Определение чувствительности трихомонад к антибиотикам

Динамика чувствительности влагалищной трихомонады к антипротозойным препаратам

В.Н. Лесовой, А.В. Аркатов, А.В. Kнигавко, В.А. Kривицкий
Харьковский государственный медицинский университет
Харьковский областной клинический центр урологии и нефрологии им. В.И. Шаповала

В статье проанализирована динамика чувствительности влагалищной трихомонады (возбудителя трихомониаза) на протяжении 8 лет (1999-2006), основываясь на данных, предоставленных лабораторией ХОKЦУН у 1472 пациентов, проходивших лечение в андрологическом отделении ХОKЦУН. Выявлено, что за указанный период наблюдается постепенное снижение чувствительности трихомонады к метронидазолу и тинидазолу. Отмечено также снижение чувствительности к орнидазолу, нифурантелу, секнидазолу и нитазолу в последние два года. Снизившаяся до средней в 2002-2004 гг. чувствительность к тенонитразолу вновь выросла до высокой к 2006 г.

Kлючевые слова: трихомониаз, вагинальная трихомонада (ВТ), инфекции, передающиеся половым путем (ИППП), антипротозойные препараты.

The dynamics of sensitivity of Trichomonas Vaginalis to antiprotosoa drugs

The dynamic of the sensitivity of Trichomonas Vaginalis (agent of trichomoniasis) during 8 years (1999-2006) was analyzed in the article on the base of information represented by the laboratory of KhRCCUN of 1472 patients who had taken treatment in andrology department of KhRCCUN. It was revealed that during underlined period decrease of the sensitivity of the agent to metronidazolum and tinidazolum was observed. Also decrease of sensitivity was learned to ornidazolum, nifu-rantel and nimorazol during latest two years. The sensitivity to tenoni-trazol , which had decreased during 2002-2004, increased again to high level in 2006.

Keywords: trichomoniasis, Trichomonas Vaginalis, sexually transmitted infections (STI), antiprotosoa drugs.

На сегодняшний день инфекции, передающиеся половым путем (ИППП), приобрели в Украине эпидемический характер. Этому способствует широкая либерализация сексуальных отношений, раннее вступление подростков в половую жизнь при малой информированности о средствах контрацепции, отсутствие цензуры в СМИ, широкая миграция населения. Kак правило, этиологически ИППП представлены микст-инфекцией, среди которой на первом месте оказывается трихомониаз [1]. Заболеваемость трихомониазом в мире составляет порядка 186 млн. случаев в год, в Украине официальный показатель заболеваемости составляет 1263,7 случая на 100 000 населения, реальный же показатель почти в 5 раз больше и составляет порядка 6% всего населения или 12% населения сексуально активного, репродуктивного возраста [2].

Важными факторами такой обширной заболеваемости трихомониазом в Украине являются высокий процент бессимптомного носительства данного заболевания, а также многочисленные случаи неполной эрадикации возбудителя при его лечении. Возможность перехода влагалищной трихомонады в цистную форму позволяет ей сохраняться в организме даже при проведении полноценного курса терапии [3]. Кроме того, главной проблемой в лечении трихомониаза на первый план сегодня выступает все возрастающая резистентность вагинальной трихомонады (ВТ) к антипротозойным препаратам. Так, согласно исследованиям, проведенным авторами в 1999 году, всего 35% ВТ чувствительны к метронидазолу [4]. Согласно другим исследованиям, всего 55% трихомонад чувствительны к тинидазолу [5]. Соответственно, изучение изменяющейся чувствительности ВТ к современным антипротозойным препаратам является актуальной проблемой лечения трихомониаза и микстных инфекций половых путей.

Целью исследования было изучение динамики чувствительности ВТ к антипротозойным препаратам (АПП) на протяжении последних 10 лет.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

На базе андрологического отделения и клинической лаборатории ХОKЦУН им. В.И. Шаповала было проведено изучение культуральных рассевов трихомонад с подбором чувствительности к антипротозойным средствам у 1472 пациентов, проходивших в дальнейшем лечение в андрологическом отделении. Результаты данного анализа были объединены в группы, в зависимости от года проведенного исследования. Общегодовые градации чувствительности АПП определялись по проценту выявления хорошей чувствительности к препарату (чистая зона более 19 мм вокруг диска или отсутствие возбудителя в чашке с препаратом). Высокой среднегодовой чувствительностью обладал АПП при наличии чувствительности в более чем 75% культуральных рассевов, средний – от 50 до 75%, низкий – менее 50%. Также оценивалась клиническая картина заболевания (клинические анализы крови, мочи, секрета простаты), пациентам проводилось УЗИ в сроки 10-12 и 25-30 дней. Пациентам проводили двукратные контрольные культуральные рассевы на трихомонаду. Также у больных оценивались биохимические показатели (уровни билирубина, аланин- и аспартатаминотранферазы), а также отмечалось самочувствие больных при приеме препаратов и наличие побочных действий трихомонацидных средств.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате исследований мы получили представленные в таблице 1 результаты чувствительности ВТ к антипротозойным препаратам.

Таблица 1. Процент высокой чувствительности ВТ к АПП по годам

Препараты	1999	2000	2001	2002	2003	2004	2005	2006
Метронидазол (Метрогил, Трихопол, Эфлоран)	53,6	50,2	49,8	42,6	39,6	44,3	34,2	35,7
Тинидазол (Тиниба, Фазижин)	73,4	74,1	72,5	67,6	65,3	34,1	58,4	54,6
Нифурантел (Макмирор)	82,1	79,4	76,3	77,6	68,3	64,8	61,4	67,2
Орнидазол (Тиберал, Мератин)	94,5	93,1	92,4	89,1	85,4	79,8	76,5	68,4
Ниморазол (Наксоджин)	86,4	84,3	81,2	75,6	73,4	77,1	65,4	62,4
Тенонитразол (Атрикан)	87,4	81,7	73,6	58,9	56,4	68,4	76,4	82,3

Из приведенных данных видно, что чувствительность к АПП ко всем препаратам планомерно падает с 1997 до 2006 года. При этом чувствительность к метронидазолу и тинидазолу падает со средней до низкой, нифурантела, орнидазола, ниморазола – с высокой до средней. Исключение составляет лишь чувствительность к тенонитразолу, которая с высокой первоначальной (1999-2000 гг.) к 2001 снизилась до средней чувствительности, однако к 2005 г. вновь выросла до высокой, к тому же, вопреки общей тенденции, еще выросла в 2006 г. до 82,3%. Очевидно, это связано с малой назначаемостью тенонитразола в 2001-2004 гг. ввиду падения к нему чувствительности.

В таблице 2 указаны клиническая эффективность (процент эрадикации) и процент побочных действий при применении различных препаратов.

Таблица 2. Суммарная клиническая эффективность и оценка побочных действий препаратов

Препарат	Kлиническая эффективность, % эрадикации	Наиболее часто встречаемые осложнения	Процент побочных явлений
Метронидазол (Метрогил, Трихопол, Эфлоран)	78,3	Тошнота, рвота, болезненность в эпигастрии, в правом подреберье, нарушение аппетита	13,6
Тинидазол (Тиниба, Фазижин)	79,5	Тошнота, рвота, боль в эпигастрии, тяжесть в правом подреберье, нарушение аппетита	19,5
Нифурантел (Макмирор)	83,3	Тошнота	9,4
Орнидазол (Тиберал, Мератин)	89,6	Тошнота, болезненность в эпигастрии, нарушение аппетита	6,9
Ниморазол (Наксоджин)	83,2	Подташнивание	8,1
Тенонитразол (Атрикан)	87,4	Пожелтение склер, пота, мочи	12,2

ВЫВОДЫ

1. За последние 8 лет среди пациентов андрологического отделения ХОKЦУН им. В.И. Шаповала наблюдается снижение чувствительности влагалищной трихомонады к большинству антипротозойных препаратов.
2. Единственный из исследуемых препаратов – тенонитразол (Атрикан) показал высокую чувствительность в 2005 и 2006 гг.
3. Наименьшее количество побочных явлений оказывают препараты орнидазол и ниморазол (6,9 и 8,1% соответственно).
4. Менее тяжелым для организма с точки зрения клинических жалоб и показателей азотистого обмена является тенонитразол, хотя при его приеме зачастую отмечается пожелтение кожи, мочи, пота, реже – склер.

Таким образом, учитывая высокую клиническую эффективность тенонитразола, высокую чувствительность к нему влагалищных трихомонад в последнее время, а также наименее опасные для организма побочные последствия, мы рекомендуем этот препарат для моно- или комбинированной терапии трихомониаза.

ЛИТЕРАТУРА
1. Горпинченко И.И., Гурженко Ю.Н. Хронический уретральный трихомониаз и его комплексное лечение с использованием препарата орнизол (орнидазол). Новости медицины и фармации 2006; 6: 13–14.
2. Kоган Б.Г. Этиотропная терапия хламидийных и трихомонадных уретритов у мужчин. Медицина сегодня 2006; 9: 10.
3. Мавров И.И. Половые болезни: Руководство для врачей. Харьков: Факт; 2002: 557-559.
4. Собольський С.Я., Гнатко О.П., Чубатий А.І. Сучасні підходи до лкування урогенітального трихо-моніазу. Медицина сегодня 2006; 7: 10.
5. Тихомиров А.Л. Тиберал в лечении ЗППП. Урология 1997; 2: 16.

Владельцы патента RU 2406756:

Изобретение относится к области медицины, а именно лабораторной диагностике, и может быть использовано, в частности, для определения чувствительности трихомонад к лекарственным препаратам с последующим подбором их концентраций, необходимых для уничтожения паразита.

В связи с этим имеется настоятельная необходимость шире использовать культуральное исследование чувствительности трихомонад к воздействию применяемых лекарственных препаратов, особенно при хроническом рецидивирующем инфекционном процессе. Использование для этой цели питательной среды с высокими ростовыми показателями, стандартного состава и простотой приготовления, несомненно, приведет к адекватной терапии такого широко распространенного, отягощенного разнообразными осложнениями заболевания, как мочеполовой трихомоноз.

Наиболее близкой по составу к предлагаемой среде является питательная двухфазная среда для выделения трихомонад (патент 2272834 RU). Недостатком имеющейся среды является отсутствие в ее составе противогрибковых препаратов, в то время как грибки достаточно часто встречаются в материале, выделяемом из мочеполовой системы, кроме того, определение чувствительности трихомонад к лекарственным средствам является первоочередной задачей для практического здравоохранения, в то время как имеющаяся среда не предусматривает введение дополнительных компонентов в свой состав.

Технической задачей является определение чувствительности трихомонад к лекарственным препаратам.

Она достигается тем, что на коагулированную сыворотку (твердая фаза) наносится жидкая фаза с лекарственным препаратом выбранной концентрации, воздействие которого на трихомонады планируется изучить.

5 мл среды RPMI-1640

10000-30000 ЕД /мл натриевой соли бензилпенициллина

1000-3000 мкг/мл стрептомицина

30-50 Ед/мл амфоглюкамина

3000-5000 Ед/мл полимиксина М

Предлагаемая питательная среда была апробирована на кафедре молекулярной биологии, генетики и биохимии Астраханского государственного университета на 40 образцах материала от больных в течение 2008 г.

Ниже приводятся результаты апробации.

Для приготовления среды используют компоненты в следующих количествах:

10000 ЕД/мл натриевой соли бензилпенициллина

1000 мкг/мл стрептомицина

30 Ед/мл амфоглюкамина

3000 Ед/мл полимиксина М

Далее в среду вносится лекарственный препарат в исследуемой концентрации, чувствительность трихомонад к которому планируется изучить, например метронидазол 0,1 мг/мл.

Антибиотики стерильно разводят каждый в 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия их и метронидазол асептически вносят в среду RPMI-1640, конечная концентрация метронидазола составила 0,1 мг/мл.

Посев исследуемого материала осуществляют на поверхность коагулированной сыворотки штрихом бактериологической петлей. Затем на сыворотку наслаивают среду RPMI-1640 с антибиотиками и метронидазолом.

В связи с отсутствием чувствительности трихомонад к лекарственному веществу в исследуемой концентрации на границе раздела сред отмечается их обильный рост.

Среду готовят в соответствии с примером 1, но компоненты берут в следующих количествах:

5 мл среды RPMI-1640

20000 ЕД/мл натриевой соли бензилпенициллина

2000 мкг/мл стрептомицина

40 Ед/мл амфоглюкамина

4000 Ед/мл полимиксина М

Далее в среду вносится лекарственный препарат в исследуемой концентрации, чувствительность трихомонад к которому планируется изучить, например макмерур 0,1 мг/мл.

Антибиотики стерильно разводят каждый в 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия их и макмерур асептически вносят в среду RPMI-1640, конечная концентрация макмерура составила 0,1 мг/мл.

Посев исследуемого материала осуществляют на поверхность коагулированной сыворотки штрихом бактериологической петлей. Затем на сыворотку наслаивают среду RPMI-1640 с антибиотиками и макмеруром.

Инкубацию посевов осуществляют при 37°С 24 ч. Концентрацию макмерура нельзя считать достаточной, так как имеет место слабый рост трихомонад.

Среду готовят в соответствии с примером 1, но компоненты берут в следующих количествах:

5 мл среды RPMI-1640

30000 ЕД/мл натриевой соли бензилпенициллина

3000 мкг/мл стрептомицина

50 Ед/мл амфоглюкамина

5000 Ед/мл полимиксина М

Далее в среду вносится лекарственный препарат в исследуемой концентрации, чувствительность трихомонад к которому планируется изучить, например тинидазол 0,1 мг/мл.

Инкубацию посевов осуществляют при 37°С 24 ч. Концентрация тинидазола достаточная, рост трихомонад отсутствует.

При посеве на предлагаемую среду материала от больных рост сопутствующей бактериальной флоры подавляется. В связи с дополнительным введением в среду противогрибковых антибиотиков амфоглюкамина и полимексина М также отсутствует рост грибковой флоры.

В таблице даны результаты испытания предлагаемой среды при различных видах протистоцидного лекарственного вещества в его составе.

Введение в жидкую фазу среды лекарственного препарата позволяет определить его влияние на рост трихомонад. Подбор оптимальной для лечения концентрации выбранного вещества также возможен при использовании предлагаемой среды. Кроме того, дополнительным преимуществом предлагаемой среды является подавление роста грибковой флоры в связи с дополнительным введением противогрибковых препаратов. Таким образом, использование новой среды при подборе лекарственных препаратов значительно повысит эффективность лечения такого широко распространенного и трудно поддающегося терапии заболевания, как трихомоноз.

Изобретение может быть рекомендовано к применению в практическом здравоохранении в венерологических, урологических и андрологических учреждениях, а также в научной работе лабораторий соответствующего профиля.

Подавление роста трихомонад различными лекарственными препаратами с использованием предлагаемой среды.
Лекарственный препарат	Наличие визуального роста
Метронидазол	Обильный рост трихомонал
Макмерур	Слабый рост трихомонал
Тинидазол	Отсутствие роста трихомонад

Лабораторная диагностика

Принципы лабораторной диагностики мочеполового трихомониаза

1. Лабораторные методы исследований

Материалом для паразитологических исследований у женщин служит отделяемое из цервикального канала, смыв из влагалища и осадок мочи; у мужчин — отделяемое из уретры, центрифугат свежевыпущенной мочи, секрет предстательной железы и эякулят.

Накануне обследования женщинам в течение суток не рекомендуется делать спринцеваний. Материал для анализа берется у них со слизистой заднего свода влагалища. В некоторых случаях исследуется отделяемое из цервикального канала.

Мужчинам перед обследованием предлагается в течение 3-4 ч воздерживаться от мочеиспусканий. Материал из уретры у них забирается с глубины 5-7 см специальным зондом или ложкой Фолькмана. Исследуется также секрет предстательной железы и эякулят. Если речь идет о хронической трихомонадной инвазии, накануне исследования рекомендуется сделать провокацию гоновакциной, пирогеналом или неспецифическую (алкогольную).

1.1. Диагностика мочеполового трихомониаза

Диагностика мочеполового трихомониаза проводится путем микроскопии нативных препаратов, а также мазков, окрашенных метиленовым синим, по Романовскому-Гимзе и по модифицированному способу Грама. Для обнаружения трихомонад в нативных препаратах исследуется эякулят, секрет предстательной железы и осадок мочи у мужчин и смыв из влагалища у женщин.

Исследование нативных препаратов

Нативные препараты готовятся и исследуются сразу же после взятия материала. Если это невозможно, материал помещается в питательную среду, обеспечивающую кратковременное сохранение трихомонад, из расчета 1 мл исследуемого материала на 5 мл среды. Материал должен быть доставлен в лабораторию в теплом виде, сроки доставки материала не должны превышать 2 часов.

Для приготовления препарата на предметное стекло наносится капля теплого изотонического раствора хлорида натрия или раствора Рингера-Локка, с которой смешивается исследуемый материал. Взвесь накрывается покровным стеклом и микроскопируется при увеличении объектива 40 и окуляра 7 или 10.

При изучении нативного препарата особое внимание обращается на размеры и форму трихомонад, характер их движения, внутреннее содержимое клеток. В типичных случаях трихомонады обнаруживаются в виде подвижных образований грушевидной, реже овальной формы, размером в среднем от 13 до 17 мкм. Характер их движений толчкообразный. Иногда удается заметить движение свободных жгутиков. Ядра трихомонад чаще не обнаруживаются или плохо различимы. Цитоплазма трихомонад обычно зернистая, чаще вакуолизирована.

Размеры лейкоцитов, имеющих округлую, реже овальную форму, как правило, не превышают 10 мкм. Цитоплазма лейкоцитов прозрачна, зернистость обычно не отмечается или слабо выражена. Сегментоядерные нейтрофилы обычно содержат хорошо различимое сегментированное ядро.

Голые ядра эпителиоцитов отличаются от трихомонад относительно толстой оболочкой (кариолеммой) и иным характером зернистости (отдельные глыбки хроматина). В клетках молодого эпителия, даже если они по размерам соответствуют трихомонадам и обладают зернистостью, всегда прослеживается четко различимое округлое или овальное ядро.

В некоторых случаях обнаруживаются амебоидные формы Т. vaginalis, длина тела которых достигала 30 мкм, а также атипично делящиеся (почкующиеся) клетки. Основными дифференциально-диагностическими критериями, отличающими атипичных трихомонад от клеток эпителия и лейкоцитов, служат наличие в цитоплазме этих простейших выраженной зернистости и вакуолей, а также отсутствие хорошо различимого ядра. Кроме того, они значительно крупнее, чем наиболее часто встречающиеся форменные элементы — сегментоядерные нейтрофилы. По размеру такие трихомонады могут быть сопоставимы с моноцитами, которые, в отличие от них, имеют четко выраженное ядро и никогда не встречаются в значительных концентрациях (несколько клеток в каждом поле зрения). При отсутствии типичных форм клеток трихомонад диагноз трихомониаза может считаться лишь предположительным и должен подтверждаться другими методами.

Окраска метиленовым синим

Готовится 1% водный раствор метиленового синего. Высушенный на воздухе мазок фиксируется в течение 3 мин 96% этиловым спиртом, высушивается, после чего на него наносили на 1 мин раствор метиленового синего. Оставшийся краситель осторожно смывается слабой струей холодной воды и мазок высушивается.

Трихомонады в препарате имеют округлую или овальную форму, с интенсивно окрашенными в синий цвет ядрами; цитоплазма клеток светло-синяя, с нежной сетчатой структурой, вакуоли — бесцветны.

Окраска по Романовскому-Гимзе

Высушенный на воздухе мазок фиксируется смесью Никифорова (абсолютный этиловый спирт и эфир в соотношении 1 : 1). Раствор краски Романовского (азур-эозин) перед употреблением разводится дистиллированной водой в соотношении 0,3 мл на 10 мл воды и пипеткой наносится на горизонтально расположенные препараты на 30-40 минут. Затем они быстро промываются водой и высушиваются.

В окрашенных препаратах трихомонады имеют эксцентрично расположенное овальное пурпурно-фиолетовое ядро. Цитоплазма клеток окрашивается в светло-синий цвет, вакуоли остаются бесцветными, оболочка клеток четко заметна.

Окраска по модифицированному способу Грама

Для окраски используются следующие реактивы:

1. 1% раствор генцианвиолета (1 г генцианвиолета растворяется в 100 мл кипящей дистиллированной воды, полученный раствор пропускается в горячем виде через бумажный фильтр).

2. Водный раствор Люголя (2 г калия йодида растворяется в 300 мл дистиллированной воды, к полученному раствору добавляется 1 г чистого йода, после чего раствор фильтруется через бумаж ный фильтр).

3. 3,96% этиловый спирт.

4. 1% водный раствор нейтрального красного (1 г нейтрального красного растворяется в 100 мл дистиллированной воды и пропускается через бумажный фильтр).

Препарат накрывается полоской фильтровальной бумаги и заливается раствором генцианвиолета на 1-2 мин, после чего бумага снимается, препарат осторожно промывается водопроводной водой и на несколько секунд заливается раствором Люголя (до почернения мазка). Остаток раствора смывается, препарат обесцвечивается в 96% этиловом спирте до тех пор, пока с тонких участков препарата перестают стекать фиолетовые струйки. После смывания спирта водой препарат сразу же докрашивается в течение 3 мин раствором нейтрального красного, затем тщательно промывается и высушивается.

При микроскопии окрашенных мазков ядра клеток T. vaginalis окрашиваются в фиолетовый цвет, цитоплазма — в красно-оранжевый цвет разной интенсивности. Метод окраски по Граму позволяет также диагностировать гонорею. В некоторых случаях для подтверждения диагноза трихомониаза используется ПЦР и культуральный метод.

Нами Т. vaginalis выращивается на питательной среде СДС-199 М (Захаркив Ю. Ф. и др., 1998), которая имеет следующий состав:

1) 100 мл солевого раствора (натрия хлорида 6,5 г, калия хлорида 0,14 г, кальция хлорида 0,12 г, натрия бикарбоната 0,2 г, 0,5 мл 0,2% раствора метиленового синего, дистиллированной воды до 1 л);

2) 20 мл среды 199;

3) 450 мг солянокислого цистеина;

4) 30 мл сыворотки крови эмбрионов телят (без консерванта);

5) 10 мл 20% раствора мальтозы;

6) тиамина хлорида 5% и пиридоксина гидрохлорида 5% по 0,25 мл и аскорбиновой кислоты 5% — 0,5 мл на 100 мл среды;

7) ампициллина натриевой соли 125 000 ЕД и гентамицина 40 000 ЕД на 100 мл среды.

Солевой раствор автоклавируется при 120°С в течение 30 минут, остальные ингредиенты добавляются стерильно после охлаждения среды. Антибиотики и витамины добавляются в питательную среду непосредственно перед использованием. Среда должна быть светло-зеленого цвета, прозрачной; показатель рН среды должен составлять 5,5-6,0.

Питательная среда объемом 4,5 мл помещается в стерильные пробирки и заливается слоем стерильного вазелинового масла толщиной 5 мм для создания анаэробных условий культивирования трихомонад. Посев производится пастеровской пипеткой путем помещения 0,5-1,0 мл исследуемого материала на дно пробирок.

Микроскопическое исследование производится через 48 и 96 часов после посева. При положительных результатах трихомонады дают придонный рост в виде плотного беловатого осадка, из которого пастеровской пипеткой берется материал для микроскопического исследования.

2. Определение чувствительности Тrichomonas vaginalis к метронидазолу

В 1962 году S. Squires and J. A. Fadzean для определения чувствительности Т. vaginalis предложили метод серийных разведений метронидазола в жидкой питательной среде в анаэробных условиях. В качестве критерия оценки чувствительности они использовали минимальную ингибирующую концентрацию (MIC), под которой понимали наименьшую концентрацию препарата, вызывающую иммобилизацию у 100% клеток трихомонад. С помощью указанной методики авторам удалось показать, что все изученные ими штаммы Т. vaginalis, выделенные от больных трихомониазом, были чувствительны к метронидазолу в диапазоне концентраций препарата от 0,25 до 1 мкг/мл.

В 90-х гг. появились работы, свидетельствующие о возникновении и распространении штаммов Т. vaginalis, устойчивых к значительно более высоким концентрациям метронидазола: 50 мкг/мл (Вorchardt K. A. et al., 1995), 32 мкг/мл (Debbia E. A. et al., 1996) и даже 250 мкг/мл (Тaru Meri I. T. et al., 1999). Тогда же было обосновано положение о том, что чувствительными к действию метронидазола в анаэробных условиях штаммами Т. vaginalis следует считать лишь те, для которых паразитоцидный эффект препарата наблюдается в концентрации более чем 15 мкг/мл (Muller М. et al., 1986, 1988; Тaru Meri I. T. et al., 1999). Процент резистентных к метронидазолу штаммов Т. vaginalis, выделенных в эти годы от больных трихомониаз ом, колебался от 5% (Narcisi E. M., Secor W. E., 1996) до 20% (Du Bouchet L. et al., 1997).

2.1. Определение чувствительности Тrichomonas vaginalis к антипротозойным препаратам in vitro при использовании критерия иммобилизации трихомонад

Чувствительность штаммов Т. vaginalis к метронидазолу определяется с помощью метода серийных разведений препарата в питательной среде СДС-199 М. При использовании критерия оценки чувствительности штаммы Т. vaginalis, используемые для исследования, должны содержать не менее 90% подвижных клеток.

Среда заливается по 4,0 мл в стерильные пробирки, затем в них вносится 0,5 мл раствора, содержащего разные концентрации метронидазола (или другого антипротозойного препарата): от 0,25 до 1000 мкг/мл (1 мг/мл).

После этого в пробирки вносится 0,5 мл культуры возбудителя с заранее определенной концентрацией клеток (кл./мл). Контролем служит среда без препарата. Затем для создания анаэробных условий, необходимых для культивирования Т. vaginalis, в пробирки со средой вносится вазелиновое масло (толщина слоя — 0,5 мм). Пробирки с исследуемым материалом инкубируются в термостате при t = 37°С. Учет результатов производится через 48 и 96 часов после посева.

Чувствительность трихомонад к метронидазолу оценивается путем определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC), вызывающей иммобилизацию всех клеток Т. vaginalis. К лекарственно-устойчивым относятся штаммы, у которых иммобилизация обнаруживается при концентрациях метронидазола (или другого антипротозойного препарата), превышающих 15 мкг/мл.

2.2. Определение чувствительности Тrichomonas vaginalis к антипротозойным средствам in vitro при использовании критерия лизиса трихомонад при терапевтически эффективных концентрациях препаратов

В связи с широким распространением штаммов Т. vaginalis, устойчивых к метронидазолу, особенно среди больных хроническим мочеполовым трихомониазом, а также высокой частотой встречаемости амастиготных клеток, мы предлагаем оценивать чувствительность трихомонад к широкому спектру антипротозойных препаратов (производным 5-нитроимидазола пролонгированного типа действия (тинидазол, ниморазол, орнидазол и секнидазол), 4-аминохинолина (хлорохин, син. делагил) и нитрофурана (нифуратель, син. макмирор)) на основе оценки лизиса клеток трихомонад.

К высокоустойчивым (RIII) относятся штаммы, концентрация клеток которых в опытных пробирках с антипротозойным препаратом составляла не менее 50% по сравнению с контролем; к умеренно устойчивым (RII) — от 25 до 50%, к низкоустойчивым (RI) — менее 25%. Воздействие препарата считается оптимальным при лизисе всех клеток трихомонад; в этом случае штамм относится к чувствительным (S). По нашему мнению, именно такой подход позволяет подобрать препарат или комбинацию препаратов для назначения рациональной схемы этиотропной терапии.

2.3. Определение чувствительности Тrichomonas vaginalis к метронидазолу in vivo и текущий контроль эффективности этиотропной терапии

Определение чувствительности Т. vaginalis к метронидазолу in vivo проводится с помощью метода, основанного на установлении сроков исчезновения паразитов из исследуемого материала у больных трихомониазом на фоне этиотропной терапии. Паразитологические исследования материала проводят на 1,3, 5 и 7-й дни с момента начала лечения. Лекарственно-чувствительными считаются штаммы, которые перестают выделяться от больных на 2-5-е сутки с момента начала этиотропной терапии.

Махлай Н.С., Березина Л.А., Вербов В.Н., Закревская А.В., Жебрун А.Б.

• ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, Санкт-Петербург.

Цель. Разработка тест-системы для определения чувствительности Trichomonas vaginalis к препаратам групп 5-нитроимидазола и 5-нитрофурана.

Материалы и методы. Определение минимальных цидных концентраций (МЦК) противопротозойных препаратов проводили при культивировании лабораторных штаммов Т.vaginalis в лунках планшетов с питательной средой, содержащей различные концентрации этих препаратов. Оценку жизнеспособности возбудителя определяли с помощью витальной окраски трипановым синим и по способности к последующему росту на питательной среде без добавления противопротозойных препаратов. Конструирование тест-системы проводили путем подбора условий для фиксации препаратов в лунках планшетов и контроля сохранения активности после фиксации. Для апробации тест-системы использовали 109 изолятов, выделенных от больных с подтвержденным диагнозом трихомониаз.

Результаты. При культивировании десяти лабораторных штаммов было показано, что МЦК исследуемых препаратов имели следующие значение мкг/мл: метронидазол 5, тинидазол 1,25 мкг/мл, секнидазол 2,5 мкг/мл, ниморазол 1,25 мкг/мл, орнидазол 2,5 мкг/мл, клотримазол 15 мкг/мл, нифуратель 1,25 мкг/мл. При исследовании клинического материала была выявлена однотипная чувствительность штаммов, выделенных при остром трихомониазе, и различная - при хроническом, при этом один штамм обладал множественной устойчивостью.

Заключение. Разработана простая и доступная для рутинной лабораторной работы тест-система для определения чувствительности T.vaginalis к препаратам групп 5-нитроимидазола и 5-нитрофурана. Эффективность теста обеспечивает высокую чувствительность, воспроизводимость и меньшую длительность процедуры по сравнению с классическим методом, что позволяет с наибольшей вероятностью подобрать препарат для терапии. Изучено применение этой тест-системы для определения чувствительности изолятов, выделенных при остром и при хроническом трихомониазе.

Ключевые слова: Trichomonas vaginalis, тест, 5-нитроимидазолы, 5-нитрофураны, чувствительность.

Development and application of a test for sensitivity evaluation of trichomonas vaginalis to nitroimidazoles and nitrofurans

N.S. Makhlay, L.A. Berezina, V.N. Verbov, A.V. Zakrevskaya, A.B. Zhebrun.

• Pasteur Institute of Epidemiology and Microbiology, St.Petersburg, Russia.

Aim. To develop a test for determining the Trichomonas vaginalis sensitivity to 5-nitroimidazole and 5-nitrofuran derivatives.

Materials and methods. Determination of minimal lethal concentrations (MLC) of anti-protozoa drugs was carried out by culturing T.vaginalis strains in wells with medium containing various concentrations of these drugs. The viability evaluation of the pathogen was determined by vital staining with trypan blue and by the ability to subsequent growth in medium without adding drugs. Designing the test was performed by adjusting conditions for drugs fixation in plates wells and control the activity preservation after it. 109 isolates from patients who had been confirmed of having trichomoniasis were used for approbation of the test.

Results. During the cultivation of ten strains T.vaginalis it was shown that MLC of studied drugs were as follows µg/ml: metronidazole 5 µg/ml, tinidazole 1,25 µg/ml, seknidazol 2,5 µg/ml, nimorazol 1,25 µg/ml, ornidazole 2,5 µg/ml, clotrimazole 15 µg/ml and nifuratel 1,25 µg/ml. In the study with clinical samples it was shown similar sensitivity of strains isolated from patients with acute infection and variable sensitivity of strains isolated from patients with chronicle infection. One strain possessed a multiple resistance.

Conclusion. A simple and practical test for routine laboratory work was designed for screening T.vaginalis sensitivity to 5-nitroimidazole and 5-nitrofuran derivatives. The performance of the test provides high sensitivity and reproducibility, less time consuming compared with classic method, making it more suitable for selection therapy. The application of this test for determining the sensitivity of isolates in acute and chronic trichomoniasis was studied.

Key words: Trichomonas vaginalis, test, 5-nitroimidazole, 5-nitrofuran, sensitivity.

Введение

Традиционная специфическая терапия трихомониаза заключается в применении препаратов группы 5-нитроимидазола (5-НИМЗ), обладающих высокой активностью в отношении Protozoa. Все эти препараты имеют нитрогруппу в положении 5-го имидазольного цикла и практически не различаются между собой по степени и спектру антипротозойной активности [1]. Механизм действия этих препаратов основан на их проникновении в клетку путем диффузии, восстановлении нитрогруппы в гидрогеносомах с участием пируват-ферредоксин оксидоредуктазы и образовании свободных нитрит радикалов, которые повреждают цепи ДНК, вызывая гибель простейшего в течение 8 часов. Хотя однотипный механизм действия обуславливает возможность развития перекрестной резистентности трихомонад к 5-НИMЗ, она, тем не менее, является неполной и выявляется относительно редко [6].

Первый представитель этого ряда - метронидазол был синтезирован в 50-х годах прошлого века и уже в 60-х его стали использовать для лечения трихомонадной инфекции [2]. Также широкое применение в медицинской практике получили тинидазол и орнидазол. В значительной степени интерес к этим препаратам связан с их достаточно хорошей переносимостью и хорошими фармакокинетическими свойствами. Например, тинидазол имеет более длительный период полувыведения, чем метронидазол и его концентрация в вагинальных выделениях близка к концентрации в сыворотке, что говорит о лучшей биодоступности тинидазола в этой области. Перекрестная устойчивость тинидазола с метронидазолом является неполной, при этом его минимальная цидная концентрация (МЦК) ниже чем у метронидазола [4].

Орнидазол и секнидазол также имеют по сравнению с метронидазолом более длительный период полувыведения. Ниморазол, напротив, элиминируется быстрее. Тем не менее препарат обладает выраженной антипротозойной активностью, поскольку два его основных метаболита более активны, чем метаболиты метронидазола [3].

Все эти препарата зарегистрированы и разрешены для медицинского применения в России.

Неэффективность терапии урогенитального трихомониаза может быть обусловлена целым рядом факторов, связанных с особенностями как макро, так и микроорганизмов. К числу наиболее частых причин неэффективности лечения большинство авторов относят недостаточно высокую комплаентность пациентов и реинфекцию, хотя в отдельных статьях ведущее место отводится резистентности Т.vaginalis к метронидазолу. Среди других возможных причин неудачного лечения указывают недостаточную абсорбцию препарата в желудочно-кишечном тракте, низкую степень его доставки в урогенитальные органы, инактивацию микрофлорой влагалища, а также низкую концентрацию цинка в плазме крови [1].

Первые случаи резистентности Т.vaginalis к метронидазолу были зарегистрированы в 1962 г [6]. По нашим данным, полученным при тестировании 865 клинических штаммов Т. vaginalis, выделенных в 2006-2009 гг., резистентность к метронидазолу была выявлена у 8,1 % изолятов.

В последние годы актуальна также другая группа этиотропных средств - препараты 5-нитрофурана (5-НИТФ), в частности нифуратель. Нитрофураны в качестве монотерапии обычно используют в тех случаях, когда лечение 5-нитроимидазолами невозможно, например, в случаях имеющейся гиперчувствительности.

В настоящее время назначение лечения производят в соответствии с протоколом ведения больных урогенитальным трихомониазом (утв. МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РФ 14.01.2005). Этот документ не регламентирует проведение предварительного подбора препарата in vitro для каждого штамма. Вероятно, следствием такого подхода является высокая частота случаев неэффективного лечения и хронизации заболевания.

Несмотря на существование проблемы, связанной с подбором наиболее подходящего для каждого пациента препарата, в настоящее время не существует доступной для широкой практики тест-системы, позволяющей определять чувствительность Т.vaginalis к антипротозойным препаратам in vitro.

Для определения чувствительности Т.vaginalis к различным лекарственным средствам используют метод серийных разведений. Суть метода заключается в приготовлении серийных разведений лекарственного средства в жидкой питательной среде (контроль - среда без лекарственного средства). Затем в каждую пробирку со средой вносят одинаковую концентрацию культуры исследуемого штамма Т.vaginalis и после инкубации в течение 48-72 часов микроскопически определяют наличие живых форм возбудителя в каждой пробирке. Этот метод трудоемок и имеет высокую стоимость.

В данной работе представлены результаты разработки и применения тест-системы для определения чувствительности Т.vaginalis к противопротозойным препаратам.

Штаммы Т.vaginalis Pr001, Pr002, Pr004, Pr005, Pr006, Pr007, Pr011, Pr027 были получены из Городского кожно-венерологического диспансера (г. Санкт-Петербург). Перед проведением исследования культуры выращивали на питательной среде для выявления трихомонад - СВТ (№ ФСР 2009/05982) и использовали при достижении логарифмической фазы роста. Микроскопию нативных препаратов проводили при помощи устройства для микробиологических исследований - гребенка (номер заявки 2010124024 от 11.06.2010 г.). Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Было исследовано 109 штаммов Т.vaginalis, выделенных от больных с установленным диагнозом трихомониаз. Диагноз был установлен на основе культурального исследования на питательной среде СВТ, а также ПЦР-РТ с использованием набора фирмы ИнтерЛабСервис (№ ФС 01262006/5190-06) на приборе АНК-32. При этом 10 штаммов (группа А), было выделено от больных с острой формой инфекции и 99 штаммов (группа Б) - от пациентов с хронической формой урогенитального трихомониаза.

Использовали субстанции следующих противопротозойных препаратов: метронидазол, тинидазол, орнидазол, клотримазол производства Sigma-Aldrich (USA) и секнидазол, ниморазол, нифуратель производства Zxchem (China). Для приготовления исходных растворов препаратов с концентрацией 1 мг/мл в качестве растворителя использовали демитилсульфоксид (ДМСО). Рабочие растворы готовили последовательным разведением исходных растворов в питательной среде СВТ.

Разработка тест-системы для определения чувствительности T.vaginalis. С целью создания тест-системы был решен ряд практических задач: при использовании лабораторных штаммов было определено оптимальное время культивирования в лунках планшетов и выбрана посевная доза заражающего материала, что позволило стандартизировать при последующих опытах основные условия проведения анализа. Было установлено, что максимальный прирост биомассы происходит через 48 часов культивирования при посевной дозе заражающего материала 5 х 10 4 кл/мл (рис. 1).

Рисунок 1

Для определения МЦК противопротозойных препаратов проводили культивирование штаммов Т.vaginalis в питательной среде, содержащей различные концентрации этих препаратов. При определении МЦК, под которой понимали наименьшую концентрацию препарата, вызывающую гибель 100% клеток трихомонад, использовали два критерия: оценку жизнеспособности возбудителя по методу витальной окраски трипановым синим и способность штаммов к последующему росту в питательной среде СВТ без добавления противопротозойных препаратов. Одновременно проводили определение МЦК традиционным методом последовательных разведений препаратов в пробирке [5] и были получены идентичные результаты.

Определение МЦК описанных выше препаратов позволило выбрать их рабочие концентрации. МЦК для исследованных препаратов имеют следующие значения: КТЗ - 15 мкг/мл, МТЗ - 5 мкг/мл, СКЗ - 2,5 мкг/мл, ОРЗ - 2,5 мкг/мл, НМЗ - 1,25 мкг/мл, ТНЗ - 1,25 мкг/мл и НФТ - 1,25 мкг/мл.

Для исследования сохранения активности препаратов в выбранных МЦК проводили их фиксацию в лунках полистироловых планшетов в течение 24 часов при температуре 50 °С в вакуумном сушильном шкафу. Сохранение активность высушенных препаратов оценивали при сравнении их способности оказывать цидное действие на штаммы Т.vaginalis до и после фиксации.

На следующем этапе было проведено определение срока хранения стрипов с фиксированными противопротозойными препаратами методом "ускоренного старения". При этом было показано, что срок хранения таких стрипов без потери активности зафиксированных в лунках препаратов составляет 13 месяцев.

Таким образом, в состав разработанной тест-системы для определения чувствительности T.vaginalis к противопротозойным препаратам входят следующие компоненты:

• питательная среда для выявления T.vaginalis;
• стрипы с сорбированными противопротозойными препаратами;
• пленки для заклеивания стрипов;
• гребенки для микроскопии.

Рисунок 2

Схема расположения противопротозойных препаратов и контроля в лунках стрипа и помещения гребенки в лунки стрипа: а - устройство для микроскопии, б - стрип с фиксированными препаратами (К - контроль, НФТ - нифуратель, КТЗ - клотримазол, СКЗ - секнидазол, ОРЗ - орнидазол, НМЗ - ниморазол, ТНЗ - тинидазол. МТЗ - метронидазол).

Апробация тест-системы. Проводили в лаборатории иммунология ФГУН НИИЭМ имени Пастера, где для проведения исследования чувствительности к противопротозойным препаратам первоначально осуществляли накопление выделенных изолятов на питательной среде СВТ до концентрации 10 5 кл/мл. После этого готовили инокулят путем суспензирования осадка в 0,5 мл свежей питательной среды СВТ. Для проведения исследования из набора брали стрипы с фиксированными противопроозойными препаратами и устанавливали их в рамку-держатель. Во все лунки (рис. 2б) вносили прогретую до 37 °С питательную среду СВТ и приготовленный инокулят, который перед внесением перемешивали пипетированием. Стрип заклеивали пленкой и помещали в термостат при температуре 37 °С.

Учет результатов проводили через 48 часов. Для этого содержимое лунок перемешивали при помощи многоканальной пипетки, а затем в лунки стрипа погружали зубцы гребенки (рис. 2а). Первоначально просматривали зубец-контроль на наличие клеток T.vaginalis, затем все остальные зубцы. При отсутствии живых форм T.vaginalis в лунке с препаратом штамм оценивали как чувствительный. При наличии живых форм T.vaginalis в лунке с препаратом штамм оценивали как резистентный.

Таблица 1.

Обозначения: R - резистентный, S - устойчивый.

Полученные результаты представлены в таблице 1. Из всех изолятов группы А только один обладал резистентностью к клотримазолу и ниморазолу. Напротив, значительная часть штаммов группы Б была устойчива к метронидазолу и другим лекарственным средствам, при этом один изолят обладал резистентностью сразу к четырем препаратам.

Разработана тест-система для определения чувствительности T.vaginalis к широкому спектру противопротозойных препаратов. Тест-система основана на простом и доступном для рутинной лабораторной работы методе. Эффективность метода обеспечивает 95 % чувствительности и 99 % воспроизводимости, что позволяет с наибольшей вероятностью подобрать препарат для терапии.

Разработанная тест-система принципиально отличается от существующего способа определения чувствительности тем, что отсутствуют стадии приготовления и разведения препаратов ex tempore, а стадия учета результатов упрощена и ускорена за счет использования витальной окраски и устройства для микроскопических исследований, разработанного нами. Все это позволяет стандартизовать процедуру проведения исследования на всех ее этапах.

Предлагается также использовать эту тест-систему для одновременного выявления T.vaginalis и определения чувствительности к препаратам, т.е. тест-система позволит еще на стадии выявления заболевания проводить подбор препарата лечения без повторного забора материала, поскольку входящая в состав набора среда СВТ позволяет накапливать и сохранять культуру T.vaginalis в течение недели.

Тестирование 109 штаммов показало, что штаммы, изолированные у пациентов с острой формой трихомонадной инфекции, как правило, чувствительны к действию метронидазола и других антипротозойных препаратов, в то время как культуры, выделенные от пациентов с хроническим трихомониазом, обладали резистентностью в 23,1 % (метронидазол) - 71,7 % (ниморазол) случаев. Такое различие свойств может объяснять довольно высокую распространенность трихомониаза среди населения нашей страны и свидетельствует о целесообразности определения чувствительности T.vaginalis к противопротозойным препаратам in vitro.

Работа поддержана грантом молодых ученых ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора.

Контактная информация: Махлай Наталья Сергеевна, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, ФГУН НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадозора, р.т. (812) 232-80-35.