Окраска водным фуксином стафилококк

1.Анилиновые красители используются при светлопольной микроскопии для окрашивания микроорганизмов, имеющих клеточное строение, для более качественного наблюдения их морфологии и выявления отдельных субклеточных структур.

В микробиологической практике наиболее часто используются следующие анилиновые красители: I) красные (фуксин основной, фуксин кислый, сафранин, нейтральный красный, конгорот); 2) синие (метиленовый и толуидиновый синие и др.); 3) фиолетовые (генциан фиоле­товый, метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый); 4) желто-коричневые (везувин, хризоидин); 5) зеленые (бриллиантовый зеленый, малахитовый зеленый).

Из перечисленных анилиновых красителей готовят основные насыщенные спиртовые растворы, которые могут храниться длительное время. Для приготовления рабочих растворов основной насыщенный спиртовый раствор красителя разводят дистиллированной водой в соот­ношении 1:10.

2. На чистое предметное стекло нанести каплю воды. Прокаленной и остуженной петлёй захватить очень небольшое количество микробной массы и коснуться ею капли так, чтобы оставить в ней облач­ко помутнения. Прокалить и остудить петлю и, перемешав каплю, раз­мазать ее тонким слоем по стеклу, после чего петлю снова прокалить и поставить в штатив.

Подсушить приготовленный мазок на воздухе. Зафиксировать ма­зок путем проведения нижней стороной через пламя 3-4 раза. Фиксирование считается хорошим, если стекло, приложенное к тыльной поверхности кисти, дает ощущение легкого жжения. При отсутствии та­кого ощущения препарат может смыться, а при ощущении ожога микроскопическая картина будет искажена.

Положить препарат на мостик для окраски мазком вверх и окрасить нужным методом. После окрашивания тщательно промыть препарат водой и обсушить препарат, аккуратно промокая (но не вытирая!) фильтровальной бумагой. Микроскопировать с иммерсионным объективом. Микроскопическую картину зарисовать в тетрадь.

3. Окраска по Граму (в модификации Синева) производят следующим образом. Из исследуемого материала готовят тонкий препарат-мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют на пламени спиртовки.

На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной карболовым раствором генцианвиолета, и увлажняют его 2-3 каплями воды. Окрашивание продолжается 2 мин.

Сбросив пинцетом фильтровальную бумагу, на препарат наливают на 2 мин. раствор Люголя. Слив раствор Люголя, не промывая препарат, наливают на него для обесцвечивания несколько капель 96 ° спирта на 30 сек (обес­цвечивание должно производиться при покачивании стекла).

Быстро смыв спирт водой, препарат докрашивают раствором фук­сина Пфейффера в течение 1-2 мин., после чего промывают водой и высушивают.

Для окраски по Граму на одном стекле готовятся три мазка из разных культур (для контроля). Мазок в середине стекла готовят из изучаемой культуры, а по концам стекла с одной стороны - из куль­туры стафилококка (заведомо грамположительная); а с другой - из культуры кишечной палочки (заведомо грамотрицательная).

Приготовленный таким образом тройной препарат-мазок подсуши­вают на воздухе, фиксируют на пламени спиртовки и окрашивают как один мазок, чтобы соблюсти одинаковые условия. Лишь при правиль­ной окраске контролей (темно-фиолетовый стафилококк и розовая кишечная палочка) можно считать правильной и окраску среднего мазка, то есть изучаемой культуры.

Из трёх культур приготовить на одном стекле мазки, зафиксировать и окрасить по Граму, промикроскопировать под иммерсией и зарисовать.

4. Окраска зерен волютина

Фиксированный мазок окрашивают заранее приготовленной уксуснокислой синькой Нейссера 5 мин. Промывают препарат водой и обра­батывают его раствором Люголя в течение I минуты. Не промывая водой, докрашивают препарат везувином 15 сек. Затем промывают, высу­шивают и микроскопируют. Зерна волютина окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а тело бактерий - в соломенно-желтый цвет.

Фиксированный мазок окрашивают щелочным р-ром метиленового синего, который наносят на 3 - 5 мин., после чего смывают водой, мазок высушивают и микроскопируют. Цитоплазма бактерий окрашивается в голубой цвет, волютиновые зерна – в темно-синий или фиолетовый.

5. Окраска капсул по методу Бурри-Гинса.

На предметное стекло нанести каплю туши, внести в нее неболь­шое количество исследуемой культуры с помощью бактериальной петли, тщательно перемешать. Ребром второго предметного стекла сделать мазок, как для исследования крови. Высушить мазок на воздухе и зафиксировать на пламени спиртовки. Нанести на мазок несколько капель водного фуксина на 2-3 минуты, затем промыть, высушить и промикроскопировать. На фоне туши четко видны окрашенные фуксином бактериальные клетки, окруженные светлым овалом (капсулы). Зарисовать препарат.

6. В препарате "раздавленная капля" споры, обладающие более высоким коэффициентом преломления, выглядят в виде блестящих или темных (в зависимости от фокусировки объектива) образований, отличающихся от более тусклых и неясно очерченных тел бактерий.

При окраске фуксином Пфейффера споры не окрашены и выглядят в виде бесцветных овальных образований, расположенных внутри окрашенных клеток или свободно лежащих между клетками.

Для окраски препарата по способу Клейна фиксированный мазок покрывают фильтровальной бумагой, на бумагу налива­ют карболовый фуксин Циля и подогревают препарат над спиртовкой до появления паров 4-5 раз. Пинцетом снимают бумажку и обесцвечивают препарат, погружая его в стаканчик с 1% -ным раствором серной кислоты на 5-6 сек. Тщательно промывают препарат и дополни­тельно докрашивают метиленовым синим 3-5 мин. Промывают препарат водой, высушивают и микроскопируют. Споры окрашиваются в красный цвет, вегетативные клетки – в синий. Препараты зарисовать.

7. Демонстрация электронограмм ультратонких срезов различных видов бактерии. Определить на электронограммах клеточную стен­ку, цитоплазматическую мембрану, мезосомы, рибосомы и нуклеоид (ядерную вакуоль).

Контрольные вопросы

Какие красители - кислые или основные - чаще применяются при окрашивании бактерий и почему?

Какие основные красители красного, синего, фиолетового и ко­ричневого цвета применяются в микробиологии?

Как готовится концентрированный карболовый раствор основного фуксина и насыщенный раствор метиленового синего?

Какие способы окрашивания микробов Вы знаете?

Из каких последовательных этапов складывается приготовление препарата-мазка?

Для чего необходима фиксация препарата-мазка?

Какие способы фиксации препаратов Вы знаете?

Как производится фиксация на пламени и как контролируется ее качество?

Как определить, на какой стороне стекла находится мазок?

В чем заключается принцип окраски по Граму?

В какой цвет окрашены грамположительные бактерии и почему?

Какова методика окраски по Граму?

Как контролируется правильность окраски по Граму?

Почему зерна волютина окрашенные метиленовым синим, получили название метахроматических?

Какие образования составляют оболочку бактерий?

Что представляют собой цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка и капсула?

Какие включения могут быть в цитоплазме бактерий?

Какую роль играют капсулы у патогенных бактерий?

По каким признакам можно заподозрить наличие капсул в микроб­ной культуре?

Что такое споры бактерий, каковы их свойства?

Как можно заподозрить наличие опор в микробной культуре?

Каковы принципы окраски капсул у бактерии?

Каковы принципы окрашивания спор у бактерий?

С чем связана высокая терморезистентность спор?

Какова структура пептидогликана?

Каковы функции клеточной стенки бактерий?

Каковы функции цитоплазматической мембраны?

Что такое рибосомы?

Чем отличается ядерный аппарат бактерий от ядерного аппарата эукариотов?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 3.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Окраска бактерий в мазках

Методы обнаружения возбудителей в мазках

Окраска метиленовым синим Лефлера

Окраска основным фуксином по Пфейферу

Окраска генциановым или метиловым фиолетовым

Окраска карболовым тионином Николя

Окраска акридиновым оранжевым по Дарту-Тернеру

Окраска по Граму

Окраска по Романовскому-Гимзе

Окраска плазмодиев малярии в мазках по Романовскому-Гимза

Дифференцированная окраска кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза и лепры)

Окраска микобактерий туберкулеза карбол-фуксином по Цилю-Нильсену

Флюоресцентное окрашивание мазков мокроты (метод Хагеманна)

Метод Киньуна (для срезов)

Метод Файта (для срезов)

Серебрение бактерий в мазках - метод Фонтана

Выявление жгутиков и ресничек

Выявление капсул бактерий

Метод Фридлендера (для срезов)

Выявление спор бактерий

Окраска малахитовым зеленым Шеффера-Фултона

Выявление возбудителей сыпного тифа и других риккетсий

Выявление риккетсий в мазках (метод Маккиавелло)

Выявление риккетсий в срезах (метод Ника)

Выявление коринебактерий дифтерии

Выявление возбудителей чумы

Выявление анаэробных спорообразующих бактерий группы клостридий

Выявление возбудителей сибирской язвы

Выявление возбудителей кишечной инфекции

Выявление спирохет и других спиралевидных бактерий

Выявление возбудителей возвратного тифа

В цитологической практике нередко возникает необходимость в окраске и исследовании бактерий. Это чаще всего касается различного рода экссудатов, мазков из различных органов и тканей. Мазки готовят различно. В тех случаях, когда материал жидкий, наносят каплю его на чистое предметное стекло и размазывают, пользуясь краем другого предметного стекла (лучше шлифованного); если материал очень густой (например, гной), то его либо разводят физиологическим раствором и тогда поступают, как в первом случае, либо размазывают тонким слоем по предметному стеклу при помощи петли или стеклянной палочки. Наконец, можно готовить мазки-отпечатки, для чего чистое предметное стекло прикладывают непосредственно к серозному покрову, слизистой оболочке или к свежей поверхности разреза какого-либо органа (ткани). При наличии жидкого содержимого (экссудат, моча и пр.) рекомендуется центрифугировать и из осадка готовить мазки.

Полученные по одному из вышеуказанных способов мазки тщательно высушивают и затем фиксируют сухим жаром. Фиксация достигается посредством несильного нагревания (примерно до 70°С) предметного стекла, которое для этого трижды проводят над пламенем спиртовки мазком вверх. Можно фиксировать мазки и в 96°спирте (10—15 минут).

Фиксированные мазки сохраняются в течение какого угодно времени.

Окрашенные мазки исследуют в масле, с иммерсионным объективом; при желании заключают в бальзам, в таком случае на окрашенный и хорошо высушенный мазок кладут каплю бальзама и покрывают покровным стеклом.

В настоящее время классическую бактериоскопию с окрашиванием микробов различными красителями дополняют получившие широкое распространение иммуноцитохимические методы с применением меченых антител. Во многих случаях (особенно если применяют моноклональные антитела против поверхностных антигенов возбудителя) они позволяют провести высокоспецифичный экспресс-анализ.

Нередко наиболее доступными для исследования с целью идентификации возбудителя являются обработанные в центрифуге экссудаты, выделения, а также - кровь, пунктаты паренхиматозных органов, мазки и отпечатки тканей.

Для обнаружения возбудителей используют различные методы и группы методов.

1. Методы выявления кислых гликозаминогликанов (ГАГ) с помощью ШИК-реакции. Наилучшие результаты получают при выявлении простейших, в частности пневмоцист и токсоплазм, микоплазм, хламидий, некоторых грибов (особенно рода Candida) и капсулообразующих бактерий.

2. Методы с использованием основного фуксина, азура, тионина и метиленового синего (окраски по Пфейферу, Леффлеру, Николя и др.), которые в небольших концентрациях позволяют выявить разную, в основном бактериальную флору- Наиболее эффективны способы окраски по Цилю-Нильсену для выявления спирто- и кислотоустойчивых бактерий, в частности семейства Mycobacteriaceae (микобактерий туберкулеза, лепры и др.) и некоторых простейших (криптоспоридий). Используемые при этом основной фуксин и метиленовый синий позволяют выявить, помимо бактериальной флоры, фуксинофильные внутриклеточные включения, характерные для некоторых вирусных, особенно респираторных, инфекций. Азур и эозин эффективны для выявления различной бактериальной микрофлоры, особенно грамположительной, и некоторых простейших, в частности плазмодия малярии.

3. Методы, основанные на использовании анилинового фиолетового (окраска по Граму и ее модификации), позволяющие выявлять грамположительные бактерии и некоторые грибы, в первую очередь рода Candida. Следует, однако, иметь в виду, что наиболее интенсивно окрашиваются молодые формы. Погибшие или погибающие микроорганизмы утрачивают способность окрашиваться этими методами. В то же время часть грамотрицательных возбудителей, по крайней мере эшерихий, в случае их гибели становятся грамположительными или окрашиваются полихромно.

4. Методы, основанные на импрегнации нитратом серебра кусочков тканей, срезов или мазков, направлены на выявление разной, в основном бактериальной, флоры, поиски которой облегчаются в связи с тем, что импрегнированные серебром микроорганизмы немного увеличиваются в размерах.

Говоря о гистологических срезах, следует отметить, что некоторые микроорганизмы, особенно ДНК-вирусы (семейств Herpesviridae и Adenoviridae) и многие грибы (классов Ascomycetes и Phycomycetes), вполне удовлетворительно окрашиваются гематоксилином. В этом случае использование дополнительных способов окраски из числа перечисленных излишне. Осторожно следует подходить к интерпретации находок при бактериоскопии секционного материала, особенно при поздних вскрытиях, поскольку происходит постмортальная инвазия, а размножение многих видов бактерий происходит даже в предагональном периоде, на что указывают многие авторы.

Окраска метиленовым синим Лефлера

Методика окраски.

Смешивают 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего со 100 мл 0,01 % раствора гидроксида калия. Мазки окрашивают в течение 3 — 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 3 сек в 0,5 % растворе уксусной кислоты и ополаскивают в проточной воде. Проводят через спирты, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Препараты можно изучать при масляной иммерсии без заключения в бальзам, но в этом случае они хранятся недолго.

Результат:бактерии окрашиваются в густо-синий цвет.

Окраска основным фуксином по Пфейферу

Вместо метиленового синего можно воспользоваться карбол-фуксином либо как таковым, либо в разведенном виде (1:10). Окрашивание длится от 15—30 секунд до 2—3 минут, в зависимости от степени разведения перекрашивания допускают дифференцировку 70° спиртом (10—20—30 секунд).

Окраска основным фуксином по Пфейферу. 1 г основного фуксина растворяют в 10—15 мл этилового спирта и смешивают со 100 мл 5 % раствора фенола. Затем 3 капли полученного раствора добавляют к 10 мл дистиллированной, воды и этой смесью окрашивают мазки в течение 30 — 40 мин. После этого ополаскивают водой, дифференцируют 0,1 % раствором соляной кислоты в абсолютном спирте, ополаскивают в абсолютном спирте и заключают в бальзам.

Результат:бактерии окрашиваются в малиново-красный цвет.

1. Приподнимите тубус, снимите препарат.

2. Вытрите масло с объектива чистой тряпочкой.

3. Опустите конденсор.

4. Переведите револьвер в нейтральное положение.

5. Опустите тубус до упора.

6. Поставьте микроскоп в шкаф.

МИКРОБИОЛОГИЯ КАК НАУКА
Бактериоскопический метод исследования. Простые методы окраски

Практические навыки, осваиваемые студентами на занятии:

1. Приготовление мазков и окраска их с применением простого метода.

2. Подготовка предметного стекла к работе (обезжиривание).

3. Приготовление мазка из агаровой культуры стафилококка:

a) окраска приготовленного мазка метиленовым синим;

b) микроскопия под иммерсией;

c) зарисовка препарата в лабораторную тетрадь.

4. Приготовление мазка из бульонной культуры кишечной палочки:

a) окраска приготовленного мазка водным фуксином;

b) микроскопия под иммерсией;

c) зарисовка препарата в лабораторную тетрадь.

Приготовление мазка

1. На обезжиренное предметное стекло нанесите петлей каплю физиологического раствора.

2. В правую руку возьмите бактериологическую петлю.

3. Простерилизуйте петлю:

4. В левую руку возьмите пробирку с культурой.

5. Мизинцем правой руки обхватите пробку и откройте пробирку.

6. Пронесите открытую часть пробирки через пламя спиртовки, прожигая края.

7. Введите петлю в пробирку, охладите ее, касаясь изнутри стенок пробирки.

8. Снимите петлей небольшое количество культуры с поверхности агара (либо сделайте забор материала из жидкой среды).

9. Аккуратно извлеките петлю из пробирки.

10. Пронесите открытую часть пробирки через пламя спиртовки, прожигая края, и закройте пробирку пробкой и поставьте в штатив.

12. Простерилизуйте петлю в пламени и поставьте в штатив.

13. После полного высушиваниямазок фиксируют.

Простые методы окраски

1. После охлаждения предметного стекла нанесите 1-2 капли водного раствора фуксина (для окраски кишечной палочки) или метиленового синего (для окраски стафилококка) на фиксированный мазок (чтобы он был полностью покрыт краской).

2. Окрашивайте в течение 2-3 минут.

3. Смойте краску водой.

4. Просушите препарат фильтровальной бумагой.

Водный раствор фуксина окрашивает микроорганизмы в красный цвет.

Раствор метиленового синего окрашивает микроорганизмы в синий цвет.

МОРФОЛОГИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Окраска по Граму

Практические навыки, осваиваемые студентами на занятии:

1. Приготовление мазка из смеси культур стафилококка и кишечной палочки (см. Занятие №1).

2. Окраска по Граму, микроскопия и зарисовка препарата.

Сложные методы окраски

Алгоритм окраски по Граму

1. На зафиксированный мазок поместите сухую фильтровальную бумагу, пропитанную раствором генцианвиолета.

2. Нанесите на нее 2-3 капли воды так, чтобы бумага хорошо намокла и плотно прилегала к поверхности предметного стекла.

3. Через 2 мин снимите фильтровальную бумагу, слейте остатки красителя в кювету.

4. Нанесите раствор Люголя на 1 мин, слейте в кювету.

5. Обесцвечивание – нанесите на мазок несколько капель спирта на 20 сек.

6. Тщательно промойте препарат водой.

7. Нанесите водный раствор фуксина на 2 мин.

8. Промойте препарат водой.

9. Просушите фильтровальной бумагой.

Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет.

Грамотрицательные микроорганизмы окрашиваются в красный цвет.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ - конструкции, предназначен­ные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОКРОТЫ.

Это этап исследования мокроты включает микроскопию препаратов, окрашенных по Циль-Нильсену для выявления микобактерий туберкулёза (кислотоустойчивых бактерий, КУБ), препаратов, окрашенных по Граму, для изучения микрофлоры мокроты (стрептококки, стафилококки, пневмококки). В последнем случае бактериоскопическое исследование имеет ориентировочное значение. Правильность выявлений этих бактерий всегда подтверждают посевом.

Техника приготовления окрашенных препаратов.

На край предметного стекла кладутся кусочки из мокроты, растираются другим предметным стеклом до гомогенной массы. Препарат должен занимать не более половины стекла, для удобства при приготовлении, фиксации и окраски. Затем препараты высушивают, фиксируют путём троекратного проведения над пламенем горелки и окрашивают.

Для бактериоскопического исследования готовят обычно два препарата: один для обнаружения микобактерий туберкулёза, другой – для обнаружения прочих микроорганизмов. Для первого препарат отбирают частицы, которые были предназначены для микроскопии, для второго – гнойные частицы.

Первый препарат окрашивают по методу Циль-Нильсену, а второй по Граму.

ОКРАСКА ПО ЦИЛЬ-НИЛЬСЕНУ.

1. Карболовый фуксин Циля.

2. 3% солянокислый спирт.

3. Водный 0,5% р-р метиленовой сини.

1. На препарат кладут квадратик фильтровальной бумаги.

2. Наливают р-р карболового фуксина Циля.

3. Препарат нагревают над пламенем горелки до 3-х кратного отхождения пара.

5. Сбрасывают бумажку и опускают препарат в солянокислый спирт для обесцвечивания.

6. Промывают препарат водой.

7. Докрашивают препарат метиленовым синим в течение 20-30 сек.

8. Промывают водой и высушивают на воздухе.

9. Микроскопируют с иммерсионной системой.

Микобактерии туберкулёза окрашиваются в красный цвет , а все остальные элементы - в синий. Микобактерии имеют вид точек, слегка изогнутых, расположенных группами или поодиночке.

Если микобактерий с мокротой выделяется мало, то в обычных мазках их не находят и прибегают к методу накопления (обогащения).

МЕТОД ОБОГАЩЕНИЯ ПО ПОТТЕНДЖЕРУ.

1. 10-15 мл свежевыделенной мокроты помещают в узкогорлую бутылку.

2. Доливают двойным объёмом 0,5% р-ра NaOH или КОН.

3. Смесь энергично встряхивают 10-15 мин.

4. Добавляют 1 мл летучего вещества (ксилола, толуола, бензола) и 100 мл воды.

5. Снова встряхивают 10-15 мин.

6. Доливают дистиллированной воды до горлышка.

7. Оставляют на один час для отстаивания.

8. Верхний беловатый слой (флотационное кольцо) снимают пипеткой по каплям и наносят на предметные стекла, подогретые на воздушной бане до 60 0 С. Каждую новую каплю наносят на высохшую предыдущую.

10. Красят по Циль-Нильсену.

МЕТОД СЕДИМЕНТАЦИИ МОКРОТЫ.

1. 1 часть мокроты смешивается с 2 частями 10% трёхзамещённого фосфорнокислого натрия ( Na ₁₂ H ₂ О).

2. Смесь ставят в термостат на 1 сутки (можно не ставить).

3. Слить надосадочную жидкость.

4. 10 мл надосадочной жидкости центрифугируют при 2000 об/мин в течение 12 мин.

5. Быстро сливают надосадочную жидкость.

6. Из осадка делают препараты, высушивают при Т 90 0 С в течение 30 мин., затем окрашивают по Цилю-Нильсену.

Метод седиментации предпочтительнее, так как при флотации по Поттенджеру образуется аэрозоль, что увеличивает риск заражения мед.персонала.

МЕТОД ОКРАСКИ ПО ГРАМУ.

1. Фуксин Пфейффера.

2. Реактив Люголя.

3. 1% Карболовый раствор генцианового фиолетового.

4. 96 0 этиловый спирт.

1. На фиксированный препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги.

2. Наносят несколько капель 1% карболового раствора.

3. Через 1-2 мин бумажку сбрасывают и на препарат наливают 1-2 капли реактива Люголя.

4. Через 1-2 мин препарат обесцвечивают 96 0 этиловым спиртом.

5. Препарат промываю водой и докрашивают фуксином Пфейффера 10-15 сек.

6. Промывают водой и высушивают.

7. Микроскопируют с иммерсионной системой.

Грамположительные бактерии окрашивают в фиолетовый цвет (синий), а грамотрицательные – в красный цвет.

В препаратах, окрашенных по Граму, обнаруживают пневмококки, стрептококки, стафилококки, актиномицеты и другие микроорганизмы.

Фуксин основной (насыщенный спиртовой раствор)

Фуксин основной кристаллический — 10 г

Этиловый спирт, 96% — 100 мл

Фуксин (10 г) растворяют в 100 мл 96%-го этанола. Раствор может храниться долгое время в бутылке из темного стекла с притертой пробкой.

Фуксин основной, карболовый (фуксин Циля)

Фуксин основной кристаллический — 1 г

Этиловый спирт, 96% — 100 мл

Карболовая кислота (фенол) —5 г

Этиловый спирт, 96% — 10 мл

Дистиллированная вода —100 мл

100 мл 5%-го водного раствора свежеприготовленного фенола при постоянном взбалтывании медленно приливают к 10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина основного (но не наоборот). Приготовленную смесь через 48 ч отфильтровывают через бумажный фильтр и хранят в окрытой бутыли из темного стекла.

Фуксин основной, водный (фуксин Пфейффера)

Карболовый фуксин Циля —10мл

Дистиллированная вода — 90 мл

Готовят из карболового фуксина Циля путем разбавления дистиллированной водой (1 : 10). Водный фуксин нестоек, его готовят непосредственно перед употреблением.

Метиленовый синий (насыщенный спиртовой раствор)

Метиленовый синий — 3 г

Этиловый спирт, 96% — 100 мл

3 г метиленового синего растворяют в 100 мл 96%-го этанола. Раствор выдерживают в течение 2—3 сут, периодически взбалтывая. Затем фильтруют через бумажный фильтр. Раствор устойчив.

Метиленовый синий 7:40

Метиленовый синий (спиртовой насыщенный) — 1 мл

Дистиллированная вода — 40 мл

1 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего смешивают с 40 мл дистиллированной воды.

Метиленовый синий, щелочной раствор (по Леффлеру)

Метиленовый синий (спиртовой насыщенный) — 30мл

Дистиллированная вода —100 мл

КОН (1%-й водный) — 1 мл

К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего и 1 мл 1%-го водного раствора гидроксида калия (КОН).

Метиленовый синий по Финку

Готовят три отдельных раствора: 0,9 г гидрофосфата натрия, 13,6 г дигидрофосфата калия и 0,1 метиленового синего. Каждую навеску отдельно растворяют в 500 мл дистиллированной воды. Смешивают 0,25 мл первого раствора с 99,75 мл второго и 100 мл третьего (pH 4,6).

Карболовый генцианвиолет (генциановый фиолетовый карболовый)

Генциановый фиолетовый (кристаллы) — 1 г

Этиловый спирт, 96% — 10 мл

Карболовая кислота — 5 г

Дистиллированная вода —100 мл

Техника приготовления карболового генцианового фиолетового такая же, как карболового фуксина Циля.

1 г генпианвиолета полностью растворяют в 10 мл 96%-го этанола, смешивают со 100 мл 5%-го водного раствора свежеперегнанного фенола, выдерживают 2-3 сут в термостате, после чего фильтруют через бумажный фильтр.

Приготовление красящих бумажек генцианвиолета (по Синеву)

Для приготовления бумажек фильтровальную бумагу предварительно испытывают на пригодность. Для этого полоску фильтровальной бумаги погружают в спиртовой раствор красителя (карболового генцианового фиолетового), высушивают на воздухе. Хорошая бумага окрашивается равномерно, без пятен. Если небольшой кусок такой бумаги положить на стекло с несколькими каплями воды, она сразу же пропитается водой и краситель через несколько секунд перейдет в раствор. Бумагу для пропитывания нарезают полосками (шириной 2,5—3 см, длиной 30 см) и погружают в краситель так, чтобы смачивались обе поверхности. Затем полоски вынимают, высушивают на воздухе при комнатной температуре или в термостате при 37 °С.

Пропитывать красящиеся бумажки можно также спиртовым раствором генцианвиолета следующего состава:

Генциановый фиолетовый (кристаллы) — 1 г

Спирт этиловый, 96% — 100 мл

10 мл 2,5%-го раствора сафранина в 96%-м этаноле смешивается со 100 мл дистиллированной воды.

Раствор Люголя (в модификации Грама)

В ступку вместимостью 30—50 мл помещают 1 г кристаллического йода и 2 г йодида калия, растирают смесь пестиком, добавляют 1 мл дистиллированной воды, продолжают растирать кристаллы и добавляют еще 5 мл воды. При этом йод растворяется в йодиде калия. Раствор количественно переносят в склянку и доводят общий объем до 300 мл. Раствор годен не более 30 сут, хранят его в прохладном месте, в темноте, лучше в стеклянной посуде оранжевого цвета.

Для окраски фиксированных препаратов применяют 1 —1,5%-е водные растворы, для прижизненной окраски — в разведении от 1 : 10 000 до 1 : 150000. Раствор нестойкий.

Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы

Кристаллический йод — 1 г

Йодид калия — 3 г

Вода дистиллированная — 300 мл

Раствор готовят так же, как и предыдущий.

Для обнаружения гликогена можно также использовать крепкий раствор йода:

Кристаллический йод — 7 г

Йодид калия — 20 г

Вода дистиллированная —100 мл

0,5 г Судана III растворяют в 100 мл 96%-го этанола или концентрированной молочной кислоты.

Раствор туши для выявления капсул

Способ 1. Жидкую натуральную тушь разводят водопроводной водой в соотношении 1 : 3, разливают в пробирки и автоклавируют. Раствор отстаивают в течение 2 нед., после чего тушь готова к употреблению. Способ 2. Смешивают 10 мл жидкой натуральной туши с 90 мл дистиллированной воды. Затем раствор центрифугируют в течение 15—20 мин. Верхний слой переносят в пробирку и автоклавируют в течение 30 мин (0,05 МПа, температура ПО °С). После автоклавирования раствор отстаивают 2 нед, после чего его можно использовать.

0,8 г азура (органическая краска, получаемая из метиленового синего), 11,3 г эозина, 250 мг глицерина и 230 мл метанола. Краски растирают с небольшим количеством глицерина и метанола, затем при помешивании добавляют остальное количество. Перед употреблением 10 капель раствора прибавляют к 10 мл дистиллированной воды.

2 г гематоксилина растворяют в 12 мл абсолютною этанола и смешивают с 200 мл концентрированного водного раствора железо-аммиачных квасцов. Смесь отстаивают 3-4 сут на воздухе и фильтруют. Затем прибавляют 50 г глицерина и 50 г метанола. Смесь выдерживают до получения темной окраски и вновь фильтруют. Перед употреблением краску разбавляют водой.

Эозин (для окрашивания ядер)

1 г эозина растворяют в 100 мл 60%-го этанола и добавляют 20 мл 10%-го раствора формалина.

50 мг янус-грюна растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Раствор 1. К 14,7 г ледяной уксусной кислоты и 15 мл дистиллированной воды прибавляют 1 г сульфаниловой кислоты. Нагревают до растворения и постепенно приливают при помешивании 270 мл воды.

Раствор 2. 0,2 г а-нафтиламина прибавляют к 14,7 г ледяной уксусной кислоты и 25 мл дистиллированной воды. Растворяют при нагревании и приливают при перемешивании 300 мл воды. Растворы смешивают в равных объемах непосредственно перед употреблением.

Раствор бриллиантовой зелени (раствор малахитового зеленого)

Водный насыщенный раствор готовят путем растворения 10 г малахитового зеленого в 10 мл дистиллированной воды. Спиртово-водный раствор: 10 г малахитового зеленого смешивается с 80 мл дистиллированной воды и 20 мл 96%-го этанола.

• 1%-й раствор крахмала
• 1 г растворимого крахмала размешать с 20 мл холодной воды и при постоянном перемешивании добавить к 80 мл кипящей воды. Кипятить 2 мин. Раствор сохранять в холодильнике не более 10-14 сут.

Реактивы для окрашивания жгутиков

Протрава. 12 г таннина растворяют при нагревании в 48 мл дистиллированной воды и к раствору прибавляют 30 мл насыщенного водного раствора железного купороса (сульфат железа FeS0₄) и 6 мл насыщенного спиртового раствора фуксина. Раствор фильтруют и хранят в склянке с притертой пробкой. Протрава готова к употреблению через несколько дней после приготовления и хранится несколько месяцев.

Краситель. Карболовый фуксин Циля и дистиллированная вода в соотношении 1:1. Готовят незадолго перед употреблением.

Перед работой протраву и разбавленный фуксин необходимо профильтровать через складчатый бумажный фильтр.

Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца

Полоски фильтровальной бумаги опускают на 5-10 мин в 5%-й раствор ацетата свинца, высушивают на воздухе и стерилизуют в чашке Петри автоклавированием при 0,05 МПа в течение 20—30 мин.

Реактивы для крахмально-йодной пробы на нитриты

• 1. Хлорид цинка (2 г) растворяют в 10 мл воды, кипятят и добавляют 0,4 г крахмала. Доводят объем до 100 мл и оставляют стоять неделю. Затем раствор фильтруют и добавляют равный обьем 0,2%-го раствора йодида калия.
• 2. Раствор соляной кислоты: 16 мл концентрированной НС1 смешивают с 84 мл воды.

Абсолютный спирт, хлороформ и ледяная уксусная кислота в соотношении 6:3: 1.