Методы посмертной диагностики саркоцистоза у промежуточных хозяев

Для диагностики мышечного саркоцистоза проводится биопсия и исследуются мазки и гистологические срезы очагов поражения. Применяют также методы переваривания мышц с трипсином или микроскопии мышц в компрессориуме с помощью трихинеллоскопа. Для исследования берут мышцы пищевода, сердца, диафрагмы, где саркоцисты локализуются наиболее часто. Перед микроскопией рекомендуют на мышечные срезы нанести но 2—3 капли смеси из равных частей 0,5 % водного раствора метиленового синего и ледяной уксусной кислоты. После 3—5-минутного окрашивания срезы обесцвечиваются, нанося на них 2—3 капли 20—25 % раствора нашатырного спирта. На голубом фоне мышечной ткани саркоцисты имеют темно-синий цвет.

Переваривание мышц с трипсином Фрагмент мышцы измельчают, переносят в коническую колбу соответствующей вместимости и заливают ИЖС в соотношении 1:15. Колбу помещают в термостат при температуре 41 - 42 °С и выдерживают 5 - 7 ч, периодически перемешивая. За 10 мин. до окончания переваривания перемешивание прекращают. После окончания переваривания в осадке остаются хлопья коричневого или темно-коричневого цвета.

Из колбы сливают (осторожно) 2/3 надосадочной жидкости, осадок выливают на сито, установленное в стеклянной воронке, соединенной резиновой трубкой с пробиркой вместимостью 5,0 мл.

Залитый осадок отстаивают 15 - 20 мин., затем резиновую трубку перекрывают зажимом и пробирку отсоединяют. Содержимое пробирки (осадок) переносят по частям на предметное стекло и исследуют под малым (8x10) увеличением микроскопа или трихинеллоскопа на наличие саркоцист.

Микроскопия мышц в компрессориуме: из кусочков мышц изогнутыми ножницами по ходу мышечных волокон делают 24 среза величиной с овсяное зерно, которые помещают в середину клеточки компрессориума, накрывают вторым стеклом и завинчивают винты, раздавливая срезы так, чтобы они стали прозрачными и удобными для их качественного просмотра.

Срезы исследуют под малым увеличением (8x10).

При просмотре срезов обнаруживают саркоцисты, которые имеют собственную оболочку цилиндрической или неправильной формы; циста состоит из камер, внутри которых находятся мерозоиты.

Диагностика пневмоцистоза.

Для обнаружения пневмоцист микроскопируют окрашенные по Романовскому мазки слизи, полученной у детей методом прямой ларингоскопии, катетером — из трахеи или верхних дыхательных путей. Исследуют также окрашенные мазки мокроты или слизи из нижних отделов дыхательных путей, полученных при глубоком откашливании, лучше после предварительной ингаляции водяного пара.

Пневмоцисты могут быть обнаружены не ранее 2-й недели болезни. Прямое микроскопирование мазков не всегда дает положительный результат, так как типичные восьмиядерные цисты обнаруживаются сравнительно редко, а отдельные вегетативные особи не всегда могут быть различимы в препарате, где обычно наблюдается обилие различных клеток и их остатков.

При летальном исходе изучают гистологические срезы и мазки - отпечатки легких. Разработаны серологические методы диагностики пневмоцистоза.

Практическая часть

Дифференциальные признаки, особенности жизненного цикла и лабораторная диагностика токсоплазмоза, саркоцистоза, пневмоцистоза.

Саркоцистозы (саркоспоридиозы) жи­вотных. Характеристика возбудителя. В результате изучения морфологии и биологии саркоцист в последние десять лет установлено, что у саркоцист два хозяина: дефинитивный — собаки, кошки и многие дикие плото­ядные, а также человек, и промежуточный—сельско­хозяйственные, промысловые и дикие животные. В на­стоящее время известно, что у крупного рогатого скота паразитируют три вида саркоцист: Sarcocystis bovi-canis, S. bovifelis, S. bovihominis; у овец два вида: S. ovicanis, S. ovifelis; у свиней два вида: S. suicanis, S, suihominis. Существует еще много других видов

саркоцист у диких животных. У сйркоцист выражена строгая специфичность к видам хозяев.

У дефинитивных хозяев с фекалиями выделяются зрелые ооцисты или чаще спороцисты. Зрелые ооцисты у плотоядных имеют размеры 14,5—20,0 мкм в длину и 10—16,5 мкм в ширину, покрыты тонкой оболочкой, слегка изогнутой внутрь между спороцистами (рис.44). Спороцисты яйцевидной или эллипсоидной формы, раз­меры у разных видов колеблются от 12,4—16,3X7,8— 10,8 мкм и покрыты толстой оболочкой.

У промежуточных хозяев эндогенные стадии сарко­цист (мишеровы мешочки) находят, как правило, в мышечной и редко в соединительной и нервной тка­нях. Цисты в мышцах имеют размеры от микроскопи­ческой величины (микроцисты) до 20 мм (макроци­сты). Форма их разнообразная: овальная, нитевидная, веретеновидная и др. Внутри зрелые цисты разделя­ются на многочисленные камеры, где и формируются мерозоиты банановидной формы величиной от 3,2— 6,5 мкм до 14—17 мкм в зависимости от вида.

Методы диагностики. Эпизоотологические данные. Саркоцистоз разных видов животных ши­роко распространен во всех зонах Союза. Это объясня­ется тем, что саркоцисты в кишечнике дефинитивных хозяев обладают очень высокой репродуктивностью, а спороцисты и ооцисты во внешней среде сохраняются месяцами. Распространению саркоцистоза способствует обитание кошек и собак на животноводческих фермах. Сезонности саркоцистоза у животных не наблюдается.

Собаки и кошки заражаются при поедании инвази-рованного мяса сельскохозяйственных животных, в кото­ром имеются саркоцисты (мишеровы мешочки). В свою очередь, сельскохозяйственные животные заражаются при проглатывании ооцист или спороцист с кормом или водой в любое время года, так как дефинитивные хо­зяева выделяют ооцисты и спороцисты спорулирован-ными.

Симптомы болезни. У молодых собак и ко­шек можно наблюдать отказ от корма, понос, мышеч­ную дрожь, у старых животных каких-либо признаков болезни, как правило, не отмечают.

У сельскохозяйственных животных при спонтанном заражении симптомы изучены слабо. В эксперименте при остром течении повышается температура до 40,5°, уменьшается поедаемость корма, понос, угнетение, у коров снижается удой. При хроническом течении боль­ные животные худеют, слизистые анемичны, появля­ются отеки подчелюстного пространства, одышка, раз­вивается слабость мышц и в последующем парезы и параличи конечностей. Беременные животные аборти­руют.

Микроскопические исследования. У де­финитивных хозяев обнаруживают ооцисты или споро­цисты в фекалиях флотационными методами Дарлин* га, Фюллеборна и др. Под средним или большим уве­личением микроскопа обнаруживают спорулированные ооцисты, но чаще спороцисты. Для точного диагноза исследуют не менее трех раз с промежутком 2—3 дня, так как спороцисты выделяются не ежедневно.

У промежуточных хозяев для прижизненной диа­гностики разработан серологический метод, который в широкой практике пока не используют. Посмертно при визуальном осмотре туш овец можно видеть макроци­сты на пищеводе, величиной от рисового зерна до фа­солины, в скелетных мышцах они встречаются реже. В свиных тушах саркоцисты находятся в мышцах диа­фрагмы, брюшной стенки, межреберных и др. Микро­цисты у всех видов животных можно обнаружить в пробах из мышц сердца, поверхностных туловища, пи­щевода, диафрагмы. Для уточнения диагноза из пробы мышц нарезают кусочки с просяное зерно, раздавлива­ют в компрессориуме и смотрят под малым увеличени­ем микроскопа. Микроцисты лучше видны, если эти кусочки окрасить водными растворами метиленовой сини, генцианвиолета или краской Гимза по Романовскому.

Простой метод окраски предложила А. Г. Кокурина. На мышечные срезы наносят по 2—3 капли смеси, при­готовленной из равных частей 0,5%-ного водного рас­твора метиленовой сини и ледяной уксусной кислоты. После 3—6-минутного окрашивания срезы обесцвечива­ют, нанося на них 2—3 капли 20—25%-ного раствора нашатырного спирта. Затем мышечные срезы сдавли­вают стеклами компрессориума и просматривают при малом увеличении микроскопа. На голубом фоне мы­шечной ткани саркоцисты выглядят темно-синими.

Имеются и другие методы окраски.

Метод люминесцентной микроскопии — с помощью осветителя ОИ-19 и светофильтра УФС-3 в темноте облучают разрезанную поверхность мышц и на их тем­ном фоне обнаруживают саркоцисты, светящиеся оран­жевым цветом.

Дифференциальная диагностика. Трихи­неллы отличаются от саркоцист тем, что у них относи­тельно одинаковый размер капсул — 0,68x0,37 мм. Если капсула свежая, то в ней видна свернутая личинка, если она обызвествленная, надо растворить известь 5—\10%-ным раствором соляной кислоты в течение 1—2 ч, затем поместить в глицерин; после просветления стенки капсулы становится видной спиралевидная ли­чинка трихинеллы.

Цистицерки отличаются от саркоцист тем, что у жи­вых цистицерков через оболочку видна головка, при разрезе цистицерка на сколексе можно увидеть четыре присоски, а в свином мясе около присосок — корону крючьев, при раздавливании крючья могут рассыпать­ся. Обызвествленных цистицерков также надо раство­рить 5—10%-ным раствором соляной кислоты, затем просветлить в глицерине или молочной кислоте и ис­кать присоски и крючья.

Патологоанатомические изменения. У промежуточных хозяев при слабом поражении изме­нения в туше мало заметны. При сильном поражении отмечают истощение, анемичность и гидремичность мышц, серозно-студенистые инфильтраты в подкожной клетчатке, в местах отложения жира. Кровоизлияния в желудочно-кишечном тракте, паренхиматозных ор­ганах.

Саркоцистоз вызывает огромное количество видов из рода Sarcocystis, которые распространены космополитно. Дефинитивные хозяева – Плотоядные и человек, промежуточные хозяева – травоядные, всеядные, грызуны и птицы.

Отдельные виды саркоцист строго специфичны в выборе промежуточного хозяина, поэтому различают большое количество их видов. В дефинитивных хозяевах специфичность не настолько строга и половые стадии проходят и у представителей того же семейства. Поэтому здесь приводятся наиболее значимые представители для кошек и собак, а также для некоторых сельскохозяйственных животных.

Виды, у которых Дефинитивным хозяином является Кошка , в большинстве случаев Непатогенны для промежуточных хозяев.

1. Sarcocystis Gigantea . Промежуточным хозяином являются Овцы. Этот вид образует Макроцисты размером до 2,5 см. Излюбленные места – Пищевод И диафрагма, а при массовой инвазии и вся скелетная мускулатура. В результате видимых изменений возникают экономические потери при оценке качества мяса. Во всех частях макроцист имеется термолабильный токсин белкового характера Саркотоксин (Sarcocystin). Он является весьма патогенным для мышей, воробьёв, кроликов, для остальных животных менее. У людей вызывает острое раздражение желудка.

2. Sarcocystis Hirsuta . Промежуточный хозяин – К. Р.С.

3. Sarcocystis Suifelis . Промежуточный хозяин – Свинья.

Виды, у которых Дефинитивным хозяином является Собака , могут быть Патогенными для молодых И беременных особей.

4. Sarcocystis Arieticanis . Промежуточный хозяин – Овца.

5. Sarcocystis Ovicanis . У этого вида промежуточный хозяин также Овца.

6. Sarcocystis Cruzi . Промежуточный хозяин – К. Р.С. Этот вид типичен тем, что с калом собаки выделяются большие спороцисты. Их размеры 13 – 22 х 9 – 15 μм.

7. Sarcocystis Miescheriana . Промежуточный хозяин – Свинья.

К другим частым промежуточным хозяевам рода Sarcocystis собак и кошек относят Лошадей, коз, мышей, кроликов, фазанов и др.

8. Sarcocystis Lindemanni . Промежуточный хозяин – Человек, дефинитивный хозяин до сих пор неизвестен.

Морфология и цикл развития саркоцист

Морфология и цикл развития

У дефинитивного хозяина протекает кишечная фаза (Гаметогония) и споруляция ооцист происходит уже в кишечнике. В окружающую среду выделяются высвобождённые Спороцисты. Они овальной формы с плотной гладкой оболочкой, содержат 4 продолговатых спорозоита. Размер спороцист чаще всего – 8 – 13 х 6 – 11 μм. Различить отдельные виды саркоцист основаны на их размерах, а также форме выделяемых спороцист. практически невозможно. Единственное исключение составляет Sarcocystis Cruzi, выделяющая большие спороцисты (см. выше).

В поражённой мускулатуре промежуточного хозяина после заражения спороцистами образуются мышечные цисты, так называемые Саркоцисты. Они от веретеновидной до фасолевидной формы и беловатого цвета. В большинстве случаев они микроскопических размеров (Микроцисты), и только у овец существует вид S. Gigantea с цистами размером до 2,5 см (Макроцисты).
Внешняя оболочка тканевой цисты (Pars Periferica) образована характерными выростами (неоднородными, похожими на морскую капусту). Внутренняя оболочка (Pars Interna) образует цисты, в которых расположены цистозоиты банановидной формы размером 12 – 15 х 2 – 4 μм.

Промежуточный хозяин заражается при поедании спороцист, которыми контаминированна вода, продукты и т. п. Через кровь они попадают в органы. Спорозоиты проникают в эндотелий капилляров, где они размножаются Многократной Синхронной эндополигонией, когда внутри материнской клетки образуется огромное количество новых особей. Это неполовое пролиферативное размножение заменяет шизогонию.

Мерозоиты из крови попадают в мышцы и образуют мышечные цисты (Саркоцисты). Они размножаются при помощи Эндодиогонии (см. T. Gondii). Сначала образуются овальные незрелые клетки (Метроциты), которые постепенно переходят в менее типичные банановидные цистозоиты (Брадизоиты). Саркоцисты инвазионно способны для дефинитивного хозяина через 3 месяца более одного года. Дефинитивный хозяин заражается сырым мясом, содержащим зрелые саркоцисты. В тонком кишечнике протекают гаметогония и спорогония. С калом выделяются выспорулировавшие спороцисты или высвободившиеся спороцисты. Цикл развития кокцидий из рода Sarcocystis приведён на рис. 28, а схема развития Sarcocystis Ovicanis рассмотрена на рис. 29.

Кишечная фаза у Дефинитивных хозяев проходит в большинстве случаев Асимптоматически или сопровождается Слабыми поносами. В определённых случаях, чаще всего в результате значительного снижения иммунитета, были обнаружены саркоцисты и в мышцах, головном и спинном мозгу собак и кошек. Первичное иммуносупрессивное заболевание в этих случаях симптоматически перекрывает возможный клинический саркоцистоз.

Если Промежуточным хозяином являются сельскохозяйственные животные (К. Р.С., овцы), то патогенными являются те виды саркоцист, у которых дефинитивным хозяином является собака. Заболевание проявляется особенно у молодых и беременных животных – анемия, лихорадка, исхудание, поносы, аборты. Однако в большинстве случаев течение болезни асимптоматическое.

Если дефинитивным хозяином является собака или кошка, то обнаруживают Спороцисты при микроскопическом исследовании кала.

У промежуточных хозяев обнаруживают Саркоцисты в мышцах методом расщепления, гомогенизации или компрессии. В случае необходимости интравитальной диагностики у собаки как промежуточного хозяина определяют Динамику титра специфических антител методами РНФ, РНГА, ELISA. Серологические методы в данном случае специфичны только для промежуточного хозяина.

Лечение

Собак и кошек лечить нет необходимости. Эффективная терапия для промежуточных хозяев неизвестна. Определённые результаты были достигнуты при даче салиномицина, галофугина, а также окситетрациклина, но такая терапия экономически не выгодна, в случае необходимости лечат только симптоматически.

Учитывая необходимость защиты промежуточного хозяина необходимо Прервать цикл развития и ограничить контаминацию места содержания спороцистами. Плотоядных надо кормить только правильно обработанным мясом (см. T. Gondii).

В завершение этой главы приводятся сравнительные размеры ооцист, которых можно найти при исследовании свежего кала собаки (рис. 30) и кошки (рис. 31).

С точки зрения дифференциальной диагностики необходимо отличить непатогенные ооцисты от ооцист патогенных видов. На основании морфологии это можно сделать только при точном измерении ооцист и тщательном анализе их размеров.

ДИАГНОСТИКА САРКОЦИСТОЗОВ

Она проводится на основании эпизоотологических, клинических, серологических и микроскопических исследований, по данным патоморфологических вскрытий.

Компрессорный метод выявления саркоцист. Для этой цели берут пробы мышц различных органов — пищевода, диафрагмы, сердца, скелетных мышц и из каждой пробы по ходу мышечных волокон вырезают по 4 среза величиной с овсяное зерно (И. И. Вершинин, 1982). Срезы помещают на стекло компрессориума, накрывают вторым стеклом и сдавливают с помощью винтов. После этого микроскопируют при увеличении 7х8.

Препараты можно подкрашивать с помощью раствора краски Романовского-Гимза (2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды) в течение 1 ч. После этого препараты обесцвечивают нашатырным спиртом.

Окрашивать препараты можно и по другой методике. Для этого вначале готовят краску: к 30 мл 10%-ного раствора метиленовой сини добавляют 30 мл 0,01%-ного раствора калийной щелочи и полученную смесь разбавляют поровну дистиллированной водой. Полученной краской можно окрашивать препараты в течение 10 мин с последующим обесцвечиванием 25%-ным раствором аммиака (Г. В. Кононенко, 1968).

Метод А. Г. Какурина (1976, 1978) окраски мышечных срезов состоит в том, что автор на препарат предлагает наносить в течение 10 мин 2-3 капли смеси краски, которую готовят из равных частей 0,5%-ного водного раствора метиленовой сини и ледяной уксусной кислоты. После окраски проводят обесцвечивание срезов 25%-ным раствором нашатырного спирта. Препарат промывают водой и микроскопируют. В препарате саркоцисты выглядят в виде темно-синих образований на голубом фоне мышечной ткани. Существуют и другие методы окрашивания срезов для диагностики саркоцист.

Иногда бывает необходимо провести дифференциацию различных видов у одного и того же промежуточного хозяина. Для этого можно применить метод выделения саркоцист по М. ЕгЪег (1977). Суть его состоит в том, что берут пробу мышц массой 10 г, тщательно измельчают (до 2—3 мм длины), после чего ее помещают в колбу Эрленмейера и приливают туда 50 мл физиологического раствора. Туда же добавляют 8—10 стеклянных бусинок и взбалтывают. Потом суспензию фильтруют через сито с отверстиями диаметром 600—700 мкм в пробирку и центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, а осадок пробирки наносят на предметное стекло и микроскопируют при увеличениях Х160 или Х640.

Для обнаружения мерозоитов наиболее удобным является метод М. Кщаг (1971). Берут 2—5 г мышечной ткани, помещают в фарфоровую ступку, добавляют 1— 2 мл физиологического раствора и тщательно растирают. Затем берут каплю полученной суспензии, помещают ее на обезжиренное предметное стекло, покрывают покровным и микроскопируют при затемненном поле. Мерозои-ты видны в виде банановидных образований.

Для выявления трофозоитов саркоцист мышечной ткани О. В. Рыбалтовский (1971) предложил модифицированный метод переваривания мышц в желудочном соке. Для этого 2—3 г мышечной ткани хорошо измельчают, помещают в плоскодонную колбу и заливают 30 мл искусственного желудочного сока (3 г пепсина, 1 мл концентрированной соляной кислоты и 100 мл воды). Колбу помещают в термостат на 1 ч при температуре 38-40 °С. После этого содержимое колбы фильтруют в пробирки и центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 3 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок помещают на предметные стекла, делают мазки, высушивают их и фиксируют метиловым спиртом. Затем красят 10 мин по Романовскому-Гимза и исследуют под иммерсионной системой микроскопа. Для этих же целей мышцы можно переваривать и трипсином (М. ЕгЪег, 1977), а также использовать для выявления мерозоитов метод выдавливания мясного сока (А. А. Богуш, 1976).

Для прижизненной диагностики саркоцистоза плотоядных применяют методы центрифугирования с использованием флотационных растворов.

Для этого берут пробу фекалий массой 3 г, помещают ее в фарфоровую ступку, доливают в нее 25—30 мл воды и пестиком растирают содержимое. Затем полученную взвесь фильтруют в центрифужную пробирку, центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 3—4 мин. После этого осадок сливают, а к осадку добавляют флотационный раствор (с плотностью более 1,2) и повторно центрифугируют при тех же параметрах. Бактериологической петлей с верхней поверхности жидкости в пробирке снимают 5—6 капель, наносят их на обезжиренное предметное стекло, покрывают покровным и микроскопируют при увеличении Х280 и Х630. При этом в препаратах можно обнаружить спорулирован ные ооцисты и спороцисты саркоспоридий. Ооцисты имеют размер 14,5—20 мкм в длину, 10—15 мкм в ширину. Спороцисты с толстой оболочкой имеют эллипсоидную или яйцевидную форму длиной от 11 до 17 и шириной 7,5—11,6 мкм. Для большей достоверности рекомендуются трехкратные копроcкопические обследования с интервалом в 2—3 дня (Н. И. Степанова, 1982).

Таблица 8. Отличительные особенности саркоспоридий, паразитирующих у сельскохозяйственных животных (И. И. Вершинин, 1982)