиз - (реакция Вассермана отрицательная).

Помимо качественной оценки РВ имеется количественная постановка с различными разведениями сыворотки (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Титр реагинов определяется максимальным разведением, еще дающим резко положительный (4+) результат. Количественная постановка РВ имеет значение в диагностике некоторых клинических форм сифилитической инфекции, а также при проведении контроля за эффективностью лечения. В настоящее время реакция Вассермана ставится с двумя антигенами (кардиолипиновый и трепонемный озвученный штамм Рейтера). Как правило, РВ становится положительной на 5-6 неделе после заражения у 25-60% больных, на 7-8 неделе - у 75-96%, на 9-19 неделе - у 100%, хотя в последние годы иногда раньше или позже. При этом, титр реагинов постепенно нарастает и достигает максимальной величины (1:160-1:320 и выше) в случае появления генерализованных высыпаний (сифилис вторичный свежий). При позитивации РВ выставляется диагноз первичного серопозитивного сифилиса.
При вторичном свежем и вторичном рецидивном сифилисе РВ положительная у 100% больных, но у истощенных больных с ослабленным иммунитетом может наблюдаться отрицательный результат. Впоследствии титр реагинов постепенно понижается и при вторичном рецидивном сифилисе обычно не превышает 1:80-1:120.
При третичном сифилисе РВ положительная у 65-70% больных и обычно наблюдается низкий титр реагинов (1:20-1:40). При поздних формах сифилиса (сифилис внутренних органов, нервной системы) положительная РВ наблюдается в 50-80% случаев. Титр реагинов колеблется от 1:5 до 1:320.
При скрытом сифилисе положительная РВ отмечается у 100% больных. Титр реагинов от 1:80 до 1:640, а при позднем скрытом сифилисе от 1:10 до 1:20. Быстрое снижение титра реагинов (вплоть до полной негативации) во время лечения свидетельствует об эффективности лечения.

Недостатки реакции Вассермана - недостаточная чувствительность (в начальной стадии первичного сифилиса отрицательная). Она негативная также у 1/3 больных, если они в прошлом лечились антибиотиками, у пациентов третичным активным сифилисом с поражениями кожи и слизистых, костно-суставного аппарата, внутренних органов, центральной нервной системы, при позднем врожденном сифилисе.
Недостаточная специфичность - реакция Вассермана может быть положительная у лиц, которые ранее не болели и не болеют сифилисом. В частности ложноположительные (неспецифические) результаты РВ отмечаются у больных, которые страдают системной красной волчанкой, лепрой, малярией, злокачественными новообразованиями, поражениями печени, обширными инфарктами миокарда и другими заболеваниями, а иногда у совершенно здоровых людей.
Кратковременная ложноположительная реакция Вассермана выявляется у некоторых женщин перед родами или после них, у лиц, злоупотребляющих наркотиками, после наркоза, приема алкоголя. Как правило, ложноположительная РВ выражена слабо, чаще с низким титром реагинов (1:5-1:20), положительная (3+) или слабо положительная (2+). При массовых серологических обследованиях частота ложноположительных результатов составляет 0,1-0,15%. Для преодоления недостаточной чувствительности, пользуются постановкой на холоде (реакция Колляра) и одновременно она ставится с другими серологическими реакциями.

Псевдорезистентность - после проведенного лечения несмотря на положительные серологические реакции бледная трепонема в организме отсутствует. Антигена в организме нет, но продолжается выработка антител, которые фиксируются при постановке серологических реакций.
Серологическая резистентность может развиваться вследствие:

• неполноценного лечения без учета давности и стадии заболевания;
• недостаточной дозы и в частности из-за неучета массы тела пациентов;
• нарушения интервала между введением препаратов;
• сохранения в организме бледных трепонем несмотря на проведенное полноценное специфическое лечение, из-за их стойкости к пенициллину и другим химиопрепаратам в случае наличия скрытых, осумкованных очагов поражения во внутренних органах, нервной системе, лимфатических узлах, которые малодоступны для антибактериальных препаратов (нередко бледные трепонемы обнаруживаются в тканях рубца через много лет после окончания терапии, в лимфатических узлах иногда удается обнаружить бледные трепонемы через 3-5 лет после противосифилитической терапии);
• снижения защитных сил при различных заболеваниях и интоксикациях (эндокринопатии, алкоголизм, наркомания и др.);
• общего истощения (приемом пищи бедной витаминами, белками, жирами).

Кроме этого, нередко выявляется ложная позитивация серологических реакций, не связанная с наличие у больных сифилиса и вызванная:

• сопутствующими неспецифическими заболеваниями внутренних органов, нарушениями сердечнососудистой системы, ревматизмом, дисфункциями эндокринной и нервной систем, тяжелыми хроническими дерматозами, злокачественными новообразованиями;
• поражениями нервной системы (тяжелые травмы, сотрясение головного мозга, психические травмы);
• беременностью; хроническими интоксикациями алкоголем, никотином наркотиками; инфекционными болезнями (малярия, туберкулез, вирусный гепатит, дизентерия, сыпной, брюшной и возвратный тифы).

Указанные факторы могут оказывать влияние на иммунологическую реактивность организма как в период активного развития сифилитических проявлений, так и во время их регресса.

Анализ на сифилис является одним из самых распространенных среди лабораторных исследований. Широко используются анализы на сифилис при проведении профилактических обследований. При помощи микроскопии выявляется возбудитель сифилиса — бледная трепонема. При помощи серологических реакций подтверждается диагноз сифилиса, устанавливается диагноз скрытого сифилиса, проводится контроль эффективности лечения, определяется излеченность больных.

Диагноз сифилиса устанавливается на основании клинических данных, обнаружении возбудителей сифилиса в образцах материала и подтверждении диагноза серологическими методами исследования. Проявления сифилиса многочисленны и многообразны, ввиду чего болезнь выявляется врачами разных специальностей. Дифференциальная диагностика первичного сифилиса проводится с целым рядом заболеваний.

Рис. 1. На фото первичное проявление сифилиса — твердый шанкр.

Антитела к бледной трепонеме и серологическая диагностика

При заражении сифилисом в организме больного образуются антитела. Серологическая диагностика помогает врачу изучать динамику образования антител в организме больного сифилисом в начальных стадиях заболевания, в период лечения и после его окончания, решить вопрос рецидив заболевания у больного или повторное заражение (реинфекция), поставить диагноз сифилиса при массовых медицинских условиях.

Первыми после заражения начинают вырабатываться антитела IgM. Они начинают выявляться при помощи серологических реакций уже со второй недели после заражения. На 6 — 9 неделях заболевания их количество становится максимальным. Если больной не лечился, то антитела исчезают через полгода. Антитела IgM исчезают через 1 — 2 мес. после лечения раннего сифилиса, через 3 — 6 мес. — после лечения позднего сифилиса. Если регистрируется их рост, то это служит признаком рецидива сифилиса или говорит о повторном заражении. Молекулы IgM крупные и через плаценту к плоду не переходят.

Антитела иммуноглобулины IgG появляются в конце первого месяца (на 4-й неделе) от момента заражения. Их титр выше, чем титр IgM. IgG сохраняются после излечения достаточно длительное время.

Существует множество серологических реакций. Это объясняется антигенной множественностью бледных трепонем. В сыворотке крови больного человека на разных стадиях сифилиса кроме специфических образуются те или иные неспецифические антитела — агглютинины, комплементсвязывающие, иммобилизины, антитела, вызывающие иммунную флюоресценцию, преципитины и др. Серологические реакции по выявлению неспецифических антител обладают относительной специфичностью поэтому, чтобы избежать диагностических ошибок, следует пользоваться не одним, а комплексом серологических реакций (КСР).

Отличительной особенностью нетрепонемных тестов является получение ложноположительных реакций. Антитела-реагины, которые вырабатываются в крови человека против кардиолипинового антигена, регистрируются не только при сифилисе, но и при других заболеваниях: коллагенозах, гепатитах, заболеваниях почек, тиреотоксикозе, онкозаболеваниях, при инфекционных заболеваниях (лепра, туберкулез, бруцеллез, малярия, сыпной тиф, скарлатина), при беременности и месячных циклах, при приеме жирной пищи и алкоголя. Отмечено, что с возрастом количество ложноположительных реакций возрастает.

Рис. 2. На фото первичный сифилис у женщин.

Лабораторная диагностика сифилиса с применением серологических реакций

Серологические тесты на сифилис подразделяются на трепонемные и нетрепонемные.

В качестве антигена в этой группе тестов используется кардиолипиновый антиген. Липидные антигены возбудителей сифилиса самые многочисленные. Они составляют 1/3 сухой массы клетки. С помощью нетрепонемных тестов выявляются антитела-реагины, которые вырабатываются против кардиолипинового антигена. В эту группу входит реакция связывания комплемента (РСКкард), реакция микропреципитации (РМП), реакция быстрого определения реагинов плазмы (RPR) и др. С помощью нетрепонемных тестов проводится первичный скрининг на сифилис (обследование групп населения), а возможность получения результатов в количественном варианте позволяет использовать эти тесты с целью контроля эффективности лечения. Положительные результаты нетрепонемных тестов должны подтверждаться трепонемными тестами. Отличительной особенностью нетрепонемных тестов является получение ложноположительных реакций.

В трепонемных тестах используются антигены трепонемного происхождения, выделенные из культуры бледных трепонем. С их помощью подтверждаются положительные результаты нетрепонемных тестов. В группу входят: РСКтреп — реакция связывания комплемента, РИФ — реакция иммунофлюоресценции и ее модификации, РИТ, РИБТ — реакция иммобилизации бледных трепонем, РПГА — реакция пассивной гемагглютинации, ИФА — иммуноферментный анализ.

Антигены для данной группы тестов получают генно-инженерным путем и используют в реакциях — РПГА и ИФА, в анализах иммуноблоттинга (ИБ) и иммунохроматографическом анализе.

Рис. 3. Для диагностики сифилиса используется комплекс серологических тестов.

Диагностика сифилиса с применением нетрепонемных тестов

Для выявления сифилиса используются нетрепонемные тесты или комплекс серологических реакций (КСР). Серологическая диагностика применятся с 5-й недели от момента заражения или с 2-3 недели после появления твердого шанкра. Антитела выявляются практически у всех больных со свежим первичным, вторичным и рецидивным сифилисом. Серологические реакции положительные у 70 — 80% больных с третичным активным сифилисом, в 50 — 60% случаев у больных третичным скрытым сифилисом.

Серологические реакции с применением нетрепонемных тестов могут давать ложноположительные результаты.

Рис. 4. Забор крови для проведения анализа на сифилис.

Реакция связывания комплемента (РСК кард, КСК с КА, реакция Вассермана)

Реакция Вассермана (RW, РВ), изобретенная А. Вассерманом более 100 лет назад, сегодня претерпела множество изменений, однако, как дань традиции, сохранила свое название по настоящее время. Реакция связывания комплемента с применением кардиолипинового антигена предназначена не только для выявления антител, но и выполняется в количественном варианте — с разными разведениями сыворотки, что позволяет использовать ее для контроля эффективности лечения. Низкая чувствительность и специфичность, получение ложноположительных результатов — отрицательные стороны данного вида исследования.

Суть реакции Вассермана заключается в следующем: антигены, которые применяются при постановке реакции Вассермана, в случае наличия антител к возбудителям сифилиса в крови человека посредством комплимента связываются с ними и выпадают в осадок. Интенсивность реакции обозначают знаком (+). Реакция может быть отрицательной (-) — отсутствие осадка, сомнительной (небольшой осадок или +), слабоположительной (++), положительной (+++) и резко положительной (++++).

Более чувствительной является видоизмененная реакция Вассермана — реакция Колмера. С ее помощью выявляются антитела в сыворотках, где реакция Вассермана дала отрицательный результат.

При резко положительных реакциях проводится количественное определение реагинов, для чего используется сыворотка в разведениях от 1:10 до 1: 320, что позволяет использовать данный вид исследования для контроля эффективности лечения. Например, снижение титра антител и последующая их серонегативация (получение отрицательных результатов), говорит об успешном излечении заболевания.

Рис. 5. Анализ крови на сифилис — реакция Вассермана.

Микрореакция преципитации применяется для массовых обследований отдельных групп населения, диагностики сифилиса и контроля над эффективностью лечения. Для проведения данного вида исследования необходимо небольшого количества исследуемого материала. В основе микрореакции преципитации лежит иммунологическая реакция антиген-антитело. В случае наличия антител в сыворотке крови обследуемого комплекс антиген-антитело выпадает в осадок с образованием хлопьев. Реакция проводится в лунках специальной стеклянной пластины. Оценивается по интенсивности выпавшего осадка и величине хлопьев в (+) как реакция Вассермана. При обследовании беременных, доноров и для контроля эффективности лечения не применяется. VDRL и RPR являются разновидностями микрореакций.

Рис. 6. Вид реакции преципитации в капле на стекле.

Рис. 7. Анализ крови на сифилис — реакция микропреципитации.

Рис. 8. Набор для проведения реакции быстрого определения реагинов плазмы (Тест на сифилис RPR).

Все положительные тесты, полученные при проведении неспецифических серологических реакций, требуют подтверждения специфическими реакциями — трепонемными тестами.

Диагностика сифилиса с применением трепонемных тестов

При проведении трепонемных тестов используются антигены трепонемного происхождения. Их отрицательной стороной является невозможность использования для контроля эффективности проводимого лечения, получение положительных результатов при спирохетозах и невенерических трепонематозах и получение ложноположительных результатов при онкологических заболеваниях, лепре, некоторой эндокринной патологии. Такие тесты, как РПГА, ИФА и РИФ остаются положительными многие годы после излечения сифилиса, а в некоторых случаях и пожизненно.

РИБТ и РИФ являются более специфическими из всех серологических реакций, применяемых для диагностики сифилиса. Они позволяют различать ложноположительные реакции, выявлять поздние формы сифилиса, протекающие с отрицательными реакциями. При помощи РИБТ распознаются ложноположительные реакции у беременных, когда необходимо решить вопрос об инфицированности ребенка.

Суть реакции заключается в том, что антитела, находящиеся в сыворотке крови больного, обездвиживают бледные трепонемы. Отрицательной считается реакция при иммобилизации до 20% возбудителей, слабоположительная — 21 — 50%, положительная — 50 — 100%. РИБТ иногда дает ложноположительные результаты. Тест сложный и трудоемкий, однако, является незаменимым при проведении дифференциальной диагностики скрытых форм заболевания и ложноположительных результатов серологических реакций, в том числе у беременных. РИБТ дает 100% положительный результат при вторичном, раннем и позднем сифилисе, в 94 — 100% случаев — при других формах сифилиса.

Суть реакции заключается в том, что бледные трепонемы (антигены), соединенные с антителами, меченными флюорохромами, издают в люминесцентном микроскопе желто-зеленое свечение. Результат оценивается знаком (+). С помощью РИФ выявляются иммуноглобулины класса А. Реакция иммунофлюоресценции становится положительной раньше, чем реакция Вассермана. Она всегда положительная при вторичном и латентном сифилисе, в 95 — 100% случаев положительная при третичном и врожденном сифилисе. Техника проведения данного вида исследования проще, чем у РИБТ, но заменить РИФ на РИБТ невозможно, так данная реакция уступает РИБТ по специфичности. РИФ-10 (модификация РИФ) более чувствительна, РИФ-200 и РИФ-абс более специфичны.

Рис. 9. Анализ крови на сифилис — реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

Суть реакции заключается в том, что сенсибилизированные сывороткой больного бледные трепонемы в присутствии комплемента прилипают к поверхности эритроцитов. Полученные комплексы при цетрофугировании выпадают в осадок. Чувствительность данного теста и специфичность близки к РИФ и РИБТ.

С помощью ИФА определяются иммуноглобулины класса М и G. Методика IgM – ИФА может быть использована в качестве скринингового и подтверждающего теста. Чувствительность ИФА и его специфичность аналогичны РИФ. При сифилисе ИФА дает положительные результаты с третьего месяца инфицирования и довольно долго (иногда всю жизнь) остается положительным.

Рис. 10. Иммуноферментный анализатор.

РПГА основана на способности эритроцитов, на которых адсорбированы антигены бледной трепонемы, в присутствии сыворотки больного склеиваться (гемагглютинация). РПГА применяется для диагностики всех форм сифилиса, в том числе скрытого. При применении высокого качества антигена данный вид серологической реакции превышает все остальные тесты по специфичности и чувствительности.

Рис. 11. РПГА применяется для диагностики всех форм сифилиса.

Рис. 12. Анализ на сифилис — реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (схема).

Рис. 14. Тест РПГА в лабораторных условиях.

Микробиологическая диагностика

Наряду с серологической диагностикой методика обнаружения бледных трепонем (микробиологическая диагностика) играет важную роль, особенно в период серонегативного сифилиса, когда еще в крови отсутствуют антитела, но уже есть первые проявления свежего первичного сифилиса (твердый шанкр).

Биологическим материалом для исследования служит отделяемое с поверхности твердых язв (шанкров), содержимое пустулезных сифилидов, мокнущих и эрозивных папул, пунктаты инфицированных лимфатических узлов, ликвор и амниотическая жидкость, для проведения ПЦР — кровь.

Наилучшей методикой обнаружения возбудителей сифилиса является исследование биологического материала в темном поле микроскопа. Данная методика позволяет увидеть бледные трепонемы в живом состоянии изучить ее особенности строения и движения, отличить патогенные возбудители от сапрофитов.

Рис. 15. Анализ на сифилис — темнопольная микроскопия.

Рис. 16. При изучении сухих мазков используется окраска по Романовскому-Гимзе. Бледные трепонемы окрашиваются при этом в розовый цвет, все остальные виды спирохет — в фиолетовый.

Обнаружение бледных трепонем при микроскопии в темном поле — абсолютный критерий окончательной диагностики сифилиса.

Рис. 17. Для выявления бактерий применяется реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — трепонемный тест. Специфический комплекс антиген- антитело при соединении со специфической сывороткой, меченной флюорохромом, в свете люминесцентного микроскопа дает свечение бактерий зеленоватым цветом.

Рис. 18. Возбудители сифилиса хорошо просматриваются в мазках, приготовленных по методике Левадити (импрегнация серебром). Бледные трепонемы темного цвета на фоне желтой окраски клеток инфицированных тканей.

Рис. 19. Возбудитель сифилиса при многократном увеличении.

Рис. 20. На фото колонии бледных трепонем. Получить культуру бактерий тяжело. Они практически не растут на искусственных питательных средах. На средах, содержащих лошадиную и кроличью сыворотки, колонии появляются на 3 — 9 сутки.

ПЦР на сифилис

Эффективным и перспективным сегодня является методика проведения полимеразной цепной реакции. ПЦР на сифилис позволяет получить результат в течение нескольких часов, а в собранном для диагностики материале может присутствовать хотя бы несколько возбудителей заболевания.

Рис. 21. ПЦР на сифилис позволяет обнаружить ДНК или ее фрагменты бледных трепонем.

Чувствительность данного метода исследования зависит от наличия в биологическом материале бледных трепонем и достигает 98,6%. Специфичность данного теста во многом зависит от правильного выбора мишени для амплификации при проведении диагностики и достигает 100%.

Вместе с тем, в связи с недостаточно изученной сравнительной характеристики чувствительности и специфичности прямых методов диагностики сифилиса и ПЦР, данный метод обследования в РФ для диагностики заболевания пока не разрешен.

ПЦР на сифилис разрешено проводить лишь в некоторых случаях, как дополнительный метод диагностики врожденного сифилиса, нейросифилиса, при затруднениях проведения диагностики сифилиса с использованием серологических методов исследования у ВИЧ-больных.

Рис. 22. Выявление ДНК бледной трепонемы с применением ПЦР говорит либо о наличии жизнеспособных бактерий, либо об остатках погибших, но содержащих способных к образованию дополнительных копий отдельных участков хромосомной ДНК.