Разрешающая способность электронного микроскопа. Увеличение электронной микроскопии.

Добавил пользователь Валентин П.
Обновлено: 14.12.2024

Возможности световых микроскопов ограничены волновой природой света. При оптимальных условиях световые микроскопы позволяют наблюдать, вследствие явления дифракции, объекты размером не менее 1/2 - 1/3 длины световой волны (около 0,2μ ).

Наибольшими возможностями в смысле разрешающей способности обладают электронные микроскопы, в которых пучок света заменен пучком электронов, длина волны которых составляет 0,04-0,05А.

Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового микроскопа, в котором все оптические элементы заменены соответствующими электрическими: источник света заменен источником электронов, стеклянные линзы - линзами электромагнитными, В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, электропитания,

Электронно-оптическая система снабжена двумя конденсорными, объективной, промежуточной и проекционной линзами, обеспечивающими увеличение электронного микроскопа от 300 до 200000 крат. Промежуточная и проекционная линзы обеспечивают плавное изменение увеличения при постоянном поле изображения.

Фотографирование изображений при всех видах исследований производится на фотопластинки, фотопленку или фотобумагу.

В комплект электропитания электронного микроскопа входят: шкаф питающего устройства, выпрямитель высоковольтный, пульт управления, щит распределительный, трансформатор высокочастотный, стабилизатор феррорезонансный, соединительные кабели. Устройство обеспечивает электрическое питание всех узлов электронного микроскопа от сети трехфазного переменного тока с напряжением 220 или 380В, частотой 50 гц.

Вакуумная система электронного микроскопа позволяет получать и поддерживать в процессе работы рабочий вакуум 2·10 -4 мм рт.ст. в колонне микроскопа, производить шлюзование камеры объекта и фотокамеры. Герметичность вакуумной системы и колонны микроскопа в местах их соединения обеспечивается применением резиновых уплотнителей. Вакуумная система состоит из следующих основных узлов: стояка, вакуумного реле, высоковакуумного клапана, клапана распределительного, комбинированной ловушки, камеры вакуумной, обходного клапана, ловушки предварительного разрежения, диффузионного насоса, вспомогательного диффузионного насоса, баллона предварительного разрежения, механического насоса.

Источником пуска электронов является электронная пушка, состоящая из V -образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900° в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом. Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его различной толщины и плотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое увеличенное изображение объекта. После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения диффракции с участков исследуемых образцов. Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объектов, которое направляется на флуоресцирующий экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с веществом люминофора Флуоресцирующего экрана на нем возникает видимое изображение объекта. Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.

Методы электронно-микроскопического препарирования.

а) Приготовление пленок-подложек и их монтаж на предметные сетки

Электронномикроскопическому изучению могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные структуры, выделенные при разрушении клеток различными способами.

Для того, чтобы исследовать различные объекты в световом микроскопе, их помещают на предметное стекло. При электронномикроскопических исследованиях роль предметного стекла (оно не может быть использовано, так как непроницаемо для электронов) выполняют очень тонкие, прозрачные пленки-подложки, которые крепятся на опорные сетки.

Обычно для исследований применяют сетки, приготовленные из платины или чистой меди и имеющие до 100 ячеек на I мм 2 . Они могут быть плетеными или изготавливаются специальным фотохимическим способом. Выпускаются как в готовом виде с внешним диаметром 2 или 3 мм. так и в виде полотна, из которого вырубаются специальными пробойниками.

Толщина пленок-подложек должна быть не более 200А, так как более толстые пленки увеличивают угловое рассеивание электронов, отчего контрастность изображения и разрешение структур объектов значительно уменьшаются. Чаще всего для электронномикроскопи-ческих исследований биологических объектов применяют коллодиевые, формваровые и угольные пленки-подложки.

Благодаря своему заряду электроны слабо проникают через плотные среды. Поэтому объект для исследования должен быть максимально проницаемым для электронов. По этим же соображениям подложка должна быть электрононейтральной, чтобы не задерживать электронов, и бесструктурной, чтобы не затемнять структуру объекта. Кроме того, подложки должны быть прочными, чтобы выдерживать высокую температуру. Для получения пленок-подложек из нитроцеллюлозы пользуются 1,5-2%-ными растворами коллодия в амилацетате (чистый коллодий получают путем выпаривания аптечного эфирного раствора коллодия). Каплю раствора коллодия наносят на поверхность дистиллированной воды, налитую в чашку диаметром около 20 см. Капля быстро растекается по поверхности воды, и после испарения амилацетата образуется тонкая пленка.

Пленки из формвара (поливинилформальдегида) несколько прочнее, чем из коллодия, но получать их сложнее, так как растворители формвара - диоксан, дихлорэтан - не растекаются по поверхности воды, как амилацетат, и, кроме того, очень токсичны. Для получения формваровых пленок чистое, хорошо отшлифованное стекло опускают в раствор 0,1-0,2%-ного формвара в диоксане или дихлорэтане, затем вынимают и подсушивают 5-10 минут на воздухе. На стекле образуется тонкая пленка, которую обрезают по краям стекла, стекло опускают под углом 45° в чашку с водой, пленку осторожно снимают на поверхность воды.

В последнее время все чаще применяют углеродные пленки (они химически инертны, хорошо переносят электронную бомбардировку, термостойки), которые получают путем испарения углерода в вакуумной установке. В установку помещают чистое шлифованное стекло и при контакте двух графитовых стержней, на которые подается электрический ток, на стекло распыляют углерод. Затем тонкую пленку, полученную на поверхности стекла, снимают на поверхность воды, как и в случае снятия формваровой пленки.

После того как на поверхности воды образуется тонкая пленка, полученная одним из вышеописанных способов, на пленку аккуратно пинцетом наносят опорные сетки выпуклой стороной вниз. После этого поверх сеток накладывают листок фильтровальной бумаги и снимают его вместе с пленкой о поверхности воды. Сетки оказываются заключенными между пленкой и фильтровальной бумагой. Бумагу подсушивают, и сетки вместе с подложкой снимают осторожно пинцетом для размещения на них объектов, подлежащих микроскопическому исследованию.

б) Методы негативного и позитивного контрастирования

При рассмотрении объекта в электронном микроскопе и выявлении тонких деталей его строения важны два основных фактора: разрешающая способность микроскопа и контрастность объекта. Ряд биологических структур рассеивают электроны почти так же, как и пленка-подложка, в результате чего контрастность настолько мала, что даже при достаточной разрешающей способности микроскопа изображение объекта не будет различимо. Для увеличения контрастности применяют ряд методов.

Негативное контрастирование. В основе этого метода лежит принцип разности контрастов. При этом исследуемый объект смешивают с раствором соли тяжелого металла и наносят на сетку. Контрастирующее вещество окружает объект более низкой плотности, в результате чего малоконтрастный объект становится отчетливо различим на окружающем его темном фоне. В этом случае получают негативный эффект. Для негативного контрастирования применяют 2%-ный раствор уранилацетата или 2%-ный раствор фосфорновольфрамовой кислоты.

Позитивное контрастирование. Известно, что соли тяжелых металлов могут специфически реагировать с различными биологическими веществами, тем самым они могут повышать контрастность соответствующих структур. Например, осмий хорошо реагирует с липоидными веществами, уранилацетат - с нуклеиновыми кислотами, соли свинца с белковыми компонентами клеток и тканей. Увеличение контрастности структур, возникающее после взаимодействия их с солями тяжелых металлов, обеспечивает позитивное контрастирование объекта, так как в результате "окраски" структуры становятся менее проницаемыми для электронов и выглядят темными на светлом фоне препарата.

в) Метод оттенения

Для увеличения контрастности исследуемых объектов применяют также метод оттенения. При изготовлении образцов по этому методу исследуемый объект помещают в вакуумную напылительную установку и на него под определенными углами производят испарение металла (платины, палладия, золота, хрома, углерода) или их сплавов.

В тех местах, где объект будет экранировать пучок частиц, возникают тени. Рассеивание и поглощение электронов для различных участков объекта оказывается различным, в результате чего контрастность изображения возрастает. Этот метод позволяет не только увеличить контрастность, но и установить в ряде случаев размеры исследуемых объектов по длине тени и углу отклонения с использованием специальных формул.

Методы получения ультратонких срезов

а) Способы фиксации и заливки биологических объектов

Основная цель фиксации - сохранить объект в таком состоянии, которое правильно бы отражало прижизненное состояние объекта. "В настоящее время в практике электронной микроскопии применяют химические способы фиксации. По способу действия на живые структуры все химические фиксаторы разделяют на две группы:

1) фиксаторы, осаждающие (коагулирующие) белки - спирты, уксусная и пикриновая кислоты, соли тяжелых металлов, которые в основном применяют в световой микроскопии;

2) фиксаторы, стабилизирующие липиды - четырехокись осмия, формалин, перманганат калия.

Для фиксации клеток из культур микроорганизмом, выращенных на плотных и жидких средах, применяют 1%-ный раствор KMnO4 приготовленный на ацетат-вероналовом буфере. При фиксации бактериальных клеток по Ритер-Келленбергер применяют стандартный раствор: 1% OsO₄ в ацетат-вероналовом буфере (рН=6,0), в котором фиксатором является осмий.

После фиксации производят обезвоживание. В качестве обезвоживающих веществ используют этиловый спирт, метиловый спирт и ацетон, которые берут в возрастающих концентрациях (30°, 50°, 70° , 96°, 100°).

После обезвоживания объекты заключают в пластмассы или другие среды. Так как оптимальная толщина срезов должна быть не более 250-800 А, то необходимо, чтобы заливочный материал обладал определенной твердостью и другими свойствами. Для этих целей используют пластические массы - метакрилаты, эпоксидные смолы.

В практике электронной микроскопии чаще используют метакрилаты: бутилметакрилат и метилметакрилат. Бутилметакрилат полимеризуется в сравнительно мягкие блоки, поэтому к нему прибавляют 10-20% метилметакрилата. В качестве катализатора применяют 1-2%-ную перекись бензоила. Заливочную смесь (рабочую) заливают в желатиновые капсулы, где происходит полимеризация ее при 600 в течение 48 часов.

б) Приготовление стеклянных ножей

Одним из самых важных этапов при получении ультра тонких срезов является процесс приготовления стеклянного ножа. Стеклянные ножи готовят из полос специального (зеркального) стекла, толщина которого должна быть 5 мм. Из такой полосы приготавливают квадраты размером 3x3 см, для чего стеклорезом вначале делают нарезки и по нарезу обламывают клетки-квадраты. Затем приготовленный квадрат надрезают по диагонали и разламывают.

Насечки стеклорезом производят таким образом, чтобы они не доходили до края стекла на 2-3 мм. После разламывания квадрата по диагонали с помощью лупы просматривают получившиеся лезвия. Обычно нож получается несколько неровным и только небольшая его , часть имеет ровный участок, который и используется в качестве лезвия.

Выпускаются специальные приборы - станки для изготовления стеклянных ножей (напр., ССН-1), которые значительно облегчили процесс изготовления ножей. После изготовления ножа на нем укрепляют ванночку из лейкопластыря, и нож с ванночкой устанавливают в микротом.

Демонстрация приготовления стеклянных ножей с помощью прибора ССН-1.

в) Ознакомление с устройством ультрамикротома и получением ультратонких срезов

Незначительная проникающая способность электронов даже при больших ускоряющих -напряжениях требует изготовления сверхтонких срезов. Ультратонкие срезы получают на специальных приборах, называемых ультрамикротомами. В современных микротомах применяется тепловая подача металлического стержня, а через него и блока (объекта) по отношению к ножу. Для подготовки препарата к резанию необходимо, чтобы полушаровидныи конец цилиндрического блока был заточен в виде пирамидки, содержащей объект. Все операции по заточке блока производят под бинокулярной лупой. После подготовки блока к резке его устанавливают в микротом таким образом, что после включения последнего блок начинает двигаться по отношению к неподвижно закрепленному ножу. Получающиеся при микротомии ультратонкие срезы остаются в ванночке ножа, которая предварительно заполняется дистиллированной водой. Срезы свободно плавают на поверхности жидкости. Когда срезов накапливается достаточное количество, их собирают на сетке (прикосновением к поверхности жидкости).

Демонстрация ультратонких срезов бактериальных клеток в электронном микроскопе.

З А Н Я Т И Е2

Тема: Морфология и ультраструктура бактерий, риккетсий, хламидий, микоплазм, актиномицетов, спирохет, грибов, простейших. Классификация микробов.

План занятия:

1. Спирохеты возвратного тифа. Микроскопия готовых препаратов.

2. Бледная спирохета. Микроскопия готовых препаратов, приготовленных из чистой культуры бледной спирохеты или из исследуемого материала - отделяемого твёрдого шанкра.

3. Лептоспиры. Демонстрация препарата из исследуемого материала с импрегнацией серебром.

4. Актиномицеты: а) микроскопия препарата-мазка из чистой культуры актиномицета; б) демонстрация готового препарата друзы актиномицета.

5. Нитчатые (плесневые) грибы. Макроскопия культур и микроскопия препаратов "раздавленная капля".

6. Дрожжевые грибы. Микроскопия окрашенных препаратов-мазков.

7. Дрожжеподобные грибы рода кандида. Микроскопия культур грибов кандида.

а) микроскопия трипаносом, окрашенных по Романовскому;

б) микроскопия препаратов лейшманий из тканей больного и из чистой культуры.

9. Малярийный плазмодий. Микроскопия препаратов из крови больных малярией: изучение стадий развития плазмодия малярии.

10. Токсоплазмы. Микроскопия готовых препаратов, приготовленных из органов зараженной токсоплазмами белой мыши.

11. Амебы. Микроскопия готовых препаратов-мазков из испражнений больного амёбиазом.

ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП

Электронный микроскоп — высоковольтный, вакуумный прибор, в котором увеличенное изображение объекта получают с помощью потока электронов. Предназначен для исследования и фотографирования объектов при больших увеличениях. Электронные микроскопы имеют высокую разрешающую способность. Электронные микроскопы находят широкое применение в науке, технике, биологии и медицине.

По принципу действия различают просвечивающие (трансмиссионные), сканирующие, (растровые) и комбинированные электронные микроскопы. Последние могут работать в просвечивающем, сканирующем либо в двух режимах одновременно.

Отечественная промышленность приступила к выпуску просвечивающих электронных микроскопов в конце 40-х годов 20 века. Необходимость создания электронного микроскопа была вызвана низкой разрешающей способностью световых микроскопов. Для увеличения разрешающей способности требовался более коротковолновый источник излучения. Решение проблемы стало возможным только с применением в качестве осветителя пучка электронов. Длина волны потока электронов, ускоренных в электрическом поле с разностью потенциалов 50 000 в, составляет 0,005 нм. В настоящее время на просвечивающем электронном микроскопе достигнуто разрешение для пленок золота 0,01 нм.

Схема электронного микроскопа просвечивающего типа: 1 — электронная пушка; 2 — конденсорные линзы; 3 — объектив; 4 — проекционные линзы; 5 — тубус со смотровыми окнами, через которые можно наблюдать изображение; 6 — высоковольтный кабель; 7 — вакуумная система; 8 — пульт управления; 9 — стенд; 10 — высоковольтное питающее устройство; 11 — источник питания электромагнитных линз.

Принципиальная схема просвечивающего электронного микроскопа мало чем отличается от схемы светового микроскопа (см.). Ход лучей и основные элементы конструкции обоих микроскопов аналогичны. Несмотря на большое разнообразие выпускаемых электронных микроскопов, все они построены по одной схеме. Основным элементом конструкции просвечивающего электронного микроскопа является колонна микроскопа, состоящая из источника электронов (электронной пушки), набора электромагнитных линз, предметного столика с объектодержателем, люминесцентного экрана и фоторегистрирующего устройства (см. схему). Все элементы конструкции колонны микроскопа собраны герметично. Системой вакуумных насосов в колонне создается глубокий вакуум для беспрепятственного прохождения электронов и защиты образца от разрушения.

Поток электронов образуется в пушке микроскопа, построенной по принципу трехэлектродной лампы (катод, анод, управляющий электрод). В результате термоэмиссии с разогретого V-образного вольфрамового катода высвобождаются электроны, которые разгоняются до высоких энергий в электрическом поле с разностью потенциалов от нескольких десятков до нескольких сотен киловольт. Через отверстие в аноде поток электронов устремляется в просвет электромагнитных линз.

Наряду с вольфрамовыми термоэмиссионными катодами в электронном микроскопе применяют стержневые и автоэмиссионные катоды, обеспечивающие значительно большую плотность пучка электронов. Однако для их работы необходим вакуум не ниже 10 -7 мм рт. ст., что создает дополнительные конструктивные и эксплуатационные трудности.

Другой основной элемент конструкции колонны микроскопа — электромагнитная линза, представляющая собой катушку с большим числом витков тонкого медного провода, помещенную в панцирь из мягкого железа. При прохождении через обмотку линзы электрического тока в ней образуется электромагнитное поле, силовые линии которого концентрируются во внутреннем кольцевом разрыве панциря. Для усиления магнитного поля в область разрыва помещен полюсный наконечник, позволяющий получать мощное, симметричное поле при минимальном токе в обмотке линзы. Недостатком электромагнитных линз являются различные аберрации, влияющие на разрешающую способность микроскопа. Наибольшее значение имеет астигматизм, вызванный асимметрией магнитного поля линзы. Для его устранения применяют механические и электрические стигматоры.

Задача сдвоенных конденсорных линз, как и конденсора светового микроскопа, состоит в изменении освещенности объекта за счет изменения плотности потока электронов. Диафрагма конденсорной линзы диаметром 40—80 мкм выбирает центральную, наиболее однородную часть пучка электронов. Объективная линза — самая короткофокусная линза с мощным магнитным полем. Ее задача состоит в фокусировании и первичном увеличении угла движения электронов, прошедших через объект. От качества изготовления и однородности материала полюсного наконечника объективной линзы во многом зависит разрешающая способность микроскопа. В промежуточной и проекционной линзах происходит дальнейшее увеличение угла движения электронов.

Особые требования предъявляются к качеству изготовления предметного столика и объектодержателя, так как они должны не только перемещать и наклонять образец в заданных направлениях при большом увеличении, но и при необходимости подвергать его растяжению, нагреву или охлаждению.

Довольно сложным электронно-механическим устройством является фоторегистрирующая часть микроскопа, которая позволяет осуществлять автоматическую экспозицию, замену отснятого фотоматериала, производить на нем запись необходимых режимов микроскопирования.

В отличие от светового микроскопа объект исследования в просвечивающем электронном микроскопе крепится на тонких сетках, изготовленных из немагнитного материала (медь, палладий, платина, золото). На сетки крепится пленка-подложка из коллодия, формвара или углерода толщиной несколько десятков нанометров, затем наносится материал, подвергаемый микроскопическому исследованию. Взаимодействие падающих электронов с атомами образца приводит к изменению направления их движения, отклонению на незначительные углы, отражению или полному поглощению. В формировании изображения на люминесцентном экране или фотоматериале принимают участие только те электроны, которые были отклонены веществом образца на незначительные углы и смогли пройти через апертурную диафрагму объективной линзы. Контрастность изображения зависит от наличия в образце тяжелых атомов, сильно влияющих на направление движения электронов. Для усиления контрастности биологических объектов, построенных в основном из легких элементов, применяют различные методы контрастирования (см. Электронная микроскопия).

В просвечивающем электронном микроскопе предусмотрена возможность получать темнопольное изображение образца при освещении его наклонным пучком электронов. В этом случае через апертурную диафрагму проходят рассеянные образцом электроны. Темнопольная микроскопия увеличивает контрастность изображения при высоком разрешении деталей образца. В просвечивающем электронном микроскопе предусмотрен также режим микродифракции минимальных кристаллов. Переход от светлопольного к темнопольному режиму и микродифракции не требует значительных изменений в схеме микроскопа.

В сканирующем электронном микроскопе поток электронов формируется высоковольтной пушкой. С помощью сдвоенных конденсорных линз получают тонкий пучок электронов (электронный зонд). Посредством отклоняющих катушек электронный зонд разворачивается на поверхности образца, вызывая излучение. Система сканирования в сканирующем электронном микроскопе напоминает систему, с помощью которой получают телевизионное изображение. Взаимодействие электронного луча с образцом приводит к появлению рассеянных электронов, потерявших часть энергии при взаимодействии с атомами образца. Для построения объемного изображения в сканирующем электронном микроскопе электроны собираются специальным детектором, усиливаются и подаются на генератор развертки. Количество отраженных и вторичных электронов в каждой отдельной точке зависит от рельефа и химического состава образца, соответственно меняется яркость и контрастность изображения объекта на кинескопе. Разрешающая способность сканирующего электронного микроскопа достигает 3 нм, увеличение — 300 000. Глубокий вакуум в колонне сканирующего электронного микроскопа предусматривает обязательное обезвоживание биологических образцов с помощью органических растворителей либо их лиофилизацию из замороженного состояния.

Комбинированный электронный микроскоп может быть создан на базе просвечивающего или сканирующего электронного микроскопа. Пользуясь комбинированным электронным микроскопом, можно одновременно изучать образец в просвечивающем и сканирующем режимах. В комбинированном электронном микроскопе, как и в сканирующем, предусмотрена возможность для рентгеноструктурного, энергодисперсионного анализа химического состава вещества объекта, а также для оптико-структурного машинного анализа изображений.

Для увеличения эффективности использования всех видов электронных микроскопов созданы системы, позволяющие переводить электронно-микроскопическое изображение в цифровую форму с последующей обработкой этой информации на ЭВМ Оптико-структурный машинный анализ позволяет производить статистический анализ изображения непосредственно с микроскопа, минуя традиционный метод «негатив-отпечаток».

Библиогр.: Стоянова И. Г. и Анаскнн И. Ф. Физические основы методов просвечивающей электронной микроскопии, М., 1972; Суворов А. Л. Микроскопия в науке и технике, М., 1981; Финеан Дж. Биологические ультраструктуры, пер. с англ., М., 1970; Шиммель Г. Методика электронной микроскопии, пер. с нем.. М., 1972.

Электронная микроскопия

Электронная микроскопия - один из методов исследования микроструктуры твердых тел, их электрических и магнитных полей, локального состава с применением совокупности электронно-зондовых методов. Данная технология была запатентована в 1931 году Р. Руденбергом, который создал первый в мире электронный микроскоп. Сегодня - это один из наиболее эффективных и передовых методов исследования, который широко используется на предприятиях, в научных, учебных лабораториях.

Метод электронной микроскопии

Данная технология стала основой в создании электронных микроскопов - приборов, в которых для построения изображения используется не световой луч, а поток электронов в вакуумной среде. Роль оптических линз, которые используются в обычных микроскопах, здесь отведена электронному полю. Именно оно и фокусирует электроны. Электромагнитное поле формируется электромагнитными катушками.

Изображение передается на флюоресцирующий экран, где его можно сфотографировать и рассмотреть детально. К изучаемым объектам предъявляется ряд требований:

Необходима предварительная фиксация и обработка. Объекты в процессе работы будут находиться в глубоком вакууме.
Маленькая толщина. Поток электронов будет сильно поглощаться объектом. И большую толщину он не «пробьет». В качестве объектов используются срезы, толщиной от 20 до 50 нм. Для удобства работы их размещают на тонкие прозрачные пленки.
Равномерность слоя. Перед началом исследования проводится механическая обработка. Она способна обеспечить постоянную толщину образца.

Разрешающая способность у электронных микроскопов значительно выше, чем у оптических. Величина 0,15 нм (15 А) позволяет получать увеличение в миллионы раз, что идеально подходит для изучения микроскопических объектов.

Основные особенности

Суть метода электронной микроскопии в том, что через исследуемый образец подается электронный пучок разной энергии. Под воздействием электромагнитного поля он фокусируется на поверхности в виде пятна, в диаметре не превышающего 5 нм. Это пятно и выполняет «изучение» объекта. Соприкасаясь с поверхностью, электронный пучок частично проникает в нее, вытесняя не только электроны, но и фотоны. Они попадают на лучевую трубку, где и из них и формируется изображение.

В сравнении со световыми (оптическими) микроскопами, электронные обладают преимуществами:

Можно получать очень большое увеличение (вплоть до 300000) с сохранением высокого разрешения, вплоть до атомов. Такой результат достигается при прямом наблюдении объекта. То есть не требуется дополнительных увеличений.
Позволяют изучать химический состав образца по точкам. Используется спектральный анализ рентгеновского излучения, которое возбуждается электромагнитным потоком.
Пользователь получает прямую электронно-оптическую информацию об исследуемом объекте. При необходимости ее можно будет дополнить сопутствующими данными, основываясь на электронной дифракции электронов с веществом. Как пример: при помощи дифракционного контраста изображений определяются кристаллографические показатели.
Обеспечивает возможность дополнительного воздействия на объект в ходе исследования. Его можно нагревать, облучать, деформировать, намагничивать. Наблюдение за процессами будет динамическим. Есть возможность фото- и видеофиксации происходящего. Качество изображения будет достаточно высоким.
Есть возможность наблюдать за рельефом поверхности, анализируя катодолюминесценцию. Такую возможность предоставляет электронная растровая разновидность микроскопии.

Виды электронной микроскопии

Выделяют 2 основных вида электронной микроскопии:

Просвечивающая или трансмиссионная - ПЭМ.
Сканирующая или растровая - СЭМ.

Просвечивающая электронная микроскопия

В микроскопах, работающих по этой технологии на объект, воздействует пучок ускоренных электронов, обладающих энергией от 50 до 200 кэВ. Те электроны, которые образец не пропустит, будут отклоняться на небольшой угол. И они, и те, которые пройдут через исследуемый объект с незначительными энергетическими потерями, попадают на магнитные линзы. В результате на фотопленке или люминесцентном экране формируется изображение внутренней структуры. Хорошие результаты дает при исследовании ультратонких образцов - менее 0,1 мкм в толщину.

При работе с ПЭМ одна из наиболее важных задач - различать природу контрастов:

Абсорбционный. Результат неупругого рассеивания электронов, которые проходят через образец. Более плотные элементы будет выделяться темным на общем белом фоне. Если состав образца однородный, контрастировать будут участки разной толщины. Применяется при исследовании микрочастиц на аморфной пленке.
Дифракционный. Формируется при упругом рассеивании электронов, которые проходят через исследуемый образец на неподвижных и стандартно размещенных атомах кристаллической решетки. Подходит для определения кристаллической структуры и размеров решетки.
Амплитудный. Контраст такого типа образуется в результате выделения одного конкретного рефлекса из общей дифракционной картины. Его изображение передается на оптическую ось. При этом прямой пучок окажется на экране светлым, а тот, который отклонился (дифрагированный) - темным. Неоднородности укажут на дефекты кристаллической решетки. Применяется такой метод исследования для определения несовершенства кристаллической решетки, ее природы и свойств.
Фазовый. Образуется при многопучковой электронной дифракции как результат уменьшения или увеличения амплитуды волн с разным сдвигом по фазе. Позволяет определять ориентацию кристаллических решеток разных фаз образца, дефекты решеток.

Одна из разновидностей ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения (ВРЭМ). Формируется в случае, когда пучок электронов падает параллельно оси кристаллов в условиях фазового контраста. Позволяет диагностировать даже мельчайшие неоднородности кристаллической решетки.

Сканирующая электронная микроскопия

Сканирующей электронной микроскопией (СЭМ) получают изображения поверхности исследуемого образца с высокой разрешающей способностью. Получают трехмерные картинки, которые будут удобными в процессе изучения структуры. Дополнительно можно использовать методики EDX, WDX, чтобы получить информацию о химическом составе околоповерхностных слоев.

В оборудовании сфокусированный электронный пучок средней энергии сканирует образец. Предусмотрено несколько режимов работы:

Режим отраженных электронов.
Режим вторичных электронов.
Режим катодолюминиценции и пр.

Эти методики позволяют не только изучать свойства поверхности, но и получать наглядную информацию о структурах, расположенных на несколько микрон ниже верхнего слоя.

СЭМ может работать только с образами, которые можно погружать в вакуум - твердыми. Жидкие среды предварительно подвергают криозаморозке. Форма и размеры образца ограничиваются только размерами рабочей камеры микроскопа. Эффективность исследования можно повысить путем напыления слоя токопроводящего материала.

Возможности

Технология электронной микроскопии постоянно развивается:

совершенствуются способы подготовки образцов;
разрабатываются методики для получения более качественной и широкой информации;
улучшается электронная оптика;
повышается чувствительность методов анализа применением спектрометрических систем;
разрабатываются методики компьютерной обработки изображений с целью получения более широкой информации о структуре;
тестируются методы компьютеризации, автоматизации путем подключения к микроскопу дополнительной аппаратуры и пр.

Благодаря последним наработкам метод электронной микроскопии используют уже и при работах с влажными образцами, исключая нарушение их структуры и локального состава. Для этого применяется низкотемпературное замещение воды, сверхбыстрое замораживание в среде хладагента, прижим к металлу, который охлаждается жидким азотом и пр. Существенно возможности метода расширило использование компьютерной техники, в частности математическая обработка электронных изображений. Теперь изображения можно запоминать, корректировать контрастность, добавлять оттенки цветов, выделять микроструктуры, убирать шумы, выделять границы исследуемых участков и пр.

Области применения

Метод электронной микроскопии используют для изучения поверхности объектов, ультратонких срезов тканей, микробов. С его помощью определяют строение жгутиков, вирусов и пр. Оборудование, основанное на этой технологии, широко используется в различных научных и производственных отраслях:

Полупроводники, хранение данных. Выполняется анализ дефектов, трехмерная метрология, определяются неисправности, редактируются рабочие схемы.
Биология и медицина. Электронные микроскопы применяют в криобиологии, электронной и клеточной томографии, вирусологии, стекловании. С их помощью определяют локализацию белков, анализируют частички, выполняют фармацевтический контроль качества, получают трехмерные изображения тканей.
Промышленности. Электронные микроскопы позволяют снимать плоские и трехмерные микрохарактеристики, параметры частиц, проводить динамические эксперименты с материалами, получения изображения высокого разрешения. Они применяются в химической, нефтехимической горнодобывающей отрасли, микротехнологии, судебной медицине и пр.
Научно-исследовательские лаборатории. Электронная микроскопия позволяет делать квалификацию материалов, создавать нанопрототипы, исследовать микроструктуры металлов, подбирать материалы и образцы. Микроскопы также применяются для тестирования и снятия характеристик.

Главная задача - подобрать микроскоп, работающий электронным методом под особенности предстоящих работ. В каталоге компании «Sernia Инжиниринг» можно подобрать подходящее оборудование для любой научно-исследовательской и производственной задачи. Приборы поставляются по Москве, Санкт-Петербургу и в другие регионы РФ. Все они имеют сертификаты соответствия, на них действуют гарантии. Узнать актуальные цены, условия сотрудничества, получить консультации и помощь в выборе можно у менеджеров компании. Свяжитесь с ними по телефону или через онлайн-форму.

А.С.Илюшин, А.П.Орешко. Введение в дифракционный структурный анализ. М.: физический факультет МГУ, 2008

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ/TEM)

Методы визуализации в просвечивающей электронной микроскопии

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) - метод, который визуализирует образец с использованием электронного пучка. ПЭМ имеет лучшее пространственное разрешение (1-2 Å), чем СЭМ, но требует более сложной подготовки образца.

Просвечивающая электронная микроскопия является методом, который визуализирует образец с использованием электронного пучка (англ. TEM - Transmission electron microscopy). При просвечивающей микроскопии разрешение изображения составляет около 1-2 Å . Электроны высокой энергии (80 keV - 200 keV) передаются через электронно-прозрачные образцы (толщиной ~ 100 нм). ПЭМ имеет лучшее пространственное разрешение, чем СЭМ (англ, SEM - Scanning Electron Microscope), но требует более сложной подготовки образца.

Для достижения наилучших результатов в различных режимах работы ПЭМ предусмотрена возможность настройки и сохранения параметров линз, дефлекторных катушек (формирующих электронный пучок), разнообразных параметров электронного пучка и режимов формирования изображения.

Методами визуализации в просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) являются: дифракционный контраст, фазовый контраст и сканирующая просвечивающая электронная микроскопия (СПЭМ).

Дифракционный контраст

Для ПЭМ дифракционный контраст единственный в своем роде метод, чувствительный к кристаллографическим изменениям фазы и толщины образца. Дифракционный контраст в изображении зависит от кристаллографической ориентации образца относительно электронного пучка. Это свойство обычно используется для определения границ различных компонентов полупроводниковых устройств и выявления дефектов, которые вводят в кристаллографическую фазу устройства изменения.

Дифракционный контраст позволяет визуализировать изменения в поликремнии, которые появляются в результате случайной кристаллографической ориентации зерен относительно падающего пучка. Наиболее характерные дефекты: дефекты в кремниевой подложке, стрингеры (вкрапления на границе металлов), блокировка контактов (рис.1 - 4).

Фазовый контраст

В исследованиях полупроводниковых устройств фазово-контрастные изображения высокого разрешения используются при измерениях толщины подзатворного оксида (рис. 5), метрологии субнанометровых деталей структур и идентификации тонких межфазных слоев, которые могут вызывать сбои устройств. Большинство современных ПЭМ оснащаются линзами высокого разрешения, характеризующимися разрешающей способностью менее 2,5 Å, в то же время, в более совершенных ПЭМ используются новые системы коррекции аберраций, позволяющие достигнуть разрешения менее 1Å.

Сканирующая просвечивающая электронная микроскопия (СПЭМ)

Когда электронный луч проходит через образец, происходит упругое (без потерь энергии) и неупругое (c потерями энергии) рассеивание электронов. Доля неупруго рассеянных электронов увеличивается с увеличением толщины образца. В режиме параллельной (одновременной) регистрации ПЭМ вклад неупруго рассеянных электронов негативно влияет на качество изображения, потому что возникают хроматические аберрации линз, используемых для увеличения объекта и формирования изображений. Сканирующая просвечивающая микроскопия (СПЭМ) менее восприимчива к таким хроматическим аберрациям, поскольку для формирования и увеличения изображений такие линзы не требуются. Это преимущество СПЭМ очень полезно для визуализации толстых (>200 нм) образцов, часто встречающихся при анализе отказов.

Метод с использованием электронов, рассеянных под большими углами (обычно более 50 мрад) называют STEM-HAADF-исследованием или методом кольцевого темного поля при больших углах, а также методом получения Z-контрастных изображений. Его часто используют для визуализации межфазных дефектов (рис. 6, 7).

Transmission electron microscopy

Увеличение просвечивающего микроскопа

В просвечивающей электронной микроскопии, ПЭМ (Transmission electron microscopy,ТЕМ) электроны ускоряются до 100 кэВ или выше (до 1 МэВ), фокусируются на тонкий образец (толщиной менее 200 нм) с помощью конденсорной линзовой системы и проходят через образец либо отклоняясь, либо не отклоняясь. Основными преимуществами ПЭМ являются высокое увеличение, в пределах от 50 до 10 6 , и ее способность получать как изображение, так и дифракционную картину с одного и того же образца.

Рассеяние, претерпеваемое электронами во время прохождения через образец, определяет вид получаемой информации. Упругое рассеяние происходит без потерь энергии и позволяет наблюдать дифракционные картины. Неупругие столкновения между первичными электронами и электронами таких неоднородностей образца, как границы зерен, дислокации, частицы второй фазы, дефекты, вариации плотности и т.д., приводят к сложным процессам поглощения и рассеяния, которые ведут к пространственным вариациям интенсивности прошедших электронов. В ПЭМ можно переключаться из режима формирования изображения образца в режим регистрации дифракционной картины путем изменения напряженности поля электромагнитных линз.

Высокое увеличение или разрешение всех просвечивающих электронных микроскопов является результатом малой эффективной длины волны электрона X, которая задается соотношением де Бройля:

где m и q - масса и заряд электрона, h - постоянная Планка, а V - ускоряющая разность потенциалов.Например, электроны с энергией 100 кэВ характеризуются длиной волны 0,37 нм и способны эффективно проникать через слой кремния толщиной ˜0,6 мкм.

Разрешение просвечивающего микроскопа

Чем больше ускоряющее напряжение просвечивающего электронного микроскопа, тем выше его латеральное пространственное разрешение. Теоретический предел разрешения микроскопа пропорционален λ 3/4 . Просвечивающие электронные микроскопы с высоким ускоряющим напряжением (например, 400 кВ) имеют теоретический предел разрешения менее 0,2 нм. Высоковольтные просвечивающие электронные микроскопы обладают дополнительным преимуществом - большей глубиной проникновения электронов, так как высокоэнергетичные электроны слабее взаимодействуют с веществом, чем низкоэнергетичные электроны. Поэтому на высоковольтных просвечивающих электронных микроскопах можно работать с более толстыми образцами. Одним из недостатков ПЭМ является ограниченное разрешение по глубине. Информация о рассеянии электронов в ПЭМ-изображениях исходит из трехмерного образца, но проецируется на двухмерный детектор. Следовательно, информация о структуре, получаемая вдоль направления электронного пучка, взаимонакладывается на плоскости изображения. Хотя основной проблемой метода ПЭМ является подготовка образцов, она не столь актуальна для наноматериалов.

Дифракция от ограниченной области (SAD) предлагает уникальную возможность определения кристаллической структуры отдельных наноматериалов, например нанокристаллов и наностержней, и кристаллической структуры отдельных частей образца. При наблюдении дифракции от ограниченной области конденсорные линзы дефокусированы для создания параллельного пучка, падающего на образец, а для ограничения объема, участвующего в дифракции, используется апертура. Картины дифракции от ограниченной области часто используются для определения типа решеток Браве и параметров решеток кристаллических материалов по алгоритму, аналогичному используемому в РД [1]. Несмотря на то, что ПЭМ не способна различать атомы, электронное рассеяние исключительно чувствительно к материалу мишени, и для химического элементного анализа разработаны различные виды спектроскопии. К ним относятся энерго-дисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDAX) и спектроскопия характеристических энергетических потерь электронов (EELS).

Просвечивающий электронный микроскоп и нанотехнологии

В нанотехнологии ПЭМ используется не только для диагностики структуры и химического анализа, но и для решения других задач. Среди них - определение температур плавления нанокристаллов, когда электронный луч используется для нагрева нанокристаллов, а точка плавления определяется по исчезновению электронной дифракционной картины. Другим примером является измерение механических и электрических параметров отдельных нанонитей и нанотрубок. Метод позволяет получить однозначную корреляцию между структурой и свойствами нанонитей.

Вывод

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) незаменима для анализа твердых материалов. Сложное оснащение прибора позволяет провести исследования элементного состава и структуры кристаллической решетки образца. Пробоподготовка и продолжительный процесс исследования - делают данный метод исследования довольно трудоемким, но необходимым для разработки новых материалов, локализации и идентификации дефектов и отказов.

Большая Энциклопедия Нефти и Газа

Высокая разрешающая способность электронного микроскопа открыла новые возможности в изучении такого важного явления, как поверхностная диффузия на твердых телах. Уже в ранних работах по прикладной электронной микроскопии был отмечен ряд качественных наблюдений в этом отношении. [16]

Предельная разрешающая способность электронных микроскопов , как и других сйето - и электроннооптиче-ских приборов, ограничивается явлением дифракции. [17]

Улучшение разрешающей способности электронных микроскопов в сочетании с увеличением их ускоряющего напряжения обусловливает возможность широкого применения метода прямого разрешения для исследования кристаллических, в том числе металлических объектов. Электронно-микроскопические изображения, полученные этим методом, дают наиболее наглядное представление ( в пределе - на атомном уровне) о структуре реального объекта. [18]

Однако реально разрешающая способность электронного микроскопа значительно ниже вследствие электронно-оптической аберрации - искажений, размытия электронно-оптических изображений, вызываемых потерей энергии при взаимодействии электронов с веществом, нестабильностью источников питания и электронных линз и др. Тем не менее разрешение современных электронных микроскопов достигает 0 3 - - 0 5 нм, что позволяет получать изображение частиц во всем диапазоне размеров, соответствующих коллоидным растворам. [19]

Период систематического увеличения разрешающей способности электронных микроскопов , начало которому было положено в 1931 г. работами Кнолля и Руски, был фактически завершен в 1946 г., когда Хиллиер и Рамберг [1] устранили астигматизм объектива и достигли разрешающей способности, лишь незначительно отличающейся от теоретического предела. Хотя барьер на пути дальнейшего прогресса имеет чисто техническую природу, все же он достаточно грозен для того, чтобы помешать любым существенным улучшениям в прямом направлении. [20]

Что касается до разрешающей способности электронного микроскопа как такового, то она практически ограничивается не только диффракцией, но и аберрациями линз. [22]

Кроме того, и разрешающая способность электронного микроскопа ограничена; поэтому по мере приближения гэ к величине порядка 10 А точность измерений будет катастрофически убывать. В результате оказывается очень трудно надежным образом промерить начальный участок кривой распределения. [23]

Наряду с дифракцией аберрация ограничивает разрешающую способность электронных микроскопов ее современным значением. [24]

Но к несчастью, самая лучшая разрешающая способность электронных микроскопов приближается только к 20 А. [25]

Проводимые Табором исследования имели целью увеличение разрешающей способности электронного микроскопа . [27]

К 1946 г. закончился период систематического увеличения разрешающей способности электронных микроскопов , когда устранили астигматизм объектива и достигли разрешающей способности, лишь незначительно отличающейся от теоретического предела. Он определяется компромиссом между дифракцией и сферической аберрацией в электронных линзах. Следовательно, чтобы еще больше повысить разрешающую способность электронных микроскопов, нужно каким-то способом корректировать электронную линзу. Было видвинуто несколько предложений, но они давали надежду лишь на незначительные успехи. [28]

Чтобы определить число кластеров с размерами, значительно меньшими разрешающей способности электронного микроскопа , авторы работ 16 воспользовались методом декорирования частиц в парах Zn. Известно, что пары ряда металлов ( Zn, Cd, Hg и др.) при обычных условиях плохо конденсируются на чистых поверхностях, но могут осаждаться на зародышевых агрегациях Ag, Аи, Pd. [29]

Только в некоторых специальных случаях, например при оценке теоретического предела разрешающей способности электронного микроскопа , необходимо использовать методы волновой оптики. [30]

Читайте также: