Методические рекомендации по видовой идентификации стафилококков

Микробиологические методы идентификации микробов
рода Staphylococcus

Целью идентификации является установление рода и вида выделенной чистой культуры. Род стафилококка относится к семейству Micrococcaceae, в которое входят также роды Micrococcus и Planococcus. Общими чертами представителей этого семейства являются: морфология, положительная окраска по Граму; наличие фермента – каталазы.

Род Staphylococcus состоит из нескольких видов, наиболее важными из которых являются S.аureus, S.epidermidis и S.saprophyticus. Представители последних двух видов являются коагулазоотрицательными и долгое время считались непатогенными. В настоящее время доказано, что эпидермальный стафилококк может вызвать такие заболевания, как эндокардит, сепсис, конъюнктивит, инфекция ран и мочевыводящих путей, послеродовые инфекции, а сапрофитический – острый уретрит, цистит и др. На первом этапе устанавливается принадлежность выделенной культуры к семейству Micrococcaceae и роду Staphylococcus. На принадлежность культуры к семейству микрококков указывает положительная проба на каталазу, так как другие кокки (в частности стрептококки), каталазу не образуют. Для установления принадлежности культуры к роду Staphylococcus основными методами являются культуральный и биохимический.

Культуральный метод . Основным отличием стафилококков от микрококков является окраска колоний на плотной среде. Для стафилококков характерна золотистая или белая окраска колоний. У микрококков колонии окрашены в желтый или розовый цвет.

Биохимический метод . Он основан на том, что стафилококки являются факультативными анаэробами, микрококки – облигатными аэробами. В связи с этим стафилококки способны расти и ферментировать глюкозу в анаэробных условиях, а микрококки лишены этой возможности. Для определения этого признака культуру засевают петлёй в столбик полужидкой среды, содержащей 1% глюкозы и индикатор на кислые продукты. Сверху среду заливают стерильным вазелиновым маслом и ставят в термостат при 37 0 С на 5 суток. Рост культуры и изменение цвета среды указывает на принадлежность её к роду Staphylococcus.

Видовая идентификация стафилококков. S.aureus отличается от других видов наличием золотистого или палевого пигмента (в большинстве случаев), наличием ферментов: плазмокоагулазы, лецитиназы (лецитовителлазы) и ДНК-азы. Плазмокоагулазу определяют путём посева культуры в цитратную кроличью плазму, после чего посевы помещают в термостат при 37 0 С и регистрируют результаты через 1, 2, 4, 6 и 18 часов. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого размера считается положительным результатом реакции. Лецитиназу определяют путём посева культуры на молочно-желточный солевой агар. В составе яичного желтка имеется лецитовителлин, а наличие молока стимулирует образование пигмента. Посевы выдерживают в термостате при 37 0 С 18-24 часа. О наличии лецитиназы свидетельствует образование вокруг колоний радужного венчика.

Определение ДНК-азы. Принцип метода: под действием ДНК-азы добавленная в плотную среду высокополимерная ДНК распадается на низкополимерные фрагменты. При этом мутная среда, содержащая высокополимерную ДНК, становится прозрачной. Ход исследования: на питательную среду в чашке Петри, включающую от 50 до 200 мг ДНК и 0,5 мл 10% раствора хлористого кальция, штрихами засевают исследуемую культуру и помещают в термостат при 37 0 С на 18-24 часа. После этого на поверхность агара заливают 5-7 мл 3 моль/л раствора соляной кислоты. Если через 2-3 минуты вокруг посевов появляются зоны просветления, то реакция считается положительной

Если культура имеет золотистый (палевый), пигмент, коагулирует плазму и обладает хотя бы одним из двух других ферментов (лецитиназа, ДНК–аза) – её относят к виду золотистого стафилококка. При отсутствии полного набора указанных признаков (основным является наличие плазмокоагулазы) проводят идентификацию видов эпидермального и сапрофитического стафилококков по трем основным признакам, отличающим эти два вида (см. таблицу).

Устойчивость к новобиоцину определяют путём посева культуры на среду, содержащую 2 мкг/мл новобиоцина. Ферментацию маннита проводят в аэробных условиях путём посева культуры бляшкой на поверхность среды в чашке Петри, содержащей 1% маннита и индикатор на кислые продукты. Появление окрашенных колоний (в цвет индикатора) указывает на способность культуры ферментировать маннит. Таким образом, для эпидермального стафилококка характерны:

- чувствительность к новобиоцину;

- наличие фосфатазы и неспособность окислять маннит.

Для сапрофитического стафилококка характерны противоположные свойства.

Выделенные культуры S.aureus обычно подвергают фаготипированию с международным набором фагов (22 фага). Определение фаготипа стафилококка помогает установить источник инфекции и принадлежность выделенной культуры к госпитальным штаммам.

Опишите по дням ход исследования и результаты при выделении золотистого стафилококка из гноя. Опишите по дням ход исследования и результаты при подозрении на сепсис: сколько крови взять, в какую питательную среду посеять, какое количество питательной среды взять, в каких условиях производится взятие крови и её посев. Дальнейший ход исследования описать отдельно при обнаружении стафилококка и стрептококка. Какие материалы исследуют при подозрении на стафилококковое пищевое отравление, что обнаруживают в исследуемых материалах, на каких животных ставится проба? Идентификация чистой культуры стафилококка: по каким признакам определяют родовую и видовую принадлежность. Методы определения факторов патогенности стафилококка: пламокоагулазы, лецитовителлазы, ДНК-азы. Фаготипирование стафилококков: с какой целью проводится, каким набором фагов, методика фаготипирования. Схема микробиологического исследования при пищевой интоксикации стафилококкового происхождения. Опишите по дням ход исследования и результаты при выделении стрептококка из гноя. Краткая характеристика основных видов из группы грамотрицательных микроорганизмов. Синегнойная палочка: название по–латыни, морфология, культивирование, пигментообразование, основные факторы вирулентности; группы больных, у которых чаще всего наблюдается синегнойная инфекция. Протей: название по-латыни, морфология и физиология, особенности культуральных свойств. Кишечные палочки: наиболее частые формы инфекции (места локализации воспалительных процессов). Характеристика возбудителей анаэробной газовой инфекции (основных трёх видов): название видов по-латыни, морфология (споры, жгутики, капсула). Окраска по Граму, способ биологического окисления, среды для культивирования, характер колоний в толще агара, изменения на среде Вильсон-Блера, изменения на молоке; свойства токсина, действие в организме, серологические типы токсина. Факторы инвазивности. Характеристика неспорообразующих (неклостридиальных) анаэробов. Классификация: семейства, роды, основные виды (названия по-латыни). Основные свойства: морфология, отношение к окраске по Граму, условия культивирования. Ассоциация микроорганизмов (смешанная инфекция) при гнойных и раневых инфекциях: наиболее частые сочетания, особенности микробиологической диагностики при ассоциациях возбудителей.

Написать по-латыни названия видов неспорообразующих анаэробов, грамотрицательных микроорганизмов – возбудителей раневых и гнойных инфекций и названия возбудителей анаэробной газовой инфекции.

1. Продолжение исследования гноя (2-й день). Изучите и опишите колонии стафилококка на чашках с кровяным агаром. С помощью миллиметровой бумажки определите диаметр зон задержки роста вокруг дисков с антибиотиками и сделайте вывод о чувствительности микрофлоры гноя к антибиотикам. Проведите идентификацию выделенной чистой культуры стафилококка:

а) учтите результаты посева на анаэробное сбраживании глюкозы;

б) поставьте реакцию плазмокоагуляции: в пробирку с 0,5 мл кроличьей цитратной плазмы в разведении 1:4 (опыт) и в другую пробирку с 0,5 мл раствора хлорида натрия (контроль) внесите по 1 петле исследуемой культуры стафилококка. Пробирки поставьте в термостат. В конце занятия проверьте результат и сделайте вывод, данные запишите в журнал;

в) учтите результаты посева на лецитовителлазу;

г) учтите результаты посева на ДНК-азу;

д) учтите результаты фаготипирования.

4. Разберите схему исследования при стафилококковой интоксикации.

5. Изучите профилактические и лечебные препараты, применяемые при стафилококковых и стрептококковых инфекциях. Посмотрите препараты, прочитайте этикетки, охарактеризуйте каждый препарат по схеме: что собой представляет (вакцина, анатоксин, сыворотка, иммуноглобулин и др.), что содержит (антиген, антитело), как приготовлен, для чего применяется. Если препарат лечебно-профилактический – какое оказывает действие на организм. Дозируется ли препарат и в каких единицах? Если диагностический – что выявляют с помощью этого препарата?

6. Исследование отделяемого раны на возбудителей анаэробной газовой инфекции. Ознакомьтесь с сопроводительной запиской и внесите данные в журнал. Приготовьте мазок из отделяемого раны, окрасьте по Граму, промикроскопируйте. Произведите посев на среду Китта–Тароцци, на среду Вильсон–Блера и на молоко. Проделанную работу и результаты запишите в журнал.

Бесплатная горячая линия юридической помощи

• Главная
• "МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ ЛЕЧЕБНЫХ ГРЯЗЕЙ" (утв. Минздравом СССР 11.09.89 N 143-9/316-17)

3. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПЕЛОИДОВ

Банку с пробой вскрывают, окисленный слой удаляют стерильным шпателем, грязь перемешивают. Отбор проб из банки проводят методом "режущего кольца" с помощью стерильной трубки с внутренним диаметром 10 мм. Для этого трубку погружают в банку на полную глубину. Пробу извлекают из трубки с помощью поршня на стерильную чашку Петри и тщательно перемешивают.

Для анализа отбирают навеску грязи 15-30 г, помещают в колбу с 135-270 мл стерильной водопроводной воды. Пробы грязи в колбах встряхивают на шуттель-аппарате в течение 15-20 минут. Для лучшего перемешивания грязи в колбу можно поместить стерильные стеклянные бусы (шарики) в количестве 30-50 штук.

В результате встряхивания образуется грязевая "болтушка" с разведением грязи 1:10, которая считается "основным" разведением. Из основного разведения готовят последующие десятикратные разведения. Для этого в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды вносят 1 мл основного разведения (1:10) и так далее. Обычно приготовляют 3-4 последующих разведения. Из приготовленных разведений посевы вносят в соответствующие питательные среды для определения микроорганизмов. Исследуются следующие объемы грязевой суспензии:

100 мл, 10 мл, 1 мл основного разведения, что соответствует 10 г грязи, 1 г и 0,1 г, по 1 мл последующих разведений (0,1 мл; 0,01 и т.д. до 0,0001), что соответствует 0,01 г грязи, 0,001 и т.д.

Все исследования проводятся в 2-кратной повторности.

3.1. Определение количества ЛКП, фекальных колиформных бактерий, энтерококков, P. aeruginosa

Определение количества ЛКП, фекальных колиформных бактерий, энтерококков, P. aeruginosa проводится в соответствии со схемой исследования (Приложение 1). В качестве накопительной универсальной среды используется лактозопептонная среда (ЛПС).

К 100 мл основного разведения грязевой суспензии добавляют 10 мл концентрированной ЛПС, к 10 мл основного разведения - 1 мл концентрированной ЛПС, в пробирки с 9 мл неконцентрированной ЛПС добавляют 1 мл основного разведения и последующих.

Инкубацию проводят при температуре 37 град. С в течение 24-48 часов. Через 24 часа посевы просматривают и отмечают в них наличие или отсутствие газообразования и помутнения среды. При отсутствии через 48 часов помутнения в колбах и пробирках дают отрицательный ответ.

3.1.1. Определение лактозоположительных кишечных палочек

В качестве основного показателя степени фекального загрязнения пелоидов определяют лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП) или колиформные бактерии, которые входят в семейство Enterobacteriaceae. К ним относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, ферментирующие лактозу до кислоты и газа при 37 град. С в течение 21 часа, с отрицательным оксидазным тестом.

При наличии в колбах и пробирках газообразования и помутнения через 24 часа инкубации производят высев на среду Эндо, разделенную на 3-4 сектора с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Чашки инкубируют 16-18 часов при температуре 37 град. С.

При наличии типичных колоний красных с металлическим блеском, розовых с красным центром, розовых выпуклых слизистых и др. проверяют оксидазную активность. Оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий Pseudomonadaceae и других видов сапрофитных бактерий; на среде Эндо P. aeruginosa растут в виде плоских колоний сиреневого цвета с неровными краями, оксидазоположительные.

Постановка оксидазного теста при этом осуществляется следующим образом: петлей или стеклянной палочкой снимают изолированные колонии со среды Эндо и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную специальным реактивом (Приложение 3, п. 5).

Через 1-3 минуты культура окрашивается в ярко-синий цвет при положительной реакции на оксидазу и не изменяется при отрицательной. Если оксидазный тест со среды Эндо проявляется недостаточно четко, то для подтверждения результата изолированные колонии можно пересеять на скошенный питательный агар и после подращивания повторить оксидазный тест. Оксидазный тест можно определять системой индикаторных бумажек (СИБ).

При наличии на поверхности среды Эндо розовых или красных колоний с отрицательной оксидазной активностью их микроскопируют.

При наличии грамотрицательных палочек засевают по 2-3 колонии каждого типа в полужидкую или жидкую с поплавком среду с лактозой для подтверждения ферментации лактозы. Учет производят через 4-5 и 18 часов инкубации при 37 град. С. Если за это время происходит образование кислоты и газа, то это свидетельствует о наличии лактозоположительных кишечных палочек в исследуемом разведении грязи. Признаком газообразования является появление пузырьков газа; об образовании кислоты свидетельствует изменение цвета среды. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного ответа через 24 часа. При отсутствии газообразования через этот срок получают окончательный отрицательный ответ, при наличии газообразования - положительный результат.

В тех лабораториях, где учет на полужидкой среде с лактозой не может производиться через 4-5 часов, следует применять лактозопептонную среду с поплавками. В этом случае учет результатов производят через 10-24 часа.

Обнаружение в грязи колиформных бактерий следует рассматривать как показатель фекального загрязнения грязи, а их количество позволяет судить о степени этого загрязнения. Количество колиформных бактерий выражают через коли-титр.

После выделения колиформных бактерий устанавливается титр, при этом принимается то предельное разведение грязи, которое дало положительный ответ.

Например: если положительный результат отмечается в пробирке с 1 мл основного разведения, а в последующем разведении бактерии ЛКП не обнаружены, то коли-титр будет равен 0,1.

3.1.2. Определение фекальных колиформных бактерий

К группе фекальных колиформных бактерий относятся E. Coli, Klebsiella и др. - грамотрицательные, не образующие спор палочки, способные ферментировать лактозу до кислоты и газа при 44 +/- 0,5 град. С. Обнаружение фекальных колиформных бактерий указывает на наличие свежего фекального загрязнения.

Для подтверждения принадлежности лактозоположительных колоний к фекальным колиформным бактериям со среды Эндо несколько колоний каждого типа с отрицательным оксидазным тестом пересевают в пробирки с лактозным бульоном, содержащим борную кислоту.

Засеянные пробирки инкубируют при температуре 44 +/- 0,5 град. С в течение 24 часов. Положительный ответ дают при наличии помутнения и газообразования.

Срок анализа можно сократить, если из сред накопления, где обнаружен газ, одновременно с высевом на среду Эндо для подтверждения наличия лактозоположительных кишечных палочек производят высев пипеткой в количестве 2-3 капли в лактозный бульон с борной кислотой. Посевы инкубируют при температуре 44 +/- 0,5 град. С, определяя при этом преимущественно фекальные колиформные бактерии.

3.1.3. Определение энтерококков

Энтерококки - грамположительные, полиморфные круглые, чаще слегка вытянутые с заостренными концами диплококки, располагающиеся попарно или в коротких цепочках. Определяют для подтверждения фекального загрязнения.

Из накопительной среды (ЛПС), где имеет место помутнение, делают высев на сектора элективной молочно-ингибиторной среды (МИС). Через 24-48 часов инкубации посевов на МИС при температуре 37 град. С в качестве положительных результатов отмечают наличие аспидно-черных выпуклых с металлическим блеском, а также сероватых мелких колоний.

Молочно-ингибиторная среда позволяет дифференцировать виды энтерококков: S. faecalis образуют аспидно-черные выпуклые колонии с металлическим блеском; S. faecalis биовар liguefaciens такие же колонии, окруженные зоной просветления с выпадением по периферии осадка параказеина повышенной мутности; S. faecium и биовар durans мелкие серые плоские колонии.

Типичные колонии микроскопируют и отсевают на косяк с МПА. Вместо среды МИС можно использовать также среду Турчинского. Обнаружение грамположительных, слегка вытянутых с заостренными концами диплококков, часто располагающихся короткими цепочками, свидетельствует о наличии энтерококков. С культурой, выросшей на косяке, ставится каталазная проба. Для этого на газон роста наносится 3-процентная перекись водорода. При наличии пузырьков газа культура считается каталазоположительной (сарцины, стафилококки и др.).

Энтерококки - каталазоотрицательные микроорганизмы.

3.1.4. Определение P. aeruginosa

P. aeruginosa - грамотрицательные, мелкие подвижные, оксидазоположительные палочки. Спор не образуют, не ферментируют, но окисляют глюкозу до кислоты, имеют пигмент сине-зеленой окраски.

Посев исследуемого материала осуществляют из накопительной среды ЛПС (3.1) на среду "Блеск", и чашки инкубируют при 42 град. С 24 часа. Высев следует производить с расчетом получения максимального количества изолированных колоний. Колонии P. aeruginosa на среде "Блеск" темно-красного цвета, плоские, нередко принимают веретенообразную форму, сплошь покрыты золотистым налетом либо содержат многочисленные вкрапления, иногда окруженные светло-красным ободком или бесцветным венчиком.

Культура P. aeruginosa обладает специфическим ароматическим запахом земляничного мыла, жасмина, фиалки, цветов липы и др. Для идентификации P. aeruginosa со среды "Блеск" снимают 1-3 наиболее типичных колонии с золотистым блеском, микроскопируют. Грамотрицательные культуры засевают уколом в столбик среды Хью-Лейфсона (OF) для определения оксидации и ферментации глюкозы и одновременно макроколониями (бляшками) на среду Кинг-А, а также на косяк с МПА. На среде Кинг-А на одной чашке можно разместить от 16-18 до 24 макроколоний.

Посевы инкубируют при температуре 37 град. С в течение 24-48 часов, а затем учитывают результаты. Р. aeruginosa окисляют глюкозу, но не ферментируют ее, первоначальный зеленый цвет среды OF изменяется в верхней части столбика на желтый (+), нижняя остается зеленой (-). Результат учитывается как OF (+/-). Enterobacteriaceae изменяют среду OF в желтый цвет (+/+) и не учитываются.

На среде Кинг-А колонии плоские, с шероховатой поверхностью, неровными краями и кружевным венчиком; при косом освещении улавливается серебристый блеск. Характерно наличие окрашиваемого пигмента. При отсутствии пигмента посевы оставляют еще на сутки при комнатной температуре. Пигмент образуется вокруг колоний и диффундирует в толщу среды. Культуру, выросшую на косяке, проверяют на оксидазную активность. При этом колонии P. aeruginosa в течение 15-20 секунд становятся темно-синими.

При наличии оксидазоположительных бактерий, продуцирующих пигмент и дающих на среде "Блеск" золотистый налет, идентификацию P. aeruginosa можно считать законченной.

Количественный учет P. aeruginosa выражается в титре аналогично коли-титру.

3.2. Определение сульфитвосстанавливающих клостридий в лечебных грязях Сульфитвосстанавливающие клостридии, преимущественно C. perfingens, - крупные неподвижные палочки, не образующие цепочки, грамположительные, анаэробные, толстые с "обрубленными" или слегка закругленными концами, жгутиков не имеют, образуют споры. Характерным признаком является высокая ферментативная активность, расщепление сахаров с образованием кислоты и газа, быстрое и бурное свертывание молока с образованием сгустка и отделением сыворотки, а также способность редуцировать сульфит натрия (Na2SO3) при 45 +/- 1 град. С в течение 16-18 часов на железо-сульфитной среде.

1 мл основного и последующих разведений лечебной грязи (0,1; 0,01) переносятся в два ряда параллельных пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80 град. С в течение 15 минут или 90 град. С в течение 10 минут для уничтожения вегетативной микрофлоры. Затем во все пробирки наливают по 9-10 мл среды Вильсон-Блера, приготовленной extempore.

Пробирки заливают расплавленной средой (50-60 град. С) и быстро опускают в холодную воду для немедленного охлаждения и удаления воздуха из среды. Инкубируют посевы при температуре 44-45 град. С в течение 24 часов. При наличии клостридий в пробирках через 4-5 часов образуются колонии черного цвета. Микроорганизмы фекального происхождения при 45 град. С такую реакцию не дают.

После учета черных колоний производят их пересев на молочную среду для дальнейшей идентификации. Для этого петлей переносят колонии в пробирки с молочной средой, которые инкубируют при 44-45 град. С 24 часа.

При развитии клостридий наблюдается образование губчатого сгустка молока, приподнятого кверху, жидкость при этом становится прозрачной, слегка желтоватой.

Для подтверждения наличия клостридий проводят микроскопирование. Обнаружение грамположительных палочек указывает на присутствие клостридий.

Титр устанавливают по максимальному разведению, в котором обнаружены клостридии.

3.3. Определение общего микробного числа (ОМЧ)

Для характеристики общего микробного загрязнения пелоидов определяют численность сапрофитных микроорганизмов, способных расти на мясопептонном агаре при 30 град. С 48-72 часов.

1 мл приготовленных грязевых разведений вносят в стерильные чашки Петри и заливают расплавленным и остуженным до 45 град. С мясо-пептонным агаром в количестве 15-20 мл. Учитывая практический опыт, целесообразно проводить высев из разведений 0,01; 0,001; 0,0001. Посев каждого разведения производят не менее чем на 2 чашки. Содержимое чашки Петри быстро смешивают, равномерно распределяя его по всей поверхности, после застывания агара чашки помещают в термостат и инкубируют при температуре 30 град. С в течение 48-72 часов.

Для подсчета выросших колоний берут такие разведения, при которых на чашках вырастает от 30 до 300 колоний. Если вырастает более 300 колоний, то ведется счет на 1/4 площади чашки с последующим перерасчетом на всю площадь. Из суммы колоний, подсчитанных на всех чашках, выводят среднее арифметическое и затем определяют число колоний на 1 г почвы (с учетом разведений).

Результат можно представить на основании подсчета колоний на одной чашке, если на других чашках:

- рост расплывчатых колоний распространился на всю поверхность чашки;

- число колоний превышает 300;

- при посеве из разбавлений выросло менее 30 колоний.

Если рост расплывчатых колоний распространяется на всю поверхность чашки и подсчет невозможен, то посев проб производят повторно. Чтобы помешать развитию на поверхности агара спорообразующих микробов и бактерий рода Proteus в Н-форме, чашки Петри заливают голодным агаром, расплавленным и остуженным до 45-50 град. С слоем толщиной 3-4 мм.

3.4. Определение стафилококков

Стафилококки объединяются в род Staphylococcus. Это грамположительные кокки, имеющие правильную шаровидную форму, обладающие активной каталазой, ферментирующие глюкозу в анаэробных условиях с выделением кислоты, как правило, образующие пигмент на питательных средах.

S. aureus - потенциально патогенный микроорганизм, отличительным признаком является способность коагулировать плазму крови, ферментировать маннит в анаэробных условиях, обладающий лецитовителлазной активностью. S. epidermidis вегетирует на кожных покровах человека, не являясь болезнетворным, но в отдельных случаях может вызвать септические процессы у ослабленных больных.

Выполнение анализа: к 100 мл основного разведения грязевой болтушки добавляют 10 мл 25-процентного пептона и 10 г хлорида натрия. К 10 мл основного разведения грязевой болтушки добавляют 1 мл 25-процентного пептона и 1 г хлорида натрия. Посевы инкубируют при 37 град. С в течение 24-48 часов. Высев из флаконов и пробирок проводят на молочно-желточно-солевой агар (МЖСА) и инкубируют при 37 град. С в течение 24-48 часов.

Учитывают блестящие выпуклые колонии белого, палевого, золотистого цвета, окруженные радужной с перламутровым блеском зоной, что свидетельствует о наличии лецитовителлазной активности; отмечают пигментообразование, микроскопируют. Далее с МЖСА на скошенный агар снимают в первую очередь колонии стафилококков, образующие радужный венчик, пигментированные колонии с отрицательной лецитовителлазной реакцией. При отсутствии на чашках пигментированных колоний и колоний с положительной лецитовителлазной реакцией для исследования снимают беспигментные колонии, похожие по морфологии на стафилококки. При одновременном наличии на чашках колоний стафилококка, отличающихся по пигменту, следует отсевать не менее двух колоний различного вида.

Для подтверждения принадлежности таких бактерий к S. aureus определяют плазмокоагулазную активность в соответствии с "Методическими рекомендациями по видовой идентификации стафилококков" N 1922-78.

При наличии мелких грамположительных кокков, располагающихся в виде гроздей, способных коагулировать плазму и чаще всего обладающих лецитовителлазной активностью, дают положительный ответ.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

Метициллинрезистентные
Staphylococcus aureus - возбудители
внутрибольничных инфекций:
идентификация и генотипирование

Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus- возбудители внутрибольничных инфекций: идентификация и генотипирование: Методические рекомендации - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006. - 43 с.

1. Область применения. 2

2. Нормативные ссылки. 2

3. Общие сведения. 2

4. Характеристика MRSA как возбудителей внутрибольничных инфекций. 3

4.1. Таксономия и биологические особенности. 3

4.2. Клиническое значение. 4

4.3. Факторы патогенности и вирулентность. 5

4.4. Генетический контроль устойчивости к метициллину и особенности фенотипической экспрессии. 6

4.5. Особенности эпидемиологии MRSA.. 7

5. Лабораторные методы идентификации и типирования MRSA.. 10

5.1. Фенотипические методы.. 10

5.2. Молекулярно-генетический анализ генома MRSA с использованием полимеразной цепной реакции. 12

5.2.1. Обоснование. 12

5.2.2. Оборудование и реактивы.. 13

5.2.3. Вспомогательные методики. 15

5.2.4. Идентификация гена тес А.. 16

5.2.5. Генотипирование. 17

6. Организация эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями, вызванными MRSA.. 20

Библиографические данные. 21

Руководителя Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека

Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus

- возбудители внутрибольничных инфекций:

идентификация и генотипирование

1. Область применения

1.1. В настоящих методических указаниях представлена информация о роли метициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка в возникновении внутрибольничных инфекций, их микробиологических и эпидемиологических особенностях, изложены традиционные и молекулярно-генетические методы идентификации и типирования.

1.2. Методические рекомендации разработаны в помощь специалистам органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, и лечебно-профилактических учреждений, осуществляющих организацию и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий по борьбе с внутрибольничными инфекциями.

2. Нормативные ссылки

2.2. Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации № 554 от 24 июля 2000 г.

2.6. Методические указания по эпидемиологическому надзору за внутрибольничными инфекциями от 02.09.87. № 28-6/34.

В последнее десятилетие проблема внутрибольничных инфекций (ВБИ) приобрела исключительно большое значение для всех стран мира. Это обусловлено, прежде всего, значительным ростом числа госпитальных штаммов микроорганизмов, обладающих устойчивостью к широкому кругу антимикробных препаратов. Несмотря на значительный недоучет, в Российской Федерации ежегодно регистрируется около 30 тыс. случаев внутрибольничных инфекций, при этом минимальный экономический ущерб составляет более 5 млрд. рублей ежегодно. Среди возбудителей ВБИ одно из первых мест, по-прежнему, принадлежит микроорганизмам рода Staphylococcus, наиболее патогенным представителем которого является S.aureus. Эпидемиологическая ситуация осложняется в связи с широким распространением в стационарах, а также появлением и во внебольничной среде, клинических изолятов S.aureus, устойчивых к оксациллину (ORSA или MRSA). MRSA способны вызывать разнообразные клинические формы внутрибольничных инфекций, включая наиболее тяжелые, такие как: бактериемия, пневмония, синдром септического шока, септический артрит, остеомиелит и другие, которые требуют длительного и дорогостоящего лечения. Появление осложнений, вызванных MRSA, приводит к увеличению сроков госпитализации, показателей летальности, значительным экономическим потерям. Показано, что рост частоты ВБИ, наблюдаемый в стационарах различных стран мира, обусловлен распространением эпидемических штаммов MRSA, многие из которых способны вырабатывать пирогенные токсины - суперантигены, подавляющие иммунный ответ на S.aureus.

С конца 90-х годов прошлого века в стационарах России отмечается рост частоты выделения MRSA, которая в ряде больниц достигла 30 - 70 %. Это делает неэффективным использование многих антимикробных препаратов и существенно ухудшает качество оказания медицинской помощи населению. В этих условиях совершенствование методов эпидемиологического и микробиологического мониторингов, направленных на выявление эпидемически значимых штаммов, приобретает все более актуальное значение.

4.1. Таксономия и биологические особенности

4.2. Клиническое значение

В настоящее время MRSA являются ведущими возбудителями внутрибольничных инфекций в стационарах многих странах мира. Частота их выделения в стационарах США, Японии, многих стран Западной Европы достигает 40 - 70 %. Исключение составляют, по-видимому, только ряд скандинавских стран, где исторически были приняты жесткие противоэпидемические меры по контролю за распространением таких штаммов. В стационарах Российской Федерации частота выделения MRSA колеблется от 0 до 89 %. Наибольшая частота выделения отмечается в реанимационных, ожоговых, травматологических и хирургических отделениях стационаров, расположенных в крупных городах. Одной из основных причин этой закономерности является концентрация в таких стационарах пациентов с нарушениями целостности кожных покровов и поврежденными иммунологическими барьерами. Наиболее частым местом локализации инфекции являются послеоперационные и ожоговые раны и дыхательные пути. Первичные и вторичные бактериемии наблюдаются примерно у 20 % инфицированных больных. В случае инфицирования ожоговых больных частота бактериемии нередко возрастает до 50 %. Факторами, способствующими развитию бактериемии, является присутствие центрального венозного катетера, анемия, гипотермия и назальное носительство. Развитие бактериемии значительно увеличивает вероятность летального исхода. Особенно высокая смертность, обусловленная бактериемией, наблюдается среди пациентов, находящихся в ожоговых и отделениях интенсивной терапии, где она может достигать 50 % по сравнению с 15 % в контрольной группе. Риск развития летального исхода возрастает почти в три раза среди пациентов, у которых бактериемия обусловлена MRSA по сравнению с пациентами, инфицированными метициллинчувствительными штаммами S.aureus. Развитие госпитальной бактериемии приводит к значительному увеличению стоимости госпитализации. В современных условиях лечение таких пациентов требует, как правило, внутривенного введения ванкомицина, тейкопланина или линезолида, однако клиническая эффективность этих препаратов нередко оказывается значительно ниже, чем у антибиотиков, используемых для лечения пациентов с осложнениями, вызванными метициллинчувствительными S.aureus. По данным Центра по контролю за заболеваниями (США) средняя продолжительность пребывания пациента в больнице в случае хирургического вмешательства составляет 6,1 дня, тогда как при возникновении осложнений, вызванных MRSA она увеличивается до 29,1 дней, при этом средние расходы возрастают с 29455$ до 92363$ в пересчете на каждый случай. Заболевания, вызванные MRSA, могут начинаться на фоне терапии антибиотиками, в том числе аминогликозидами и цефалоспоринами. В этой связи необходимо отметить, что неадекватное назначение антибиотиков в случае тяжелых ВБИ драматически ухудшает прогноз заболевания. Летальность при осложнениях, вызванных MRSA, значительно колеблется и зависит как от возраста пациента, сопутствующего заболевания (артериальная гипертензия, диабет и др.), так и от присоединения дополнительной микрофлоры. Наиболее распространенными вторичными проявлениями инфекции, обусловленной MRSA, являются эндокардиты, гематогенный остеомиелит, септический артрит. Одним из наиболее грозных осложнений, вызываемых MRSA, является синдром токсического шока (СТШ). Клинические проявления СТШ включают следующий симптомокомплекс: гипертермия, сыпь, рвота, диарея, гипотензия, генерализованный отек, острый респираторный дистресс синдром, полиорганная недостаточность, диссеминированная интраваскулярная коагуляция. СТШ может развиться как осложнение после родов, хирургических вмешательств, при суперинфицировании S.aureus трахеальных повреждений, вызванных вирусом гриппа. Недавно описанные стафилококковая скарлатина и синдром упорной десквамации эпителия рассматривают как варианты СТШ.

4.3. Факторы патогенности и вирулентность

Вопрос о вирулентности MRSA остается дискутабельным. Они практически не вызывают заболевания у здоровых лиц из числа медицинского персонала. Вместе с тем, в многочисленных исследованиях показано, что прогноз при тяжелых формах внутрибольничных инфекций, таких как пневмония и бактериемия, значительно хуже среди пациентов, инфицированных MRSA, по сравнению с пациентами, инфицированными метициллинчувствительными S.aureus.

4.4. Генетический контроль устойчивости к метициллину и особенности фенотипической экспрессии

Мишенью действия b-лактамных антибиотиков (как пенициллинов, так и цефалоспоринов) являются транс- и карбоксипептидазы - ферменты, участвующие в биосинтезе основного компонента клеточной стенки микроорганизмов - пептидогликана. Благодаря своей способности связываться с пенициллином и другими b-лактамами данные ферменты получили название пенициллинсвязывающих белков (ПСБ). У Staphylococcus aureus имеются 4 ПСБ, отличающиеся как по молекулярной массе, так и по функциональной активности. Устойчивость метициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка (MRSA) к b-лактамным антибиотикам обусловлена продукцией дополнительного пенициллинсвязывающего протеина - ПСБ-2?, отсутствующего у чувствительных микроорганизмов. При подавлении В -лактамным антибиотиком активности основных пенициллинсвязывающих белков ПСБ-2?, в силу своего более низкого сродства к препаратам данной группы, продолжает функционировать и сохраняет микробной клетке жизнеспособность. Синтез ПСБ-2? кодируется геном mecA, расположенным на хромосоме S.aureus, в специфической области, обнаруживаемой только у метициллинрезистетных штаммов стафилококка - тес ДНК. МеcДНК представляет новый класс мобильных генетических элементов, который получил название стафилококковая хромосомная кассета тес (Staphylococcal chromosomal cassette тес = SCCmec). Выявлено существование 4 типов SCCmec, различающихся как размерами (от 21 до 66 т.п.н.), так и набором генов, составляющих данные кассеты. Разделение на типы основано на различиях в генах, образующих собственно комлекс тес, и в наборе генов, кодирующих рекомбиназы ссrА и ссrВ, входящих в различных сочетаниях в стафилококковую хромосомную кассету (рис. 1). Комлекс тес может включать: тесА - структурный ген, детерминирующий синтез ПСБ-2?; mecI - регуляторный ген, влияющий на транскрипцию тесА; mecR1 - ген, передающий внутрь клетки сигнал о наличии в среде b-лактамного антибиотика; а также инсерционные последовательности IS431 и IS1272. В настоящее время известны 4 варианта комплекса тес (рис. 2).

Кроме того, различия между типами кассет тес обусловлены присутствием ряда дополнительных генов, расположенных в генетических областях J1а, J1b.

Генетическая структура комплексов тес различных классов

• Класс В, IS431 - mecA-DmecR1-IS1272

• Класс С, IS431 - mecA-DmecR1-IS431

• Класс D, IS431 - mecA-?mecR1

Рис. 2. тесА - структурный ген, детерминирующий синтез ПСБ-2?;

mecI - регуляторный ген, влияющий на транскрипцию тесА;

mecR1 - ген, передающий внутрь клетки сигнал о наличии в среде b-лактамного антибиотика; IS431 и IS1272 - инсерционные последовательности

Уникальность метициллинрезистентности заключается также и в существовании феномена гетерорезистентности, суть которого состоит в том, что в условиях инкубации при 37 °С не все клетки популяции проявляют устойчивость к оксациллину. Генетический контроль феномена гетерорезистентности до настоящего времени полностью не выяснен. Известно только, что на экспрессию устойчивости могут влиять регуляторные гены b-лактамазы, а также ряд дополнительных генов, так называемые fem (factors essential for methicillin resistance) или aux, локализованные в различных частях хромосомы S.aureus, вне SCCmec. Сложность регуляции проявляется в фенотипических различиях. Выделяют 4 стабильных фенотипа (класса) резистентности. Первые три класса являются гетерогенными. Это означает, что в популяциях стафилококков, относящихся к этим классам, присутствуют субпопуляции микробных клеток с разным уровнем резистентности. При этом клоны стафилококков, получаемые из изолированных колоний (образовавшихся при рассеве первичной культуры) по популяционному составу полностью совпадают с исходной культурой.

Класс 1. Рост 99,99 % клеток подавляется оксациллином в концентрации 1,5 - 2 мкг/мл, рост 0,01 % микробов подавляется только при 25,0 мкг/мл.

Класс 2. Рост 99,9 % клеток подавляется при концентрации оксациллина 6,0 - 12,0 мкг/мл, тогда как рост 0,1 % микробов подавляется при концентрации > 25,0 мкг/мл.

Класс 3. Рост 99,0 - 99,9 % клеток подавляется при концентрации 50,0 - 200,0 мкг/мл и только рост 0,1 - 1 % микробной популяции подавляется при концентрации оксациллина 400,0 мкг/мл.

Класс 4. Представители этого класса характеризуются гомогенным уровнем устойчивости, который превышает 400,0 мкг/мл для всей популяции.

В связи с наличием гетерогенности по устойчивости к оксациллину могут возникать трудности при идентификации MRSA традиционными микробиологическими методами.

4.5. Особенности эпидемиологии MRSA

Будучи однажды занесенными в стационар, MRSА могут выживать там в течение длительного времени. Это определяет стратегию противоэпидемических мероприятий: очень важно не допустить занос и распространение в стационаре эпидемических штаммов.

Следует отметить, что периодически происходит смена эпидемического штамма, доминирующего на отдельных территориях. Так, по данным стафилококковой референс-лаборатории в Colindale (London), в 1996 г. штаммы EMRSA-15 и EMRSA-16 были ответственны за более чем 1500 инцидентов, охвативших трех и более пациентов, в 309 больницах Англии, тогда как остальные эпидемические штаммы были ответственны только за 361 инцидент в 93 больницах. Распространение этих эпидемических штаммов привело к росту смертности от MRSA в 15, а частоты бактериемии в 24 раза за период с 1993 по 2002 г.г. согласно данным национального департамента статистики Великобритании.

Продолжает нарастать спектр антибиоткорезистентности эпидемических штаммов MRSA. Они гораздо быстрее, чем метициллинчувствительные, приобретают устойчивость к препаратам из группы фторхинолонов. Характерной чертой многих эпидемических штаммов MRSA является устойчивость практически ко всем известным классам антимикробных препаратов, за исключением гликопептидов и оксазолидинонов. В последние годы участились случаи выделения изолятов MRSA, обладающих умеренной чувствительностью к ванкомицину и даже ванкомицинрезистентных. Распространение таких штаммов в стационарах России может иметь драматические последствия.

С проблемой госпитальных штаммов MRSA тесно переплетается и проблема MRSA вне госпитального происхождения. Эти штаммы пока не обладают множественной резистентностью к антибиотикам, генетически отличаются от госпитальных штаммов, их происхождение остается неизвестным. Предполагается, что они сформировались из спорадических госпитальных штаммов. Внегоспитальные штаммы MRSA способны вызывать некротизирующую форму пневмонии, характеризующуюся крайне тяжелым течением и требующей госпитализации пациента, в связи с чем возникает угроза заноса и распространения таких штаммов в стационарах.

Основные эпидемические штаммы и клоны MRSA

Эпидемические штаммы, идентифицированные в CPHL * (г. Лондон)

Международные клоны, идентифицированные в LMMRU ** (г. Нью-Йорк)

Читайте также:

• Как влияет стафилококк на иммунитет
• Стафилококк у животных передается людям
• Паратиф только один а реферат
• Почему не вылечивается лямблиоз
• Статья в газету по полиомиелиту