Обнаружение микобактерий туберкулеза в мокроте

Общие свойства мокроты и ее микроскопия. До того как мокрота будет исследована на наличие микобактерий, лаборант по ее внешнему виду определяет количество, запах, цвет, консистенцию, характер. Жидкую мокроту, состоящую из гнойных клеток, определяют как гнойную; мокроту с преобладанием гноя или слизи — как гнойно-слизистую или сли-зисто-гнойную; мокроту без гноя, содержащую только слизь, как слизистую, содержащую только кровь,— как кровянистую, а с примесью слизи и гноя — как кровянисто-слизисто-гнойную.

По консистенции мокрота может быть тягучей, студенистой, умеренно вязкой, жидкой.

Далее под микроскопом исследуют нативный препарат мокроты, для чего готовят 2 препарата на одном предметном стекле и накрывают двумя покровными стеклами. Исследование проводят при малом увеличении (объектив 10, окуляр 7) и с объектом 40.

В нативном препарате определяют наличие лейкоцитов, эозинофилов, эритроцитов, клеток эпителия, эластических и других видов волокон и прочих элементов.

Для диагностики туберкулеза большое значение имеет обнаружение в препарате эластических волокон, присутствие которых указывает на разрушение ткани. Эластические волокна в мокроте могут быть и при других заболеваниях (например, при абсцессе легких, новообразованиях, эхинокок-козе и др.). Под микроскопом эластические волокна имеют вид длинных, блестящих волокнистых образований равномерной толщины.

При наличии каверны эластические волокна покрываются мылами и приобретают вид кораллов. Коралловидные волокна образуются при наличии в каверне жира, солей кальция и магния, образующих мыла, которые и покрывают эластические волокна. Если в мокроту добавить 10 % раствор едкой щелочи, то мыла очищаются и выявляются обычные эластические волокна.

Большое диагностическое и прогностическое значение имеет выявление в препарате так называемой тетрады Эрлиха, в которую входят следующие элементы:

• 1) обызвествленные эластические волокна,
• 2) обызвествленные частицы жирового распада,
• 3) кристаллы холестерина,
• 4) измененные микобактерии туберкулеза.

Такие элементы в мокроте наблюдаются при распаде старых обызвествленных очагов.

Методы обнаружения и выделения возбудителя туберкулеза. Наиболее надежным подтверждением диагноза туберкулеза является обнаружение возбудителя в выделениях больного или взятых из организма материалах.

Основным материалом для исследования является мокрота. При отсутствии мокроты исследуют слизь из гортани или промывные воды бронхов, иногда — промывные воды желудка. Исследованию подлежат также моча, кал, спинномозговая жидкость, экссудат из плевральной полости, ас-цитическая жидкость, пунктат из закрытых натечников. При необходимости исследуют кусочки тканей или органов, взятые у больных во время операции. Материал для исследования должен быть взят с соблюдением правил асептики.

Результаты исследований во многом зависят от правильности сбора материала, его обработки и хранения. Важное значение имеет и правильное приготовление мазков или материала для посева на питательные среды.

Для обнаружения МТ в выделениях больного применяют бактериоскопический (микроскопия мазков), бактериологический (посев материала на питательные среды) и биологический (заражение лабораторных животных) методы.

Сбор и подготовка материала для исследования.

Мокрота. Следует собирать утренние порции мокроты и исследовать ее в тот же день. Если у больного мало мокроты, то ее собирают в течение дня (суточная мокрота). Для усиления секреции мокроты применяют раздражающую аэрозольную ингаляцию, для чего используют аэрозольный ингалятор типа АИ-1. Для ингаляции рекомендуется 15 % раствор натрия хлорида в 1 % растворе натрия гидрокарбоната. Ингалируют 30—60 мл раствора, нагретого до 42—45 °С. Индивидуальные мерные стаканчики и мундштуки подлежат дезинфекции. При отсутствии мокроты у больных получают промывные воды бронхов. У детей чаще исследуют промывные воды желудка, так как они плохо откашливают мокроту и заглатывают ее.

Лучше исследование мокроты проводить до начала лечения ежедневно в течение 3 дней подряд. Объяснить больному, что он должен собирать не носоглоточную слизь и слюну, а отделяемое из верхних дыхательных путей при кашле.

Перед сбором мокроты больной должен прополоскать рот и зев кипяченой водой. Мокрота должна быть собрана в стерильную плевательницу. Промывные воды бронхов получает врач-ларинголог. Для микроскопии и посева используют осадок, полученный при центрифугировании промывных вод.

Моча. В мочу могут попасть непатогенные микобактерии смегмы, которые имеют морфологическое сходство с мико-бактериями туберкулеза. Поэтому перед взятием мочи необходим тщательный туалет наружных половых органов. Утреннюю мочу следует брать стерильным катетером в стерильную посуду. Если результат утренней порции мочи отрицателен, то 2—3 дня подряд берут суточную порцию мочи, которую отстаивают в течение ночи, верхний слой сливают, а остаток центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин. Осадок используют для приготовления мазка и посева.

Кал. В хлопьях слизи и гноя можно обнаружить микобактерии туберкулеза (методом бактериоскопии и посева).

Спинномозговая жидкость. Ее оставляют на сутки при комнатной температуре. На поверхности жидкости образуется фибринозная пленка, из которой и делают мазок на стекле. При отсутствии пленки жидкость центрифугируют при 2000 об/мин в течение 30 мин, после чего ее сливают, а из осадка делают мазок.

Бактериоскопия (микроскопия) мазков. Микроскопическое исследование мазков является наиболее простым, доступным, дешевым и быстрым методом обнаружения микобактерий. Он остается одним из основных методов исследования.

Недостатком прямой бактериоскопии окрашенных мазков является низкая чувствительность метода. При микроскопии можно обнаружить М'Г в мокроте, если в 1 мл мокроты содержится не менее 10000—100000 палочек. В настоящее время под влиянием химиотерапии количество микробов в мокроте значительно снижается, что создает дополнительные трудности в выявлении возбудителя. В связи с этим в повседневной практике работы широко применяют методы обогащения и накопления микобактерий, которые позволяют концентрировать возбудителей туберкулеза в небольшом объеме материала. Совершенствуются и сами методы бактериоскопии и выделения возбудителя.

Мазки для микроскопии готовят из любого материала, полученного от больного (мокрота, кал, моча, плевральный экссудат, гной, спинномозговая жидкость).

Приготовление мазков из мокроты. Мокроту выливают в чашку Петри, под которую подкладывают лист черной бумаги, на фоне последней хорошо заметны жел-тогнойные комочки, которые и следует отбирать. Гнойные комочки деревянными заостренными палочками переносят на предметное стекло. Мазок готовят путем растирания комочков между 2 стеклами. Затем мазок высушивают на воздухе, фиксируют путем проведения мазка через пламя горелки и окрашивают по Цилю-Нильсену.

Окраска мазка по Цилю-Нильсену. На мазок наливают основной фуксин Циля и подогревают его до появления пара. После остывания мазка краску сливают и мазок промывают водопроводной водой, обесцвечивают 10—15 % раствором серной кислоты или 3 % раствором солянокислого спирта до появления бледно-розового цвета и после этого снова промывают водой. Затем мазок докрашивают 0,5 % раствором метиленового синего в течение 1/2 мин. Мазок промывают водой и высушивают.

На мазок наносят каплю кедрового масла и микроско-пируют. Микобактерии под микроскопом окрашены в рубиново-красный цвет в виде тонких прямых или слегка изогнутых палочек и располагаются единично или небольшими группами на сине-голубом фоне, в который окрашены вещество мокроты и различные клетки. При лечении химиопрепаратами микобактерии часто приобретают вид толстых и грубых палочек, похожих на кокки, и имеют более светлую окраску.

Бактериоскопия дает приблизительно на 10 % больше положительных результатов при использовании метода флотации, позволяющего в 5—10 раз увеличить концентрацию микобактерий.

Метод флотации заключается в том, что бензин, бензол, ксилол, толуол и другие углеводороды легче воды, добавленные в мокроту с водой, при встряхивании разбиваются на мельчайшие капельки, которые, поднимаясь кверху, адсорбируют на себе микобактерии.

В банку объемом 250 мл со стеклянными бусами вносят 10—15 мл мокроты (или другого исследуемого материала — кал, осадок мочи, экссудата и др.), добавляют примерно равное количество 0,5—1 % раствора едкого натра и встряхивают до полного разжижения мокроты. Затем добавляют 100 мл дистиллированной воды и 0,5—1 мл любого углеводорода и встряхивают в течение 5—10 мин. После этого в бутылку добавляют дистиллированной воды до горлышка и оставляют при комнатной температуре на 30—60 мин. На поверхности появляется беловатое пенистое флотационное кольцо, которое отсасывают пастеровской пипеткой с резиновым баллончиком и наносят на предметное стекло. По мере подсыхания капли на нее наносится новая порция. Наслаивание после подсыхания проводится 4—5 раз. После этого мазок фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену.

Для концентрации возбудителя широко применяют также метод седиментации (осаждения). К мокроте прибавляют равный объем 10 % раствора натрия фосфата, который является хорошим гомогенизатором мокроты, не нарушает жизнедеятельность микобактерий и в то же время угнетает рост сопутствующей микрофлоры. После добавления натрия фосфата смесь инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч, затем центрифугируют 5—10 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость потом сливают, а осадок используют как для посева, так и для микроскопии.

Более чувствительной является люминесцентная микроскопия, которая на 20—30 % по сравнению с обычной увеличивает положительный результат. Этот метод основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные краски, которые светятся при облучении их короткими синими или ультрафиолетовыми лучами. Светящиеся микобактерии хорошо видны. Мазок можно просматривать при малом увеличении гораздо быстрее, чем при объективе с иммерсией. Мазок готовят как обычно, фиксируют смесью Никифорова и пропитывают специальными красителями (флюорохромами): аурамином в разведении 1:1000 или родамином С. Затем мазок обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают кислым фуксином. Под микроскопом микобактерии светятся на темном фоне ярким золотисто-зеленым цветом. Микроскопию проводят в люминесцентном микроскопе или на обычном с опакиллюминатором (насадкой), пропускающим короткие синие и ультрафиолетовые лучи.

Недостаток метода микроскопии состоит в том, что он не позволяет безусловно дифференцировать патогенные и непатогенные микобактерии. С целью ориентировочной дифференциации патогенных и непатогенных микобактерий при микроскопии используют более длительное обесцвечивание мазков кислотой или спиртом. Сапрофиты после этого частично или полностью обесцвечиваются, а патогенные микобактерии удерживают окраску.

В последние годы появилась возможность отличать в мазках живые и мертвые микобактерии, что может служить дополнительным важным критерием оценки эффективности лечения. Суть метода состоит в том, что дезоксирибонуклеи-новая кислота (ДНК) живых микобактерий воспринимает окраску метиленовым зеленым, а у мертвых ДНК этой окраской не окрашивается. В то же время ДНК мертвых микобактерий может окрашиваться дополнительными красителями: пиронином, сафронином или карболовым фуксином.

Наиболее надежным, достоверным и чувствительным методом диагностики туберкулеза является метод выделения чистой культуры микобактерий (бактериологический). Этот метод позволяет выявить микобактерии при содержании 20—100 возбудителей в исследуемом материале, увеличивает положительный результат на 15—30 %. Выделенную культуру можно изучить, дифференцировать от непатогенных микобактерий, определить ее вирулентность и устойчивость возбудителя к лечебным препаратам. Недостатками бактериологического метода являются сложность обработки материала и длительный рост возбудителя на средах.

Засеваемый материал гомогенизируют и одновременно обрабатывают серной или соляной 6 % кислотой или 4—6 % раствором едкого натра для уничтожения посторонней микрофлоры. Осадок после центрифугирования служит материалом для посева. Посев производят на яичную среду Левенштейна-Йенсена, которая рекомендована Всемирной организацией здравоохранения в качестве стандартной среды. Посев материала делают в 5 пробирок. При обработке материала серной кислотой вся процедура подготовки для посева должна быть выполнена быстро — в пределах 15 мин, так как более длительная экспозиция в кислоте снижает способность микобактерий к росту. Микобактерии вырастают на среде на 15—25-й день после посева. Жидкие материалы (моча, ликвор, экссудат, промывные воды желудка и бронхов) перед посевом необходимо центрифугировать и для устранения посторонней микрофлоры обработать осадок 3 % раствором серной кислоты в течение 20 мин. После этого обработанный кислотой материал повторно центрифугируют, а осадок используют для посева на среду. Ликвор, полученный стерильно, засевают без обработки кислотой.

Можно делать также посев мазка из гортани. Мазок берут ватным тампоном с надгортанника под контролем гортанного зеркала. Тампон помещают в небольшой объем 3—5 % раствора серной кислоты, отжимают его, а раствор центрифугируют. Осадок засевают на среду.

Иногда пользуются ускоренными методами посевов, из которых наиболее известен метод Прайса. Этот метод состоит в том, что подсушенный мазок мокроты после обработки его в серной кислоте и промывания погружают в пробирки с кровяной средой на 7—10 дней. Затем мазок промывают, сушат, фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену. Применение для обработки мокроты поверхностно-активных веществ (лаурилсульфат; лауросепт и др.) значительно увеличивает рост микобактерий.

Для посева патологического материала используют плотные, полужидкие и жидкие питательные среды, но ни одна из них не обладает всеми необходимыми качествами. Поэтому посев делают на 2—3 различные среды. Чистые культуры выделяют на плотных, полужидких яичных и агаровых средах.

В настоящее время обязательно определение устойчивости микобактерий к стрептомицину, тубазиду и ПАСКу (парааминосалициловая кислота). С этой целью готовят набор сред Левенштейна с тремя разными концентрациями каждого препарата. Микобактерии, которые растут при концентрации 10 мкг/мл и более стрептомицина и ПАСКа и при концентрации 1 мкг/мл и более тубазида, считаются лекарственно-устойчивыми.

Большое значение в микробиологической диагностике туберкулеза имеет определение количества микобактерий в исследуемом материале для оценки тяжести процесса, тактики лечения и его эффективности.

Биологический метод исследования основан на заражении патологическим материалом морских свинок, которые очень чувствительны к туберкулезной инфекции. Этот метод признается более чувствительным для обнаружения микобактерий. Появление измененных под влиянием химиотерапии микобактерий иногда дает отрицательные результаты заражения животных при положительных результатах посева на среды. Это происходит в результате значительного снижения или полной утраты микобактериями вирулентности. С целью повышения количества положительных результатов морским свинкам перед заражением ежедневно вводят большие дозы кортизона, снижающего их резистентность. Через 3—4 нед после введения исследуемого материала морской свинке ставят туберкулиновую пробу. Положительная реакция будет свидетельствовать о присутствии микобактерий туберкулеза. Если животное не погибает через 3 мес, его забивают и различные ткани подвергают микроскопическому исследованию. Для целей диагностики этот метод в настоящее время имеет ограниченное применение, поскольку посев на питательные среды дает достаточно хорошие результаты.

В распознавании и дифференциальной диагностике туберкулеза, а также в определении эффективности проводимого лечения важную роль играют лабораторные методы исследования. Среди них большое значение имеют прежде всего способы обнаружения микобактерии туберкулеза в различных выделениях, воспалительных экссудатах, жидкостях и тканях организма больного.

При туберкулезе легких микобактерии находят прежде всего в мокроте. Частота, массивность и постоянство бацилловыделения зависят от формы процесса. Оно часто имеет место при инфильтративном и особенно деструктивном туберкулезе легких. Реже или периодически выделяют микобактерии больные очаговыми, диссеминированными и цирротическими формами туберкулеза без явного распада легочной ткани. Существенное значение имеет при этом состояние бронхов. При их специфическом поражении, но сохраненной дренажной функции микобактерии выявляются с мокротой сравнительно чаще и с большим постоянством, чем при нормальном состоянии бронхов или при их стенозе, вызывающем блокаду каверны.

Микобактерии туберкулеза находят в большом количестве в обильно выделяющейся мокроте, а в скудном отделяемом, наоборот, они встречаются реже и в виде единичных экземпляров. У больных, не выделяющих мокроту, лучшие результаты дает применение раздражающих аэрозольных ингаля пий 10—15% раствора поваренной соли в 1% растворе питьевой соды Н. М. Рудой и соавт. (1971) применяют с этой целью смесь, состоящую из 5 мл 10% раствора хлорида натрия, 1 мл химопсина, растворенного в физиологическом растворе, и 20 капель солутана.

Второе место по эффективности выявления бацилловыделения у больных, не выделяющих мокроту, занимает исследование промывных вод трахеи и бронхов, которое предложил Я. С. Зобин (1939). В настоящее время для анестезии гортани у взрослых применяют 0,25% раствор дикаина, разведенный в 10% растворе новокаина. Этот раствор наливают во время фонации на голосовые связки в количестве 0,5—1 мл. У больных с повышенным глоточным рефлексом этим раствором смазывают заднюю стенку глотки. Затем в трахею шприцем с напаянной канюлей вводят 10—20 мл физиологического раствора комнатной температуры.

При этом в результате раздражения слизистой оболочки бронхов возникает кашель, при котором из глубоких дыхательных путей вместе с введенной жидкостью выделяются слизь и мокрота. Это отделяемое исследуют на присутствие микобактерии туберкулеза или другой микробной флоры.

Исследование промывных вод бронхов редко сопровождается серьезными осложнениями. Только при сильном, длительном и приступообразном кашле иногда появляется кровохарканье, может аспирироваться инфекционный материал в здоровые участки легочной ткани, нарастает сердечная недостаточность. Такие явления отмечаются главным образом у больных с сопутствующей бронхиальной астмой, пороком сердца, гипертонией. В подобных случаях, очевидно, не следует прибегать к данному методу исследования. При отсутствии таких противопоказаний, особенно у больных с ограниченными формами процесса, у которых чаще всего и возникает необходимость в исследовании промывных вод бронхов, обычно не наблюдается каких-либо осложнений, и поэтому его можно производить не только в клинических, но и в амбулаторных условиях.

Менее эффективно производимое натощак исследование промывных вод желудка, в которых может содержаться бациллярная мокрота или бронхиальная слизь, чаще заглатываемая детьми, а иногда и взрослыми (Аrmand-Dellille, 1927). Кроме того, микобактерии могут проникать в желудок через его слизистую оболочку при гематогенном распространении инфекции в организме, а также при забрасывании бациоллосодержащей желчи (М. Д. Розанова, 1950). Пользоваться этим методом рекомендуется в тех случаях, когда не удается получить мокроту при раздражающих ингаляциях, при противопоказаниях к применению промывания бронхов или при невозможности их проведения по другим причинам.

Наименее информативно определение бацилловыделения с помощью исследований мазков слизи из гортани, а также промывания только верхних отделов дыхательных путей.

У части больных можно выделить микобактерии из крови. По наблюдениям 49 авторов, обобщенным в 1954 г. Dalencour, бациллемия отмечалась в среднем у 5,3% больных различными формами туберкулеза. П. И. Беневоленский (1945) установил ее у 3,7% больных туберкулезом легких (исключая страдающих гематогенным процессом). Чаще обнаруживают микобактерии в крови при туберкулезе кожи, обширных гематогенных диссеминациях в легких, при менингите. Однако, по сводным данным Kallos (1937). основанным на изучении гемокультур, выделенных от 14 502 больных, туберкулезная бациллемия имела место всего лишь у 1,13% из них.

Частота выявления микобактерии зависит не только от формы заболевания, метода получения материала, но и от способа его исследования (бактериоскопия, посев, заражение животных). Микобактерии туберкулеза обнаруживают при прямой бактериоскопии мазков мокроты, окрашенных по Цилю—Нельсену, при микроскопии с использованием метода обогащения — флотации и люминесцентного способа исследования. Методы обогащения повышают частоту обнаружения микобактерии туберкулеза в мокроте, промывных водах желудка и бронхов, в экссудате, спинномозговой жидкости, в каловых массах на 10—20% по сравнению с результатами прямой бактериоскопии.

Среди бактериоскопических методов выявления бацилловыделения наиболее чувствительным является люминесцентная микроскопия, повышающая возможность обнаружения в мокроте микобактерии на 15—20% по сравнению с обычной бактериоскопией, а при исследовании мазков из флотационных колец — на 8—10%. При этом облегчается изучение некоторых биологических свойств возбудителя — старения культур, аутолиза клеток и др.

Некоторые авторы утверждают, что при флюоресцентной (люминесцентной) микроскопии микобактерии туберкулеза можно выявить даже чаще, чем при посевах мокроты и других материалов на различные питательные среды. Kolbel (1955) обнаружил их при простой бактериоскопии у 39,7% больных, при бактериологическом методе — у 52,1%, а при люминесцентной микроскопии — у 73,6%. На преимущество последнего метода указывают Т. Н. Ященко и И. С. Мечева (1973), Н. С. Страхов и соавт. (1973).

Для суждения об эффективности проводимой антибактериальной терапии придают прогностическое значение уменьшению (или сохранению) в динамике массивности бацилловыделения. Поэтому целесообразно не только констатировать бацилловыделение, но и оценивать его количественный показатель. При этом при бактериоскопии бацилловыделение оценивается как обильное, если находят микобактерии в каждом поле зрения, умеренное — при наличии «единичных микробов в 40—50 полях зрения и скудное — при нахождении их единичных экземпляров в препарате.

Лабораторная диагностика обеспечивает выполнение главной задачи диагностики и лечения туберкулеза — выявление у больного МБТ. В лабораторную диагностику на современном этапе входят следующие методики:

1) сбор и обработка мокроты;

2) микроскопическая идентификация МБТ в выделяемых субстанциях или тканях;

4) определение резистентности к препаратам;

5) серологические исследования;

6) использование новых молекулярно-биологических методов, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и определение полифиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Сбор мокроты, содержащей МБТ

, проводится в специально подготовленном помещении больницы или в амбулаторных условиях. Собранные образцы должны быть немедленно отосланы для микробиологического исследования.

Для этого необходимо использовать специальные контейнеры. Они должны быть прочными, устойчивыми к разрушению, иметь широкую горловину с герметически завинчивающейся пробкой, чтобы предотвратить случайное вытекание из нее содержимого.

При сборе образцов риск инфицирования очень большой, особенно когда больной выкашливает мокроту. В связи с этим процедуру необходимо проводить как можно дальше от посторонних лиц и в специальном помещении.

Дополнительные процедуры для сбора МБТ

Бронхоскопия. В том случае, если другие методы не сумели обеспечить постановку диагноза, применяется сбор материала непосредственно из бронхов, через бронхоскоп. Биопсия выстилающих бронхи тканей может иногда содержать типичные для туберкулеза изменения, выявляемые при гистологическом исследовании.

Плевральная жидкость. В плевральной жидкости МБТ могут быть выявлены с помощью флотации, но обычно обнаруживаются только в культуре. Чем большее количество жидкости используется для культурального Исследования, тем вероятней положительный результат.

Биопсия плевры. Биопсия плевры может быть полезна в тех случаях, когда имеется плевральный выпот. Для ее проведения необходимы обученный персонал, средства для проведения гистологического исследования, специальная биопсийная игла.

Биопсия легкого. Биопсия легкого должна выполняться хирургом в стационарных условиях. Диагноз может быть сделан на основе гистологического исследования или обнаружения МБТ в секционном материале.

Микроскопия мокроты

Уже более 100 лет существует самый простой и быстрый метод выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУБ) — микроскопия мазка. КУБ — это микобактерий, способные оставаться окрашенными даже после обработки кислотными растворами. Они могут быть выявлены с помощью микроскопа в окрашенных образцах мокроты. Микобактерий отличаются от других микроорганизмов характерным составом своей клеточной стенки, состоящей из миколовых кислот. Кислоты благодаря своим сорбционным свойствам обеспечивают способность окрашиваться по методикам, выявляющим КУБ.

Резистентность к стандартным методам окрашивания и способность МБТ сохранять раннее окрашивание является следствием высокого содержания липидов во внешней оболочке клетки. Вообще грамположительные бактерии в своем составе имеют приблизительно 5% липидов или воска, грамотрицательные организмы — около 20% и МБТ — примерно 60%.

При простом методе мазки приготавливают из комочков мокроты или капель жидкого вещества (экссудата, промывных вод и др.). Материал помещают между двумя предметными стеклами. Один из мазков окрашивают по Граму на общую флору, другой — на туберкулезные микобактерии.

Основным методом окрашивания является карбол-фуксиновый (метод Циля-Нильсена). Главный принцип этого метода — в способности наружной оболочки МБТ адсорбировать карбол-фуксин. Поглощая красный карбол-фуксин, наружная мембрана МБТ настолько прочно связывает краску, что ее нельзя удалить обработкой серной кислотой или солянокислым спиртом. Затем образец обрабатывается метиленовым синим. При эмерсионной микроскопии МБТ появляются в виде красных палочек на синем фоне.

Начиная с 1989 г., в современных лабораториях флюоресцентная микроскопия в значительной степени вытеснила старые методы, основанные на кислотоустойчивости микобактерии. Этот метод базируется на тех же свойствах МБТ, связанных со способностью наружной мембраны МБТ, богатой липидами, удерживать соответствующий краситель, в данном случае — аурамин-родамин. МБТ, поглощая это вещество, одновременно устойчивы к обесцвечиванию солянокислым спиртом. При этом МБТ, окрашенные аурамин-родамином, флюоресцируют под воздействием ультрафиолета или других световых спектров, выделенных соответствующими фильтрами. Под воздействием ультрафиолета МБТ проявляются как ярко-желтые палочки на черном фоне.

Подготовка образца для культурального исследования

При поступлении в современную лабораторию диагностического материала с возможным содержанием МБТ проводятся следующие диагностические манипуляции:

1. Обработка материала миколитическими разжижающими веществами с целью удаления белковых масс.
2. Деконтаминация образца для удаления сопутствующей бактериальной флоры.
3. Встряхивание смеси и ее отстаивание.
4. Холодное центрифугирование.
5. Содержимое центрифужной пробирки используется для микроскопии посева на:

5.1. плотную яичную среду (Левенштейна-Йенсена или Финна III);

5.2. агаровые среды (7Н10 и 7Н11);

5.3. автоматизированную систему бульонного культивирования (МВ/ВасТ или ВАСТЕС MGIT 960).

Молекулярно-генетические методы диагностики МБТ

Расшифровка генома МБТ открыла неограниченные перспективы в разработке генетико-молекулярных тестов, в том числе в изучении и выявлении МБТ и диагностике в организме человека.

Классические методы, применяемые для обнаружения в организме микобактерий туберкулеза, такие, как бактериоскопия, культуральный, иммуноферментный, цитологический, весьма эффективны, но отличаются или недостаточной чувствительностью, или длительностью выявления МБТ. Развитие и совершенствование молекулярно-диагностических методов открыло новые перспективы для быстрого выявления микобактерий в клинических образцах.

Наибольшее распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Этот метод основан на амплификации особых фрагментов бациллярной ДНК, которая обнаруживается в диагностических образцах. Тест предназначен для выявления МБТ в мокроте или идентификации разновидности бактерий, которые произрастают в культуральной среде.

Реакция ПЦР позволяет проводить идентификацию МБТ в диагностическом материале за 5-6 ч (включая обработку материала) и обладает высокой специфичностью и чувствительностью (в диапазоне от 1-10 клеток в образце).

Мокрота как биоматериал – что это?

В здоровом организме бронхи вырабатывают слизь без цвета и запаха, которая необходима для того, чтобы очищать дыхательные пути от попадающих туда микроскопических частичек пыли, вдыхаемого мусора и микробов. Механизм очищения органов дыхания очень прост: реснички эпителия, устилающего их, поднимают слизь наверх вместе с чужеродными частицами. В норме такой мокроты вырабатывается очень мало, поэтому здоровый человек не замечает ее отделения, и она проглатывается вместе со слюной.

Но на фоне любого воспалительного процесса, сопровождающего, какое-либо заболевание дыхательных путей, в том числе и туберкулеза, количество продуцируемой бронхами мокроты значительно возрастает. Это связано, в первую очередь, с раздражением бокаловидных клеток, а также, при присоединении воспалительного процесса, когда клетки иммунной системы организма начинают поглощать патогенные микроорганизмы, образуются гнойные массы. Они также формируют отделяемое в виде мокроты при заболеваниях дыхательных путей. С помощью кашля организм выводит эту жидкость – именно с помощью нее диагностируются многие бронхо — легочные патологии и выявляется степень и характер течения воспалительного процесса.

Количество выделяемой при влажном кашле мокроты также указывает на некоторые особенности течения заболевания. При этом она может, не выводится посредством кашля совсем (трудноотделяемая мокрота) или, наоборот, биоматериал можно собрать без каких-либо трудностей. Два самых распространённых исследования этого отделяемого – это бактериоскопия и посев: именно эти два этапа позволяют провести точную диагностику заболевания, вызвавшего повышенное отделение мокроты и как следствие, влажный кашель с рядом сопутствующих симптомов.

Как собирается мокрота для анализа

1. Для начала необходимо позаботиться о контейнере – его можно купить в любой аптеке. Это специализированная емкость для сбора мокроты: она стерильна, с широким горлышком и крышкой. Также контейнер могут выдать в медицинском учреждении. Необходимый объем биоматериала для исследования – 5мл, поэтому емкость должна быть соответствующая.
2. Самым подходящим временем для сбора мокроты являются утренние часы, поскольку за время ночного сна скапливается достаточное количество и собрать ее гораздо легче. Однако бывают такие обстоятельства, когда мокрота забирается в любое время суток.
3. Перед тем, как приступить к сбору мокроты на анализ, тщательно прополоскать ротовую полость, при этом чистить зубы перед этим нельзя.
4. Биоматериал для анализа собирается следующим образом: сделав максимально глубокий вдох, задержать дыхание, после чего медленно выдохнуть – повторить еще раз. Сделав третий глубокий вдох, резко выдохнуть, как бы выталкивая воздух из лёгких, и как следует откашляться. Во время этого рот должен быть прикрыт марлевой повязкой.
5. Контейнер необходимо придерживать у нижней губы — сплюнуть в него все содержимое, которое получилось откашлять и плотно закрыть стерильную баночку крышкой.
6. Если после одного раза мокроты отошло очень мало, то процедуру следует повторить, для того чтобы собрать необходимое для исследования количество(5-7 мл.)

Для начала можно попробовать поменять положение тела при откашливании: облегчают отхождение мокроты наклоны вниз, положения, лежа на боку или на животе.

Если такие меры не привели к положительному результату, то можно принять отхаркивающие средства или сделать ингаляцию. Отхаркивающие препараты назначает лечащий врач, и начинать принимать их необходимо за сутки до сбора мокроты (бромгексин, амбробене и другие традиционные препараты). Совместно с приемом таких препаратов необходимо употреблять достаточно большое количество жидкости для облегчения отхождения мокроты.

Ингаляцию для этой цели делают на основе раствора соды и соли. Вдыхать такую смесь следует через небулайзер 10-15 минут(40-60 мл.). Если начинается усиленное слюноотделение, то ее нужно сплюнуть, только потом собирать мокроту.

Если не удается собрать мокроту всеми вышеперечисленными способами, то пациенту назначается процедура бронхоскопии. Еще такое исследование проводится в случаях, когда необходимо собрать секрет мокроты с бронхов, без примесей слюны и носоглоточной микрофлоры.

Процедура проводится посредством двух методик:

• В бронхи вводится 100-200 мл. физ. раствора через вставленный катетер, после чего полученная жидкость посредством аспирации выводится обратно.
• В просветы бронхиального дерева вводят катетер для прямой аспирации слизи.
  Пациенту необходимо пройти подготовку к этой процедуре: не употреблять пищу и жидкость в течение 6 часов, как правило, она назначается на утреннее время, чтобы пациенту было легче выдержать такой интервал времени. А после нее не употреблять аспириносодержащие препараты, которые обладают способностью разжижать кровь.
  И промывные воды, и непосредственно мокрота, полученные таким способом, используются для всех видов исследований на данном биоматериале.

Если сдача мокроты проводится в условиях стационара, то медицинский работник предоставляет пациенту специально оборудованную процедурную, консультирует по поводу процедуры сдачи и контролирует весь процесс. Также медработник подписывает контейнер с биоматериалом и отправляет его на исследование.

Показания для сдачи мокроты на анализ

Анализ мокроты на туберкулез позволяет выявить легочный тип развития заболевания. Основными показаниями для его проведения являются:

• Кашель затяжного характера (влажный или сухой);
• Выявленные затемнения на снимках рентгена;
• Повышенная температура тела.

Для постановки диагноза туберкулез легких, анализ мокроты является обязательным в спектре исследований, проводимых при подозрении на данное заболевание. Обязательным исследование на инфицирование туберкулезом считается в тех случаях, когда больной больше трех месяцев страдает от сухого кашля, который не поддается никаким видам лечения.

В связи с тем, что биоматериал для исследования на микобактерии берется не только при помощи непосредственного отхаркивания, но и путем бронхоскопии, данное исследование имеет противопоказания. При процедуре бронхоскопии вводится трубка в верхние органы дыхания под общей или местной анестезией. Поэтому, такая методика забора анализа противопоказана:

• пациентам, страдающим аллергией на обезболивающие медикаменты;
• людям с тяжелой дыхательной недостаточностью;
• с нарушениями свертываемости крови;
• пациентам, в ближайшие пол года перенесшим инфаркт миокарда или инсульт;
• с такими заболеваниями, как эпилепсия и шизофрения.

Детям до 18 лет процедура бронхоскопии назначается и делается только с согласия родителей. Сама процедура является безопасной и осложнения вызывает крайне редко, но препараты, предназначенные для общей и местной анестезии, могут вызывать непереносимость и аллергические реакции. Этот вопрос необходимо обязательно обсудить перед процедурой с лечащим врачом.

Самым весомым плюсом этого анализа является стопроцентная точность диагностики и возможность выявления туберкулеза на ранних этапах заражения. Тест включает в себя забор нескольких проб, которые способны однозначно указать присутствие или отсутствие возбудителя в легких пациента.

Сам анализ вариативен, и проводить его можно удобным для пациента способом; данная методика выполняется в короткие сроки, и доставляет минимум дискомфорта пациенту.

Такой метод сбора анализа на микобактерии не имеет побочных воздействий на организм пациента. Нет необходимости вводить медицинские препараты или сдавать анализы крови, мочи. По сути, сбор анализа на микобактерии происходит естественно, без особых трудностей и дискомфорта для пациента. Часто это становится актуально, когда речь идет о малолетних детях, которые весьма негативно переносят такие диагностические процедуры.

С помощью такого информативного метода, как бронхоскопия, медики имеют возможность выявить и другие патологии небактериального характера на ранних сроках (бронхиальная астма, рак легких и т.д.). Расширенное исследование качественного состава мокроты позволяет произвести диагностику на любом этапе развития заболевания . Таким образом, анализ может не только подтвердить или опровергнуть диагноз туберкулез, но и установить причину возникновения тревожной симптоматики.

К минусам можно отнести достаточно долгое ожидание результата анализа. На это есть две главные причины: многостороннее обследование биоматериала, включающее в себя бактериологический анализ и посев мокроты на питательные типы сред, который и является самым долгосрочным видом исследования. Время ожидания может растянуться от 3 недель до двух месяцев.

К отрицательной стороне также можно отнести многократное проведение бронхоскопии при подозрении на заражение туберкулезом, при отсутствии главного симптома – кашля.

Методы исследования мокроты на микобактерии туберкулеза

После того как биоматериал поступил на исследование в лабораторию, специалист в первую очередь, занимается его визуальной оценкой. При тяжелых формах туберкулеза, например, в мокроте наблюдаются вкрапления крови или кровяные сгустки. Но такое отделяемое не является стопроцентным показателем заражения туберкулезом – наличие крови в мокроте может говорить и о крупозной пневмонии, и об опухолевых процессах, о бронхоэктатической болезни.

Если все же речь идет о туберкулезном заражении, то при дальнейшем исследовании в мокроте будут обнаружены микобактерии. В современной медицине используются две основных проверенных временем методики лабораторного исследования мокроты: бактериоскопическая и культуральная (биологическая).

Бактериоскопия применяется в диагностике туберкулеза уже более ста лет. Она включает в себя макроскопическое описание, микроскопическое исследование – при нем выявляются эритроциты, волокна легочной ткани, коралловидные, спириллы Куршмана и т.д. В мокроте зараженного туберкулезом пациента обнаруживаются, помимо микобактерий, темные фрагменты (зерна) – это частицы старых, распадающихся очагов.

Этот метод используется не только для выявления и диагностики такого коварного заболевания, как туберкулез, также он помогает в выборе рациональных схем химиотерапии и оценке их клинической эффективности.

Бактериологическая диагностика проводится в таком порядке:

1. Обработка материала, поступившего в лабораторию.
2. Микроскопическое исследование мокроты.
3. Посев мокроты на туберкулез.
4. Идентификация микроорганизма при помощи бактериологического и биохимического тестирования.
5. Определение лекарственной чувствительности туберкулезной палочки.

Проводится исследование мокроты на туберкулез с помощью двух методов: обычная (простая) бактериоскопия и метод флорации. Простой метод включает в себя приготовление мазков из комочков мокроты – их помещают между двумя предметными стеклами. Затем одна часть биоматериала окрашивается по Грамму на общую флору, а другая – на микобактерии туберкулеза.

С начала 90-х годов многие современные лаборатории стали использовать в диагностике туберкулеза флюоресцентную микроскопию, основанную на кислотоустойчивости микобактерии. Под воздействием ультрафиолетового излучения туберкулезные палочки проявляются в ярко-желтом цвете на черном фоне.

Культуральный метод включает в себя такие диагностические процедуры:

1. Удаление белковых масс путем обработки мазка разжижающими веществами.
2. Удаление сопутствующей бактериальной формы с помощью деконтаминации образца.
3. Встряхивание.
4. Отстаивание смеси.
5. Помещение в холодную центрифугу.
6. После этого содержимое пробирки отбирается на посев:
   • агаровой среды,
   • плотной яичной среды,
   • бульонного культивирования автоматизированного типа.

Культуральный посев мокроты повышает точность исследования в разы — при более легких степенях развития заболевания, при которых бактериологический метод может показать отрицательный результат. Однако работа таким методом требует хорошо оснащенных, современных лабораторий, которых, к сожалению, не имеют многие небольшие города и поселки городского типа.

Самыми быстрыми и точными видами анализов на обнаружение туберкулезной палочки являются молекулярно-генетические методы диагностики. Это современные комплексы анализов, включающие в себя расшифровку генома микобактерии туберкулеза. Такие молекулярно-диагностические методы открыли в современной медицине хорошие перспективы на последующее развитие эффективных методик борьбы с этим коварным заболеванием. Наиболее часто используется способ полимеразной цепной реакции – это тест предназначен для выявления микобактерии в мокроте или установления вида бактерий в культуральных средах.

Что имеет первостепенное значение в постановке диагноза — это время: вместе с обработкой материала, идентификация туберкулезной палочки занимает всего 5-6 часов. Кроме того, реакция ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью, что является залогом стопроцентно точного результата.