Классификации питательных сред для культивирования бактерий. Классификация сред для бактерий. Искусственные питательные среды для бактерий. Естественные среды для выращивания бактерий.

Добавил пользователь Cypher
Обновлено: 14.12.2024

Питательные среды в микробиологии — это субстраты, на которых выращивают микроорганизмы и тканевые культуры. Они применяются для диагностических задач, выделения и изучения чистых культур микроорганизмов, получения вакцин и лекарств, для других биологических, фармацевтических и медицинских целей.

Классификация микробиологических питательных сред

В микробиологии питательные среды разделяют на:
— среды определенного и неопределенного состава;
— натуральные, полусинтетические и синтетические;
— основные, диагностические, элективные;
— плотные, полужидкие, жидкие, сухие, сыпучие.

Натуральными питательными средами называют те, что получают из природных материалов: крови, мяса, белков, органов животных, растительных экстрактов и растительного сырья. Примером таких сред могут быть мясной бульон, молочная сыворотка, пивное сусло, настои сена, агар-агар, кровь, желчь. Натуральные среды относятся к средам с неопределенным составом, который в разное время могут иметь разное количество тех или иных компонентов.

Полусинтетические среды тоже считаются средами с неопределенным составом. Они готовятся на основе натуральных питательных сред, но в них добавляются вещества, которые гарантируют культурам активное размножение. На полусинтетических средах выращивают культуры для получения витаминов, аминокислот, антибиотиков в промышленной фармацевтике.

Синтетические среды готовят из ингредиентов известного состава, в известной концентрации и соотношениях, поэтому эти среды относятся к средам определенного состава. С их помощью изучают метаболизм микроорганизмов, их биологические и физиологические свойства, возможность получения веществ, подавляющих или, наоборот, стимулирующих их развитие.

Основные, элективные и диагностические питательные среды

Основные среды служат для выращивания различных микробных культур, а также как основа для получения элективных и диагностических сред. К основным средам, например, относится мясной бульон, мясной агар, сусло, бульон Хоттингера. Для разных культур в основные среды добавляют некоторые компоненты для стимулирования роста — это могут быть витамины, аминокислоты, природные экстракты. Так, возбудитель коклюша выращивается на среде с добавлением крови.

Элективные среды — среды для избирательного (селективного) выращивания биологических культур. Состав среды подбирается так, чтобы быть оптимальным для одного вида или группы близкородственных бактерий и подавлять развитие бактерий других видов. Например, добавление в среду хлористого натрия в определенной концентрации подавляет рост всех бактерий, кроме стафилококков. С помощью элективных культур получают чистые культуры для дальнейшего размножения и накопления.

Диагностические среды служат для идентификации микроорганизмов. По изменению среды и ее химического состава (изменению окраски среды, появлению пузырьков газа и т.п.) определяют вид бактерий. В такие среды часто добавляют химические красители-индикаторы, такие как кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый, метиленовый синий, фусин и другие. Они помогают разделить близкие культуры. Скажем, в розовой среде Эндо, подкрашенной фусином, кишечная палочка образует колонии красного цвета, а тифозные и дизентерийные колонии бактерий — бесцветные.

Классификация питательных сред

При приготовлении питательных сред необходимо учитывать потребность культивируемых микроорганизмов в различных элементах питания. Существует различные классификации питательных сред.

Классификация питательных сред по составу:

1. Простые среды (МПБ, МПА, желатин, пептонная вода). Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.

Существует несколько способов приготовления МПБ:

а) на мясной воде с добавлением готового пептона;

б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов.

Мясо-пептонный агар (МПА) — получают путем добавления агар-агара (1,5-3%) к МПБ. Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона — это скошенный агар. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде штастшки — пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.

2. Сложные среды готовятся на основе простых с определенными добавками (углеводы, кровь, желчь, яйца, сыворотка, молоко, соли, факторы роста и т.п.)

Классификация питательных сред по исходным компонентам:

1. Естественные питательные среды — это натуральный продукт животного или растительного происхождения.

Могут быть:

- Растительные (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т.п.).

- Животные (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко, животные ткани, желчь, сыворотка крови и т.п.).

- Смешанные (МПА, среда Левенштейна - Йенсена и т.п.).

2. Искусственные среды содержат переработанные естественные продукты (мясную воду, перевар), вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) и различные добавки. Это самая большая и разнообразная по составу наиболее часто применяемая группа сред. Их готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

3. Синтетические среды (известного химического состава) состоят из химически чистых соединений в точно установленных концентрациях (с добавлением углеводов, солей, аминокислот, витаминов и т.п.). На основе этих сред, добавляя к ним естественные или искусственные среды, получают полусинтетические среды.

Классификация питательных сред по консистенции: среды бывают жидкие (среды без агара), полужидкие (с агаром до 1%), плотные (агаровые — 1,5-2,5%). Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные — для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др.

Классификация питательных сред по целевому назначению: универсальные (общеупотребительные) и специальные.

Универсальные (основные) среды. Эти среды используют для культивирования большинства относительно неприхотливых микроорганизмов или применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроорганизмов. К этой группе относятся: МПБ — мясо-пептонный бульон, МПА — мясо-пептонный агар, МПЖ — мясо-пептонный желатин и т.п.

Специальные среды. Предназначены для выделения и избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, которые не растут на простых средах.

Различают следующие виды специальных сред: среды обогащения, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие и среды накопления.

Среды обогащения. Многие микроорганизмы не растут на обычных средах, поэтому для повышения питательной ценности среды в нее добавляют углеводы (сахарный бульон или агар) или белки (сывороточный агар и бульон, кровяной агар и бульон). Кровяной агар или кровяной бульон — получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика, лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки.

2. Элективные (избирательные) среды. Эти среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материала, содержащего несколько видов микробов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной. Избирательность среды достигается путем создания условий, оптимальных для культивирования определенных микробов (рН, Еh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией. Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, высокие концентрации NаС1, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. К этой группе относятся:

Селенитовая среда — является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.

Висмут-сульфит агар — содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний черного цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.

Желточно-солевой агар (ЖСА) — среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».

Желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10% желчь, одновременно тормозящая рост сопутствующих микроорганизмов.

Щелочной агар или щелочная пептонная вода элективны для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов. 3-5 сут. Ж

3. Дифференциально-диагностические среды. Дифференциально-диагностические среды применяют для дифференцировки одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида микроорганизмов, основываясь на особенностях его обмена веществ.

- Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин и т.п. Наиболее распространенными средами являются мясо-пептонный желатин (МПЖ) свернувшаясялошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

- Среды для изучения гликолитических свойств включают три основных компонента: питательная основа (бульон, агар), субстрат (моно- и дисахара, многоатомные спирты) и индикатор для выявления соответствующих ферментов. Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР). Также широко распространены среды Гисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты, либо кислоты и газа.

Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андреде и поплавками, облегчающими обнаружение газообразования и помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Например, для выделения патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных обитателей кишечника — микроорганизмов, разлагающих лактозу.

Такой средой является среда Эндо. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и, высвободившийся при этом, фуксин окрашивает колонии в ярко-красный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы — бесцветные, так как они не сбраживают лактозу.

4. Среды накопления, на которых происходит быстрый рост определенных видов микроорганизмов.

5. Консервирующие (транспортные) среды. Предназначены для сохранения микроорганизмов во время транспортировки к месту исследования. Эти среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), фосфатно-буферная смесь и среды Кари-Блэйра, Амиеса (с активированным углем и без активированного угля), Стюарта и др.

Стерилизация питательных сред.

Все питательные среды независимо от их назначения разливают в чистую посуду и стерилизуют. Большинство сред стерилизуют автоклавированием, но при различных режимах в зависимости от их состава.

1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С и давлении 1-1,5 атмосферы.

2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С и при давлении до 1 атмосферы.

3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.

4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.

Для контроля стерильности среды после стерилизации помещают в термостат при 37°С на 3-5 сут. Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста. Кроме контроля стерильности, про-изводят химический контроль готовых сред, который заключается в том, что в нескольких об-разцах каждой серии определяют рН, количество общего и аминного азота и хлоридов.

Существует также биологический контроль сред. В этом случае несколько образцов среды засевают лабораторной культурой того микроба, для которого приготовлена среда, и изучают характер его роста. Только после того, как среды выдержали контроль, их можно использовать по назначению.

Естественные среды представляют собой природные субстраты (молоко, кровь, желчь, сыворотка, картофель). Искусственные содержат смесь природных органических веществ и продуктов их кислотного или ферментативного распада. Синтетические среды состоят из буферной солевой основы и растворов аминокислот, углеводов, пуринов, пиримидинов, нуклеотидов, нуклеозидов, жирных кислот, витаминов в точно установленных дозировках. В качестве источников азота в них используются аминокислоты. Достоинство этих сред в том, что они имеют постоянный состав, по ним можно определить потребности микробов в тех или иных питательных веществах.

Плотные питательные среды готовят из жидких с добавлением уплотнителя. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар. Агар-агар - продукт, получаемый из морских водорослей, представляет собой желтоватый порошок или пластинки, содержит высокомолекулярные полисахариды, не расщепляется большинством микроорганизмов, не разрушается при автоклавировании, питательную ценность сред не изменяет, не подавляет рост микробов. Для иммунологических и бактериологических полей используется вымороженный, осветленный агар, который при кипячении или автоклавировании смеси порошка с водой расплавляется при температуре 85-100°С, а при охлаждении до 45-48°С образует гель.

Для приготовления, плотных питательных сред агар-агар добавляют в концентрации от 1,5 до 3%.

Простые среды.

Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.

Существует несколько способов приготовления МПБ:

а) на мясной воде с добавлением готового пептона - это так называемый мясо-пептонный бульон;

б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина - бульон Хоттингера, пепсина - бульон Мартена).

Мясо-пептонный агар (МПА) - получают путей добавления к МПБ arap-arapa (1,5-3%). Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона - это скошенный агар. Для его получения пробирки для застывания среды оставляют в наклонном положении. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде пластинки - пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.

Специальные питательные среды - среды, на которых создаются условия для выращивания тех бактерий, которые не растут на простых средах.

Кровяной агар или кровяной бульон - получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности.

Сывороточный бульон или сывороточный агар получают путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки. Среда применяется для выделения пневмококков, менингококков.

Желчный бульон или желчный агар получают путем добавления к питательной среде медицинской желчи без консерванта, или свежеполученной от крупного рогатого скота. Среда применяется для выделения брюшнотифозных, паратифозных и дизентерийных палочек.

Специальные среды для культивирования анаэробных бактерий: среда Китта-Тароцци состоит из питательного бульона, глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода.

Желатин - животный белок, продукт частичного гидролиза коллагена. Имеет вид бесцветных или светло-желтых пластинок без запаха и вкуса. В холодной воде набухает, сильно поглощая воду. При температуре 30°С растворяется, при охлаждении до 20-22°С превращается в гель (студень). Используется в микробиологии для изучения протеолитических ферментов.

Дифференциально-диагностические среды позволяют различить один вид микроба от другого. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на разной биохимической активности бактерий. В состав дифференциально-диагностических сред входит основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, определенный химический субстрат, различное отношение к которому является диагностическим признаком, индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о разложении субстрата и образовании кислых продуктов.

Агар Эндо - плотная среда, применяется для выделения и первичной идентификации энтеробактерий. В состав ее входят, кроме питательной основы, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом и фосфатом натрия. Правильно приготовленная среда бесцветна или имеет слегка розовый оттенок. Колонии бактерий (кишечная палочка), ферментирующие лактозу, окрашиваются на ней в красный цвет; бактерии, не ферментирующие лактозу (сальмонеллы), остаются бесцветными.

Среда Левина (лактозоэозинметиленовый агар) - среда для выделения энтеробактерий. Колонии лактозоферментирующих бактерий окрашены в темно-синий или черный цвет, колонии лактозоотрицательных бактерий вырастают под цвет среды (светло-фиолетового цвета).

Среды Гисса - набор определенных углеводов для изучения ферментативной активности бактерий и их дифференциации по этим признакам.

Элективные питательные среды содержат дополнительные вещества, задерживающие рост грамположительных бактерий. Селективные питательные среды стимулируют рост одних микробов и угнетают рост других. Селективные условия получают путем добавления в среду химических веществ. Так как в этих средах патогенные бактерии размножаются и накапливаются, их называют также средами обогащения.

Среда Плоскирева - плотная питательная среда, содержащая соли желчных кислот, бриллиантовый зеленый, лактозу и индикатор. Эта среда является не только селективной, так как подавляет рост многих микробов и способствует лучшему росту возбудителей брюшного тифа, паратифов, дизентерии, но и дифференциально-диагностической, так как лактозоотрицательные бактерии (шигеллы) образуют на ней бесцветные колонии, а лактозоположительные - кирпично-красные.

Селенитовая среда - является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.

Среда Мюллера служит для накопления сальмонелл. К питательной среде добавляют мел, раствор Люголя и гипосульфит натрия. При взаимодействии этих веществ образуется тетратионат натрия, который угнетает рост кишечных палочек, но создает благоприятные условия для размножения сальмонелл.

Висмут-сульфит агар (среда Вильсона-Блера) - содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний чернота цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.

Желточно-солевой агар (ЖСА) - среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».

Теллуритовые среды (сывороточно-теллуритовый агар, кровяно-теллуритовый агар) - селективные среды для выделения дифтерийных бактерий, содержат теллурит калия. Бесцветная соль теллура, содержащаяся в питательной среде, восстанавливается дифтерийными бактериями до металла, окрашивающего колонии в черный цвет.

Щелочной агар элективен для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.

Консервирующие среды - среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Консервирующие среды применяются, когда нет возможности быстрого посева на питательные среды.

Для бактерий наиболее употребительны консерванты:

а) глицериновая смесь, состоящая из 0,5 л химически чистого глицерина и 1,0 л физиологического раствора;

б) боратная смесь;

в) фосфатно-буферная смесь.

Для длительного сохранения свежевыделенных и производственных культур применяют полужидкий голодный агар, в этой среде при пониженной жизнедеятельности микробов продукты обмена накапливаются незначительно, что способствует хорошему сохранению культур.

Специальные среды.

В бактериологии широко применяются сухие питательные среды промышленного производства, которые представляют собой гигроскопические порошки, содержащие все компоненты среды, кроме воды. Для их приготовления используются триптические перевары дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин).

Они удобны при транспортировке, могут длительно храниться, избавляют лаборатории от громадного процесса приготовления сред, приближают к разрешению вопроса о стандартизации сред. Медицинская промышленность производит сухие среды Эндо, Левина, Плоскирева, висмутсульфит агар, питательный агар, углеводы с индикатором ВР и другие.

Термостаты

Для культивирования микроорганизмов используют термостаты.

Термостат - это аппарат, в котором поддерживают постоянную температуру. Прибор состоит из нагревателя, камеры, двойных стенок, между которыми циркулирует воздух или вода. Температура регулируется терморегулятором. Оптимальная температура для размножения большинства микроорганизмов 37°С.

Методика приготовления пластинчатого агара

МПА расплавляют на водяной бане, затем остужают до 50-55°С. Горлышко флакона обжигают в пламени спиртовки, открывают чашки Петри так, чтобы вошло горлышко флаконы, не прикасаясь к краям чашки, выливают 10-15 мл МПА, закрыв крышку, покачивают чашку, чтобы среда равномерно распределилась, оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. После подсушивания чашки с пластинчатым агаром хранят на холоде.

Посев петлей

Стерильной остуженной петлей берут каплю материала, левой рукой приоткрывают один край чашки, вносят петлю внутрь и у противоположного края делают петлей несколько штрихов на одном месте, затем петлю отрывают и засевают материал параллельными штрихами от одного края чашки к другому с интервалом 5-6 мм. В начале посева, когда микробов на петле будет много, они дадут сливной рост, но с каждым штрихом микробов на петле остается все меньше, и они будут оставаться одиночными и давать изолированные колонии.

Посев по методу Дригальского

Этот метод используется при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой (гной, испражнения, мокрота). Для посева по методу Дригальского берут шпатель и несколько чашек (3-4). Шпатель - это инструмент, изготовленный из металлической проволоки или стеклянного дрота, загнутого в виде треугольника или Г-образно. Материал петлей или пипеткой вносят в первую чашку и равномерно распределяют шпателем по поверхности среды, этим же шпателем, не прожигая его, втирают материал в питательную среду во второй чашке, а затем - в третьей. При таком посеве в первой чашке будет сливной рост, а в последующих чашках вырастают изолированные колонии.

Выделение чистой культуры по Щукевичу

Для посева берут свежеприготовленную питательную среду с конденсатом. Исследуемый материал забирают петлей и вносят его осторожно, соблюдая правила асептики, не касаясь среды и стенок, в конденсационную воду. Бактерии с высокой подвижностью «выползают» на влажную поверхность скошенного агара.

В результате самостоятельной работы студент должен знать:

1. Классификацию, морфологию грибов, их методы изучения.

2. Классификацию и морфологию актиномицетов.

3. Правила противоэпидемических режимов и техники безопасности.

Уметь:

1. Дифференцировать микроорганизмы при микроскопии.

2. Микроскопировать окрашенные препараты.

3. Обеззараживать материал, обрабатывать руки дезинфирующими препаратами.

1. Классификация питательных сред для культивирования микроорганизмов.

Культивировать микроорганизмы - это значит искусственно создавать условия для их роста и размножения in vitro. Рост и размножение - циклический 4-х фазный процесс (латентная, логарифмического роста, стационарная, гибель). Период между образованием новых клеток и их делением называется периодом генерации, на длительность которого, кроме особенностей микроба, влияет состав питательной среды. Формы колоний разных микробов на питательной среде одного и того же состава отличаются, что учитывают при их дифференциации.Для культивирования in vitro необходимы субстраты, которые микроорганизмы могут использовать в качестве питательных веществ для своего роста и размножения. Такие питательные субстраты - плотные или жидкие - называют культуральными или питательным средами. В большинстве случаев в микробиологических лабораториях микроорганизмы культивируют in vitro, т.е. в стеклянных колбах, пробирках и других сосудах.

К любой питательной среде предъявляют ряд основных требований:

1)Стерильность и по возможности прозрачность.

2)При составлении питательных сред учитывают потребность микроорганизмов в элементах питания (необходимые для жизнедеятельности клеток биохимические факторы - источники энергии, С, N, S, а также неорганические ионы - доступные для усвоения микроорганизмами).

3)Оптимальные значения ряда биофизических показателей: концентрации водородных ионов (pH), окислительно-восстановительного потенциала (Eh), активности воды (a_w), осмотического давления.

Классификация питательных сред и способы их получения.

В зависимости от видовой принадлежности микробов и целей культивирования консистенция и составы культуральных сред бывают разными и варьируют в широких пределах. Среда, отвечающая биологическим особенностям микроба и обеспечивающая его рост и размножение, называется полноценной, не имеющая какого- либо компонента, необходимого для его жизнедеятельности -дефицитной.

Питательные среды классифицируют в зависимости от: химического состава и исходных компонентов, консистенции, целевого назначения.

В зависимости от химического состава и исходных компонентов различают следующие типы питательных сред:

естественные или натуральные среды - это среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющие сложный неопределенный химических состав:

1) среды животного происхождения (исходные продукты - мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.)

2) среды растительного происхождения (исходные продукты - соя, горох, картофель, морковь и т.д.)

На естественных средах хорошо развиваются микроорганизмы, однако эти среды малопригодны для контролируемого изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов и диагностических исследований, поскольку они не позволяют учитывать потребности ряда компонентов среды, а с другой стороны определять вещества, образующие микроорганизмами. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.

«Полусинтетические» среды (гидролизатные), относящиеся к средам с неопределенным составом. В них, наряду с соединениями известной химической природы, входят вещества неопределенного состава. Их используют в микробиологической практике для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (продукты гидролиза мяса, молока, дрожжей, крови и др. белковых веществ).

Среды известного химического состава (синтетические) - в их состав включают известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т.д.) в оптимальном количественном соотношении. Синтетические среды по составу бывают простыми или имеют относительно большой набор компонентов. Их используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных сред, например при получении диагностических аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том или ином конкретном химическом соединение. Кроме того, исследователи стремятся определить для каждого микроорганизма минимальные потребности в питательных веществах и, исходя из этого, создать минимальную среду, содержащую лишь необходимы для его размножения химические соединения.

По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.

Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов.

Полужидкие и плотные питательные среды. Используют для учёта количества бактерий, выделения их в виде «чистой» культуры и других целей. Необходимую консистенцию среде придают добавлением различных уплотнителей - агар-агар или желатину.

Агар-агар (малайское желе)- растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с ничтожным количеством азотистых веществ. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5-2%,полужидких -0,3-0,7%.

Желатина - кислый азотистосодержащий продукт, добываемый при выварке костей и хрящей. Обычно в питательные среды вносят 10-20% желатины. Но ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину, что делает его неудобным для применения.

По целевому назначению различают:

Общеупотребительные (основные) среды.

Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов.

Мясная вода: Получение - мясной фарш заливают водопроводной водой 1:2, кипятят 1ч., затем фильтруют, доливают водой до первоначального объема, разливают по емкостям, плотно закрывают и стерилизуют автоклавированием при 120 О С 20 мин.

Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия нарезают, заливают кипящей водой 1:2, кипятят, охлаждают до 45 О С, добавляют панкреатин, подщелачивают раствором карбоната натрия, встряхивают, добавляют хлороформ, закрывают и выдерживают в теплом месте 10 дней.

Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления используют мясной бульон. К 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярной массой) для повышения калорийности среды и 5 г NaCI для создания осмотической активности. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды. Кипятят. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют автоклавированием при 120 0 С 20 мин.

Мясо-пептонный агар (МПА): к 1 л МПБ добавляют 15-20 г мелко нарезанного агар-агара. Среду нагревают до растворения агара, устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na₂CO₃, фильтруют и через воронки разливают в пробирки, стерилизуют автоклавированием при120 0 20 мин.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ). К 1 литру МПБ добавляют желатин до конечной концентрации 10-20%, нагревают, устанавливают слабо-щелочную pH, кипятят, фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром 3 дня или однократно автоклавированием при 120 0 С при 1 атм. течение 20 мин.

Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25% агара, кипятят до его расплавления, устанавливают требуемую pH, фильтруют в горячем виде и стерилизуют автоклавированием.

Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водой 1:5 (1:8), добавляют 0,5% NaСI, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают pH, кипятят

2. Классификация питательных сред

Классификация питательных сред по составу:

1. Простые среды (МПБ, МПА, желатин, пептонная вода). Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред. Существует несколько способов приготовления МПБ:

а) на мясной воде с добавлением готового пептона (продукт неполного переваривания белка) - это так называемый мясопептонный бульон;

Мясо-пептонный агар (МПА) - получают путей добавления к МПБ arap-arapa(l,5-3%). Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона - это скошенный агар.Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА,застывший в чашках Петри в виде пластинки - пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слойтакой же величины, это полускошенный агар.

2. Сложные средыготовятся на основе простых с определенными добавками (углеводы, кровь, желчь, яйца, сыворотка, молоко, соли, факторы роста и т.п.)

1.Естественные питательные среды — это натуральный продукт животного или растительного происхождения. Могут быть:

Растительные (исходные продукты - соя, горох, картофель, морковь и т.п.)

Животные (исходные продукты - мясо, рыба, яйца, молоко, животные ткани, желчь, сыворотка крови.и т.п.)

Смешанные (МПА, среда Левенштейна - Йенсена и т.п.)

3. Синтетические среды (известного химического состава) состоят из химически чистых соединений в точно установленных концентрациях (с добавлением углеводов, солей, аминокислот, витаминов и т.п.). На основе этих сред, добавляя к ним естественные или искусственные среды получают полусинтетические среды.

Классификация питательных сред по консистенции:среды бываютжидкие(среды без агара),полужидкие (с агаром до 1%),плотные(агаровые - 1,5-2,5%). Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные — для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др.

Универсальные (основные) среды. Эти среды используют для культивирования большинства относительно неприхотливых микроорганизмов или применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроорганизмов. К этой группе относятся: МПБ - мясо-пептонный бульон, МПА - мясо-пептонный агар, МПЖ - мясо-пептонный желатин и т.п.

Специальные среды.Предназначены для выделения и избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, которые не растут на простых средах.

1. Среды обогащения. Многие микроорганизмы не растут на обычных средах, поэтому для повышения питательной ценности среды в нее добавляют углеводы (сахарный бульон или агар) или белки (сывороточный агар и бульон, кровяной агар и бульон). Кровяной агар или кровяной бульон - получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки. Среда применяется для выделения пневмококков, менингококков.

2. Элективные (избирательные) среды.Эти среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материала, содержащего несколько видов микробов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной. Избирательность среды достигается путем создания условий, оптимальных для культивирования определенных микробов (рН, Eh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией. Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, высокие концентрации NaCl, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. К этой группе относятся:

Селенитовая среда - является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.

Висмут-сульфит агар - содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний черного цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.

Желточно-солевой агар (ЖСА) - среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».

Желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10% желчь, одновременно тормозящая рост сопутствующих микроорганизмов.

Щелочной агар или щелочная пептонная вода элективны для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.

3. Дифференциально-диагностические среды.Дифференциально-диагностические среды применяют для изучения биохимических свойств и отличия (дифференцировки) одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида микроорганизмов, основываясь на особенностях его обмена веществ. Дифференцирующие свойства данных сред создаются внесением субстрата, к которому определяется отношение микробов, их ферментативной активности и действие токсинов (среды Гисса, среды Эндо, Левина, Плоскирева, Олькеницкого, висмут-сульфит агар и т.п.). По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом:

Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин и т. п. Наиболее распространенными средами являются мясо-пептонный желатин (МПЖ) свернувшаяся лошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами. Например, среды, включающие вещества, ассимилируемые только определенной группой бактерий. Наиболее распространенными средами данной группы являются цитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера.

Среды с углеводами, многоатомными спиртами или индикаторами для обнаружения соответствующих ферментов и определения гликолитической активности микроорганизмов. Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором BP) и лакмусовое молоко (среда Минкевича). Также широко распространены среды Гисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты, либо кислоты и газа. Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андреде и поплавками, облегчающими обнаружение газообразования и помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Например, для выделения патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных обитателей кишечника - микроорганизмов, разлагающих лактозу. Такой средой является среда Эндо, в состав которой входит лактоза. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и, высвободившийся при этом, фуксин окрашивает колонии в ярко-красный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы - бесцветные, так как они не сбраживают лактозу.

Среды для определения редуцирующей способности микроорганизмов. В эту группу входят среды с красками, обесцвечивающимися при восстановлении под действием окислительно-восстановительных ферментов (например, метиленовый синий, кислый фуксин, бромтимоловый синий), а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет). Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.

4. Среды накопления,на которых происходит быстрый рост определенных видов микроорганизмов.

5. Консервирующие среды.Предназначены для сохранения микроорганизмов во время транспортировки к месту исследований.Эти среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), гипертонический раствор, фосфатно-буферная смесь.

Стерилизация питательных сред. Все питательные среды независимо от их назначения разливают в чистую посуду и стерилизуют. Большинство сред стерилизуют автоклавированием, но при различных режимах в зависимости от их состава.

1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15—20 мин в автоклаве при температуре 115—120°С и давлении 1-1,5 атмосферы.

2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С и давлении до 1 атмосферы.

Для контроля стерильности среды после стерилизации помещают в термостат при 37°С на 3-5 сут. Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста. Кроме контроля стерильности, производят химический контроль готовых сред, который заключается в том, что в нескольких образцах каждой серии определяют рН, количество общего и аминного азота и хлоридов.

Читайте также: