Инактивирующий реагент а для безопасной работы с микобактериями туберкулеза

В 2004 году по инициативе д.м.н., профессора Михаила Александровича Владимирского, заведующего сектором молекулярной диагностики туберкулёза НИИ Фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова, мы начали разработки в области ПЦР-диагностики туберкулёза.

Выделение ДНК: использование оригинальных реагентов и магнитных частиц обеспечивает получение максимального количества чистой ДНК и позволяет автоматизировать процесс выделения ДНК.

ПЦР в реальном времени: одновременная детекция нескольких различных участков генома комплекса микобактерий туберкулёза (МБТ) увеличивает информативность и достоверность анализа.

I этап – Пробоподготовка, инактивация

II этап – Выделение ДНК

набор реагентов для выделения ДНК (на магнитных частицах)

набор реагентов для выделения ДНК микобактерий из клинических образцов и культур клеток на автоматизированных станциях TECAN

Снижение риска контаминации во время выделения ДНК практически до нуля.
Значительное уменьшение трудоёмкости процесса выделения ДНК.
Стандартизированное выделение ДНК из клинических образцов.
Экономическая выгода: низкий расход пластика и реактивов.

набор реагентов для ускоренной пробоподготовки и выделения ДНК микобактерий из образцов мокроты

III этап – ПЦР в реальном времени

Обнаружение и количественное определение комплекса МБТ

Набор реагентов АМПЛИТУБ-РВ — это:

высокая достоверность анализа благодаря одновременному обнаружению двух специфичных генов M.tuberculosis complex: IS6110 и regX3;
оценка пригодности образца ДНК для определения антибиотикоустойчивости;
высокая чувствительность (не более 100 КОЕ/мл мокроты или 1–10 копий фрагментов ДНК в реакции) и 100%‑ая специфичность, подтверждённые на панели QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics) Mtb EQA (UK).

Определение антибиотикоустойчивости МБТ к препаратам I и II ряда

Наборы реагентов АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ, АМПЛИТУБ-FQ-РВ — это:

диагностика форм туберкулеза с лекарственной устойчивостью, в том числе множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ);
быстрая детекция мутаций M.tuberculosis, ассоциирующихся с устойчивостью к антибиотикам первого и второго ряда (рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам);
достоверность результатов, ежегодно подтверждаемая при проведении Федеральной службой внешней оценки качества (ФСВОК) Росздравнадзора испытаний шифрованных тест-культур и образцов.

Наборы АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ и АМПЛИТУБ-FQ-РВ основаны на использовании оригинальной мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени, позволяющей выявлять мутации в генах микобактерий туберкулеза, ответственных за устойчивость к конкретным антибиотикам.

Принцип мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени

В формате одной пробирки используются 5’-флуоресцентно-меченые аллель-специфичные праймеры с общим комплементарным им 3’-меченым олигонуклеотидом-гасителем и контрольный флуоресцентный зонд, комплементарный участку ДНК без мутаций.
При отсутствии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается только по флуорофору зонда.
При наличии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается как по флуорофору зонда, так и по флуорофору 5’-флуоресцентно-меченого аллель-специфичного праймера. Данный метод позволяет определить не только точку мутации, но и процент устойчивого мутантного штамма МБТ на фоне дикого.

Интерпретация результатов выявления мутаций на примере
531 кодона rpoB гена M.tuberculosis

Гены, кодоны, замены, используемые в наборах реагентов
АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ при определении антибиотикоустойчивости

Использование автоматизированных станций Freedom EVO (TECAN, Швейцария) для молекулярно-генетической диагностики туберкулёза

Трудозатраты — 1 час
Продолжительность выделения ДНК — не более 2 часов
Подготовка к амплификации и ПЦР-РВ — 1,5 часа

ИТОГО: результаты анализа будут готовы через 3,5 часа
Оператор затратит 1 час своего рабочего времени.

Закон закупки 44-ФЗ

Закон, регулирующий правовые отношения в области государственных закупок.

Неустойка по 44-ФЗ: разбираемся с особенностями начисления
Чем обычный договор отличается от контракта по 44-ФЗ
Переторжка по 44-ФЗ и 223-ФЗ: особенности, процедура проведения
Расширили список запрещенных иностранных товаров по 44 ФЗ
Вопрос: Я продаю компьютеры. Могу ли я участвовать в закупках по 44фз, если у меня нет документов о том, что эта техника - российского происхождения?
Сравниваем 44-ФЗ и 223-ФЗ: таблица для чайников
Как проходят закупки у СМП по 223-ФЗ и 44-ФЗ
Существенные условия контракта по 44-ФЗ: что к ним относится и можно ли их изменять?
Как оплатить неустойку по 44-ФЗ
Идентификационный код закупки (ИКЗ) по 44-ФЗ: определение, формирование, расшифровка и поиск закупок по ИКЗ
В каких случаях указывать и подтверждать страну происхождения товара по 44-ФЗ?
Исключения из правил: что нельзя закупить по 44-ФЗ или 223-ФЗ
Национальный режим при осуществлении закупок по 44-ФЗ и 223-ФЗ: запреты, ограничения, условия допуска
Что такое госзакупки: полное определение понятия, виды закупок по 44-ФЗ
Независимый регистратор по 44-ФЗ: обзор, функции, цели, плюсы и минусы использования
Способы закупок по 44-ФЗ и 223-ФЗ
Оплата по контракту по 44-ФЗ: как получить вовремя
Что изменилось в закупках в конце мая: обзор Постановлений Правительства
Предметы роскоши по 44-ФЗ: как их опознать
Что не так с 44-ФЗ, или Почему злится Артемий Лебедев
Банковское сопровождение контракта по 44-ФЗ: виды, случаи и порядок осуществления

Заказчик

ИНН: 4207022150 / КПП: 420501001

Права поставщика, о которых молчат заказчики
Общение с заказчиками
Контракт исполнен, а оплаты нет - знакомая ситуация?
Топ-5 ловушек заказчика в документации
ФАС в шоке: новое нарушение госзаказчиков
Положение о закупках по 223-ФЗ: содержание, структура, примеры
Заказчик не платит
Топ-5 ловушек заказчика в техзадании
Как заказчики злоупотребляли своими правами
Кто такие государственные заказчики
Любовь заказчика к ПДФ (pdf)
Может ли заказчик поменять техзадание после публикации закупки?
Об исчезновении строительства детского сада.
Заказчик разместил аукцион на ремонтные работы. Сроки выполнения работ - нереальные. Стоит ли участвовать?
"Зачем потеть и страдать, затачивая техзадание под своего подрядчика?" - подумал как-то заказчик и обратился к компьютерщикам.
Может ли поставщик увидеть заявки конкурентов?
Ошибки заказчика и обжалование действий заказчика
Как отличить убытки от неустойки

Информационная лента

При прокрутке вниз Вы можете получить очень полезную информацию, подобранную специально для Вас нашей программой. А также самые интересные и актуальные статьи о тендерах и закупках, которые мы подобрали для Вас на просторах интернета.

Портал отображает информацию о закупках, публикуемых в сети интернет
и находящихся в открытом доступе, и предназначен для юрлиц и индивидуальных предпринимателей,
являющихся участниками размещения государственного и коммерческого заказа. Сайт использует Cookie, которые нужны для авторизации пользователя.
На сайте стоят счетчики Яндекс.Метрика, Google Analytics и LiveInternet,
которые нужны для статистики посещения ресурса.

Позиция	Кол.	Ед. изм	Цена	Сумма	Доля
1. Реагент для безопасной работы с микобактериями туберкулеза	2	ШТ	2 400,00 ₽	4 800,00 ₽	100,00 %

В закупочной документации не найдены недействующие или несуществующие стандарты и нормы

Проводник по сделке

Протокол подведения итогов

Когда
опубликовано Подать заявку до 44-ФЗ - №0354200021220000079 131 052,17 ₽ 0,00 % 100,00 % 01.04.2020 09:34 МСК 09.04.2020 09:00 МСК

44-ФЗ - №0354200021220000080 561 781,60 ₽ 0,00 % 100,00 % 01.04.2020 09:28 МСК 09.04.2020 09:00 МСК

44-ФЗ - №0354200021220000078 24 833,33 ₽ 0,00 % 100,00 % 30.03.2020 09:22 МСК 08.04.2020 08:51 МСК

Посмотреть все закупки заказчика

Карточка будет добавлена в Избранное

В случае публикации текущей закупки, она заменит отслеживаемую будущую, Вы получите уведомление

Понравилась закупка? Оцените свои возможности, примите решение об участии, подготовьте необходимые документы

Вы подали заявку на участие в аукционе?

Допущены к торгам?

Организатор торгов отклонил Вашу заявку и Вы не согласны с данным решением?

Аукцион! Выигрывает тот, кто предлагает наиболее выгодные условия и цену.

Ожидайте результатов аукциона, отслеживайте соблюдение сроков:

Вы победитель? Поздравляем! Предоставьте Заказчику обеспечение исполнения контракта и подпишите контракт

Строго соблюдайте сроки. Соотношение рабочих и выходных дней не принципиально:

Соотношение рабочих и выходных дней принципиально:

Преимущества для Субъектов Малого Предпринимательства и Социально Ориентированных Некоммерческих организаций:

Сумма обеспечения - до 2% от стоимости контракта.
Оплата закупки - не более 15 дней с момента подписания документа о приемке.

Возможно увеличение цены контракта до 15%, но не более начальной цены в случаях:

Если продавец - организация инвалидов
Если продавец - предприятие уголовно-исполнительной системы
Товарам/работам/услугам, произведенным на территории государств - членов Евразийского экономического союза

В данной закупке могут принималь участие только организации - субъекты малого предпринимательства и социально ориентированные некоммерческие организации

Установлен запрет на продажу товаров, происходящих из иностранных государств, работ, услуг, соответственно выполняемых, оказываемых иностранными лицами

В отношении участников закупки установлено требование о привлечении к исполнению договора субподрядчиков (соисполнителей) из числа субъектов малого и среднего предпринимательства

Участниками закупки могут быть только субъекты малого и среднего предпринимательства

Туберкулез - хроническая инфекция с длительным периодом выделения возбудителя, многообразием клинических проявлений, поражением различных органов и систем - представляет непростую задачу для лабораторной диагностики. Молекулярно-биологические методы (ПЦР) используются для выявления, видовой дифференциации и определении лекарственной устойчивости микобактерий туберкулезного комплекса.

Ввиду биологических особенностей возбудителя и иммунного ответа человека диагностика туберкулеза не может ограничиваться каким-либо одним методом и должна проводиться комплексно.

Возбудители туберкулеза могут быть обнаружены в различных биоматериалах, природа которых определяет выбор наборов реагентов для экстракции ДНК. Ключевой принцип выбора биоматериала для диагностики туберкулеза методом ПЦР: необходимо выбирать биоматериал, соответствующий клинической форме туберкулезной инфекции.

Например, для диагностики туберкулеза мочеполовой системы нужно исследовать мочу или менструальную кровь, рекомендуется также исследовать биоптаты из подозрительного очага. Для диагностики туберкулеза легких используется мокрота, бронхо-альвеолярный лаваж.

Реагенты и оборудование для предобработки биоматериалов и экстракции ДНК

Наборы реагентов для экстракции ДНК из мокроты, бронхо-альвеолярного лаважа, мочи, синовиальной жидкости и смывов с объектов окружающей среды	АмплиПрайм ДНК-сорб-В и АмплиПрайм РИБО-преп
Реагент для разжижения мокроты и синовиальной жидкости	Муколизин
Набор для экстракции ДНК, используемый при исследовании биоптатов (легкие, лимфатические узлы, почки, печень, мозг, селезенка)	ДНК-сорб-С
Оборудование для гомогенизации биоптатов	TissueLyser LT или TissueLyser II
Парафиновые блоки нарезают на микротоме или вырезают фрагмент ткани одноразовым скальпелем, а затем проводят экстракцию ДНК, например, с помощью набора реагентов QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50)	QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50)

Наборы реагентов для ПЦР-диагностики туберкулеза

Применение молекулярно-биологических методов (в частности, выявление ДНК методом ПЦР) в диагностике туберкулеза регламентировано Приказом Минздрава РФ от 21.03.2003 № 109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" (ред. от 29.10.2009).

Выявление микобактерий туберкулезного комплекса

Набор реагентов АмплиСенс® МТС-FL предназначен для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза – Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), включающий в себя виды микобактерий разной степени вирулентности, вызывающих туберкулез у человека (M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum, M.microti, M.canetti, М.pinipedii).

Микобактерии туберкулеза выявляются без видовой дифференциации; микобактерии, не относящиеся к MTC (например, M.avium и M.paratuberculosis) - не выявляются. Данный набор реагентов используется в топической диагностике туберкулеза и позволяет быстро (за несколько часов) с высокой чувствительностью и специфичностью (близким к 100%) определять наличие микобактерий туберкулеза в образце биоматериала.

Благодаря высокой скорости и информативности в диагностике туберкулеза, методы амплификации нуклеиновых кислот (в том числе ПЦР) в 2010 году были предложены CDC США для подтверждения диагноза туберкулеза наряду с культуральным методом.

Видовая дифференциация микобактерий туберкулеза методом ПЦР

Не менее важно дифференцирование до вида внутри группы MTC. Это связано с необходимостью определения источника заболевания, определения тактики противотуберкулезной терапии, а также для подтверждения случаев поствакцинальных осложнений.

С этой задачей позволяет справиться набор реагентов АмплиСенс® МТС-diff-FL, предназначенный для дифференцирования видов микобактерий туберкулеза внутри MTC: человеческого (M.tuberculosis), бычьего (M.bovis) и вакцинного штамма (M.bovis BCG) – в клиническом материале и культурах микроорганизмов.

Актуальность видовой дифференциации определяется, например, тем, что разные виды микобактерий отличаются профилем лекарственной устойчивости. Например, M.bovis и её вакцинный штамм M.bovis BCG отличаются природной резистентностью к одному из основных противотуберкулезных препаратов - пиразинамиду. Поэтому при туберкулезе, вызванной M.bovis, и БЦЖите пиразинамид не назначается.

Приказом Минздрава РФ от 21.03.2003 № 109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" (ред. от 29.10.2009) регламентировано применение наборов реагентов, дифференцирующих M.bovis от ее вакцинного штамма M.bovis BCG, для диагностики БЦЖита.

Определение лекарственной устойчивости туберкулеза

Распространение штаммов туберкулеза с лекарственной устойчивостью, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ, или MDR) составляет одну из серьезнейших проблем современного здравоохранения. Определение лекарственной устойчивости туберкулеза с помощью молекулярно-биологических методов всё шире применяется ввиду высокой скорости получения результатов (1-2 дня), что становится возможным благодаря использованию не только первичной культуры, но и непосредственно клинического материала.

Важно понимать, что наборы реагентов, основанные на разных молекулярно-биологических методах, характеризуются разными показателями диагностической чувствительности и специфичности.

Наименование набора реагентов	АмплиСенс® MTC-Rif-Seq	АмплиСенс® MTC-PZA-Seq
Исследуемый ген	rpo B	pnc A
Препараты, к которым определяется устойчивость	рифампицин	пиразинамид
Кол-во выявляемых мутаций	более 200	более 500

Наборы включают реагенты для амплификации фрагментов ДНК микобактерий туберкулеза, очистки продуктов амплификации (сорбентным методом), определения концентрации очищенного продукта амплификации и праймеры для секвенирования. Наборы для экстракции ДНК (АмплиПрайм РИБО-преп или ДНК-сорб-С ) и реагенты для проведения реакции секвенирования приобретаются отдельно.

Нормативные документы, публикации, информационные материалы >>

Компания гарантирует всем своим сотрудникам: своевременную выплату достойной заработной платы; исполнение государственных гарантий трудовых прав в соответствии с Трудовым Кодексом РК; дополнительные льготы и компенсации в с.

Инновация - Выявление микобактерий туберкулёза и их устойчивости к различным группам антибиотиков

1. ПЦР в реальном времени: теория, варианты, возможности

Развитие молекулярно - биологических технологий

1868 год – первые данные о химических свойствах ДНК
Начало 50- годов XX в. – ДНК – это линейный полимер, состоящий из нуклеотидов, состоящих из азотистого основания, пентозы и фосфатной группы. Основания бывают двух типов: пуриновые – аденин и гуанин и пиримидиновые – цитозин и тимин.
1953 год – Д. Уотсон и Ф. Крик – нативная ДНК состоит из двух комплементарных полимерных цепей, образующих двойную спираль.

Развитие молекулярно - биологических технологий

История

1985 год - первая публикация, в которой использован метод ПЦР Kary Mullis и соавторов. Saiki, R.K., Scharf S, Faloona F, Mullis K.B., Horn G.T., Erlich HA, Arnheim N., 1985. Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science 230, 1350.
1993 год - Нобелевская премия в области химии Kary Mullis.
1992 год - первая публикация Higuchi и соавторов, в которой использован метод ПЦР в реальном времени. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., Griffith, R., 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA-sequences. Bio-Тechnology 10(4), 413–417

Что такое ПЦР?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод, имитирующий естественную репликацию ДНК, "in vitro" аналог биохимической реакции синтеза ДНК в клетке. ПЦР позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации, заключенный в специфической последовательности нуклеотидов ДНК любого организма среди огромного количества других участков ДНК и многократно размножить его. ПЦР позволяет получить количество ДНК, достаточное для детекции.

диагностика инфекционных заболеваний;
диагностика онкологических заболеваний;
диагностика генетических заболеваний;
идентификация личности;
диагностика патогенов в пище;
диагностика ГМО и др.

Схема ПЦР

ПЦР – циклический процесс, каждый цикл которого включает в себя три этапа, характеризующихся определенной продолжительностью и температурным режимом.

ПЦР: состав реакционной смеси

1. Целевая ДНК из образца любой природы (известная нуклеотидная последовательность) - ПЦР-мишень, которая будет многократно копироваться в ходе реакции.

2. Праймеры – 2 искуственно синтезированных фрагмента ДНК, комплементарные районам, находящимся на противоположных нитях и фланкирующим искомую ДНК-мишень, с праймеров начинается удваивание цепи ДНК.

ПЦР: состав реакционной смеси

Виды детеции ПЦР - амплификации

Электрофорез в агарозном геле

Детекция методом электрофореза в агарозном геле (только по конечной точке): разделение заряженных молекул (ДНК) в пористом геле в зависимости от их размера под действием электрического поля

Размер ампликона можно оценить, сравнив его пробег с пробегом молекул ДНК известной длины

Электрофорез в агарозном геле

Преимущества:

1. Не требуется сложного оборудования
2. Низкая стоимость реактивов

Недостатки:

1. Высокий риск контаминации (загрязнения продуктами предыдущих ПЦР)
2. Требуется дополнительное помещение и персонал для стадии детекции продукта
3. Трудоемкость
4. Только качественный анализ (есть/нет)

Флуоресцентный метод детекции

Флуоресцентный метод детекции по конечной точке (FLASH): пробирки с продуктами ПЦР анализируются специальным флуоресцентным детектором.

Преимущества:

1. Низкая стоимость оборудования для детекции
2. Низкая трудоемкость
3. Не требуется дополнительного помещения и персонала
4. Снижение риска контаминации
5. Автоматическая регистрация и интерпретация данных

Недостатки:

1. Только качественный анализ (есть/нет)
2. Более дорогие реактивы (по сравнению с форезом)

Что такое ПЦР в реальном времени (real-time PCR) ?

Флуоресцентный метод детекции в режиме реального времени
(real-time PCR):

Определение выхода продукта после каждого цикла амплификации
Построение по этим данным кинетической кривой ПЦР
Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой

Стадия детекции совмещена со стадией амплификации.

Кинетические кривые ПЦР в реальном времени

Кинетическая кривая ПЦР в координатах "Уровень флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму.

В ней можно выделить три стадии:

Стадию инициации (когда ПЦР-продукты еще не детектируются флуоресцентной меткой);
Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР);
Плато (стадию насыщения).

Пороговый цикл (threshold cycle, C(T)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень флуоресценции – пороговая флуоресценция.

Значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата.

ПЦР-РВ позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

Сравнение ПЦР и ПЦР - РВ

Флуоресцентные зонды

Делятся на две категории:

использующие неструктурированные линейные зонды (TaqManTM, LightCycler, Lanthanide, EclipseTM);
использующие структурные зонды (Molecular Beacons, ScorpionsTM , CycliconsTM).

красители на 5’ и 3’ концах зонда

один из красителей внутри цепи ( натимидине или цитидине)

Преимущества и недостатки систем ПЦР-РВ со специфической детекцией

Преимущества систем, использующих флуоресцентные олигонуклеотидные зонды:

специфичность не ограничивается специфичностью праймеров, дополнительная специфичность за счет комплементарного зонда;
возможность проведения мультиплексной ПЦР (до 4-х красителей);
огромный выбор вариантов ПЦР-РВ.

сложный дизайн зондов и праймеров;
высокая стоимость, т.к. на каждый фрагмент требуется свой специфический зонд.

Преимущества ПЦР-РВ

измерение исходного количества специфической ДНК (РНК) в исследуемом образце;
широкий динамический диапазон от единичных до 109 копий;
возможность сравнительного количественного анализа для нескольких различных ДНК-мишеней в одной пробирке одновременно;
обнаружение и определение процентного содержания ДНК с измененной последовательностью;
исключение послеамплификационных манипуляций с продуктом, и, как следствие, существенное снижение риска контаминации, сокращение времени анализа, упрощение организации ПЦР лаборатории;
автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.

Что необходимо для работы по технологии ПЦР в реальном времени:

прибор для ПЦР-РВ;
программное обеспечение;
реактивы – наборы, тест-системы, праймеры и зонды;
вспомогательное оборудование – центрифуги, вортексы, ламинар;
расходные материалы – пробирки, стрипы, плашки.

2. Определение антибиотикоустойчивости

Особенности МБТ

медленная скорость роста возбудителей;
внутриклеточная локализация;
высокая плотность (концентрация) клеток патогена (М.tuberculosis) в пораженном органе – до 10 млрд на легкое;
способность клеток к переходу в фазу отсутствия роста с реактивацией через несколько лет;
природная резистентность к ряду антимикробных агентов.

Все это приводит к хронической инфекции с необходимостью поддержания высокого уровня лекарственных препаратов в организме больного в течение ряда месяцев, в связи с чем обостряется проблема токсичности используемых лекарств.

Виды антибиотикоустойчивости

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ или MDR – Multi-Drug Resistance) – вид устойчивости МБТ к двум основным ПТП – изониазиду и рифампицину одновременно (независимо от наличия резистентности к др. препаратам). 450,000 новых случаев туберкулеза с МЛУ - ежегодно.
Экстенсивная или широкая лекарственная устойчивость – (XDR – Extensively Drug Resistant) множественная лекарственная устойчивость в сочетании с устойчивостью к фторхинолонам и к одному из группы инъекционных препаратов: канамицину или/и амикацину или/и капреомицину. 27,000 новых XDR случаев туберкулеза - ежегодно. Лечение XDR туберкулеза крайне трудно.
Экстремальная или абсолютная лекарственная устойчивость – (XXDR – Extremely Drug Resistant) – устойчивость ко всем ПТП. В 2007 г. - первая публикация о двух зарегистрированных случаях абсолютно устойчивого туберкулеза (XXDR) в Италии.
Перекрестная лекарственная устойчивость – явление, когда возникновение устойчивости к одному препарату влечет за собой устойчивость к другим ПТП. Обусловлена сходством химической структуры некоторых ПТП.

Диагностика лекарственной чувствительности/устойчивости

Определение антибиотикоустойчивости с помощью ПЦР-РВ

Определение лекарственной чувствительности с помощью ПЦР-РВ – определение генных мутаций, ассоциирующихся с устойчивостью к определенным противотуберкулезным препаратам.

Аллель-специфичная ПЦР: для эффективной ПЦР 3’-концевой нуклеотид праймера должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду ДНК-матрицы, иначе эффективность удлинения праймера во время ПЦР резко снижается или может отсутствовать совсем.

Преимущество АС-ПЦР: позволяет получать информацию не только о наличии мутации в геномной ДНК, но и ее аллельном распределении.

АС-ПЦР в формате реального времени – возможность одностадийного быстрого и точного анализа мутаций !

Схема метода определения мутаций на основе технологии аллель-специфичной ПЦР-РВ

Интерпретация результатов выявления мутаций на примере 531 кодона rpoB гена M.tuberculosis

Апробация технологии мультиконкурентной аллель-специфичной ПЦР

2005 г. – испытания шифрованных тест-культур из супранациональной лаборатории Швеции; 2008-2009 гг. – ФСВОК испытания панели образцов на антибиотикоустойчивость
2006 г. – мониторинг более 2000 клинических образцов культур из 25 регионов РФ
2007 г. – клинические испытания шифрованных образцов мокроты
2007-2008 г. – регистрация в ГИСК им. Тарасевича
2007-2008 г. – разработка тест-систем, определяющих устойчивость к фторхинолонам, капреомицину, амикацину
2010 г. – получены регистрационные удостоверения на наборы М-СОРБ-ТУБ, АМПЛИТУБ-РВ, АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ

Результаты мониторинга лекарственной устойчивости по федеральным округам РФ

Сравнение ПЦР-РВ анализа и бактериологического исследования лекарственной устойчивости к RMP и INH

Совпадение результатов ПЦР-РВ и метода пропорций 99.5%

Апробация технологии мультиконкурентной аллель-специфичной ПЦР-РВ

Разработанный метод мультиконкурентной аллель-специфичной ПЦР-РВ позволяет быстро (1-3 дня) определять антибиотикоустойчивость 90-100% потенциально устойчивых штаммов со специфичностью 99-100%.

Результаты сравнительных испытаний

Уровень совпадений результатов определения лекарственной чувствительности между культуральными исследованиями и методом ПЦР-РВ составил:

по двум типам антибиотиков (фторхинолоны и капреомицин/амикацин) – 87%
по фторхинолонам – 84,1%;
по капреомицин/амикацину – 89,6 %.

Чувствительность анализа методом ПЦР-РВ, по сравнению с культуральным, составила 90% (фторхинолоны - 90%, капреомицин/амикацин – 90%).

Специфичность анализа – 98% (фторхинолоны - 96%, капреомицин/амикацин – 100%).

ПЦР-РВ технология

возможность работы как с культурами, так и с клиническими образцами
высокая специфичность метода позволяет анализировать смешанные штаммы
автоматический расчет результатов анализа с указанием количества выявленного возбудителя в образце и конкретных мутаций, определяющих устойчивость к определенным препаратам
открытая система (возможность использования реагентов разных производителей, возможность использования материала для всех задач комплексного анализа МБТ)
требует 2 помещений при организации ПЦР-лаборатории

Выделение ДНК на примере реагентов производства компании Синтол

Сочетает сорбцию ДНК на магнитных частицах и осаждение ДНК в присутствии осаждающего реагента, специально разработан для выделения туберкулезной ДНК из клинического материала.

Адаптирован для автоматического выделения ДНК микобактерий на роботизированных станциях TECAN

Выделение ДНК – на роботизированной станции TECAN

снижает риск контаминации во время выделения практически до нуля
существенно уменьшает трудоемкость процесса выделения
экономически эффективная система (низкий расход пластика и реактивов)
позволяет проводить стандартизированное выделение ДНК из клинических образцов
специально разработан для выделения ДНК микобактерий из клинического материала и культуры клеток
обеспечивает высокую эффективность выделения ДНК из клинических образцов мокроты
выделение ДНК основано на сорбции ДНК на оригинальных магнитных частицах
включает внутренний положительный контроль (ВПК), позволяющий контролировать ингибирование ПЦР-РВ и эффективность выделения

Заключение

В настоящий момент в Российской Федерации, согласно Приказу № 109 министерства здравоохранения, подтверждение диагноза для всех случаев туберкулеза, так же как и контроль эффективности лечения (ежемесячно), осуществляется методом посева.

Основным недостатком метода являются длительные сроки получения результатов (21-28 суток), обусловленные медленным ростом микобактериальной популяции.

Метод ПЦР позволяет за короткое время (несколько часов) провести одновременно качественный и количественный анализ как на сами микобактерии туберкулёза, так и на их лекарственную устойчивость.

Однако, постановка ПЦР анализа имеет высокие требования к чистоте эксперимента и профессионализму сотрудников.

Читайте также: