Приказы по микробиологической диагностике туберкулеза
II. ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭТАПЫ ЛАБОРАТОРНОЙ
С целью повышения эффективности лабораторной диагностики, унификации применяемых методов и обеспечения качества микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза на территории Российской Федерации вводится единая система проведения лабораторных исследований, включающая три этапа:
1) Первичное исследование диагностического материала в учреждениях ОЛС и в противотуберкулезных учреждениях. Целью данного этапа является определение наличия/отсутствия кислотоустойчивых микобактерий в мокроте или другом диагностическом материале методом прямой микроскопии среди лиц с подозрением на туберкулез по клиническим и/или рентгенологическим симптомам. На данном этапе выявляется наиболее эпидемически опасная категория пациентов.
По решению местных органов управления здравоохранением, принимаемому с учетом географических особенностей, плотности населения, транспортных возможностей и других социально-экономических факторов, микроскопические исследования могут проводиться централизованно на базе лабораторий центральных районных больниц. При этом необходимо предусмотреть организацию регулярной и своевременной доставки диагностического материала из прикрепленных учреждений, а также обеспечить адекватную организацию мест сбора диагностического материала с соблюдением необходимых санитарно-эпидемических норм. Централизация исследований способствует лучшему управлению контролем качества выполнения исследований.
2) Диагностика микобактерий туберкулезного комплекса культуральными методами в противотуберкулезных учреждениях. На этом этапе осуществляется верификация положительных или сомнительных результатов первичного лабораторного исследования, а также диагностика случаев туберкулеза с отрицательными результатами первичного исследования диагностического материала методами микроскопии. Этот этап обеспечивают бактериологические лаборатории противотуберкулезных учреждений.
3) Определение лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам и идентификация выделенного возбудителя в бактериологических лабораториях противотуберкулезных учреждений (II - IV уровни) - сложные и затратные исследования, требующие соответствующего лабораторного оснащения и обученного персонала.
На бактериологические лаборатории противотуберкулезных учреждений возлагаются обязанности по оказанию организационно-методической помощи КДЛ ОЛС, обучению их персонала и внешний контроль качества выполняемых КДЛ микроскопических исследований путем повторного исследования части препаратов.
К работе с материалом, зараженным туберкулезными и нетуберкулезными микобактериями (III - IV группы), допускаются лаборатории, имеющие специальное разрешение в соответствии с федеральными санитарными правилами, нормами и гигиеническими нормативами.
Бактериоскопическое исследование является первым, наиболее быстрым, простым и дешевым методом выявления кислотоустойчивых микобактерий. Однако метод, даже при использовании самой совершенной микроскопической техники (люминесцентной), не позволяет обнаружить микобактерии при содержании их менее 5000 - 10000 микробных тел в 1 мл материала. Такое количество микобактерий в мокроте коррелирует с далеко зашедшими прогрессирующими формами процесса, тогда как на начальной стадии заболевания количество выделяемых больными микобактерий ниже предела обнаружения этим методом.
Микроскопическое обнаружение кислотоустойчивых микобактерий не позволяет дифференцировать микобактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis (возбудители туберкулеза) от нетуберкулезных ("атипичных") и сапрофитических микобактерий.
Культуральный метод выявления микобактерий позволяет выявлять микобактерии туберкулеза при наличии в исследуемом патологическом материале нескольких десятков жизнеспособных особей возбудителя. Это особенно важно при исследовании олигобациллярного диагностического материала от впервые выявленных или уже леченных больных, выделяющих малое количество микобактерий.
В вопросах диагностики и лечения больных туберкулезом бактериологические лаборатории противотуберкулезных учреждений должны обеспечить решение следующих задач:
- подтвердить туберкулезную природу заболевания;
- определить таксономическую принадлежность возбудителя;
- определить его лекарственную чувствительность;
- внедрить систему внутрилабораторного и внешнего контроля качества лабораторных исследований;
- осуществлять персонифицированный учет больных туберкулезом и мониторинг состояния микобактериальной популяции;
- осуществлять совместно с лечащими врачами интерпретацию данных микробиологических исследований.
При формировании клинического диагноза и оценке эффективности лечения больного должны учитываться результаты микроскопических и культуральных исследований, включающие микроскопическое исследование мазка осадка диагностического материала, выделение возбудителя (посев), дифференциацию выделенной культуры, определение ее лекарственной чувствительности. В качестве методов, альтернативных классическому культуральному исследованию, возможно использование автоматизированных и полуавтоматизированных систем ускоренной культуральной диагностики, основанной на использовании жидких питательных сред и различных способах индикации роста микобактерий.
С целью быстрой идентификации микобактерий туберкулезного комплекса в качестве дополнительных допускается использование методов, основанных на амплификации фрагментов генома микобактерий (полимеразная цепная реакция - ПЦР), других молекулярно-генетических методов. ПЦР-анализ может быть применен для исследования мокроты, промывных вод бронхов, мочи и спинномозговой жидкости, а также культур микроорганизмов. Технология проведения ПЦР приводится в описаниях и инструкциях по применению соответствующих наборов (тест-систем). Лаборатории, использующие такие методы, должны быть устроены соответствующим образом для исключения кросс-контаминации образцов.
Алгоритм первичного лабораторного обследования описан в Приложениях N 10 и N 11 к настоящему Приказу. Унифицированные методики и учетно-отчетные формы используются лечебно-профилактическими учреждениями независимо от ведомственной принадлежности.
Кратность и сроки микробиологических исследований в ходе лечения и наблюдения различных групп пациентов определены в инструкциях по химиотерапии больных туберкулезом и по организации диспансерного наблюдения и учету контингентов противотуберкулезных учреждений.
Существуют два основных метода микробиологической диагностики туберкулеза: исследование на КУМ методом микроскопии по Цилю-Нельсену и бактериологическое исследование. Оба метода предполагают в первую очередь исследование мокроты, хотя можно использовать и другой диагностический материал (гной, спинно-мозговую или плевральную жидкость и т. п.). Микробиологические методы - основной инструмент этиологической диагностики туберкулеза.
- Исследование мокроты на КУМ помогает выявить наиболее заразных, то есть выделяющих большое количество микобактерий туберкулезных больных.
- Чем выше число КУМ в препарате, тем больше микобактерий он выделяет в окружающую среду.
- Больные туберкулезом легких с положительным результатом микроскопии мокроты представляют самую серьезную опасность распространения заболевания среди населения.
- Микроскопия мокроты - это относительно быстрый (получение результата от 1 часа) и недорогой метод выявления туберкулеза.
При положительных или сомнительных результатах бактериоскопии при первичном обследовании, а также при отрицательных результатах, но с наличием клинико-рент-генологических симптомов, подозрительных на туберкулез, пациент направляется в противотуберкулезное учреждение для подтверждения или исключения диагноза туберкулез более совершенными диагностическими методами. Противопоказаний к применению метода бактериоскопии нет.
Бактериологическое исследование - более чувствительный метод диагностики туберкулез. Как правило, культуральные исследования проводятся в бактериологических лабораториях специализированной противотуберкулезной службы.
При выделении культуры МБТ она исследуется на лекарственную чувствительность для выявления больных с лекарственно-устойчивыми штаммами МБТ. Длительность роста культуры, необходимой для выявления МБТ, обычно составляет от 4 до 6 недель, а последующее исследование лекарственной чувствительности занимает еще от 4 до 6 недель.
Для качественной диагностики заболевания очень важно правильно собрать у лиц с подозрением на туберкулез легких 3 образца мокроты (не слюну!) для проведения микроскопического исследования на КУМ, даже если рентгенограмма грудной клетки этого больного без патологии. Качественный образец это:
- чаще всего густая и слизистая мокрота, или
- жидкая мокрота, или
- мокрота грязно-белого или грязновато-зеленого цвета (мокрота с кровью будет красновато-коричневой).
У больного с жалобами, подозрительными на туберкулез органов дыхания, диагностическим материалом, позволяющим выявить возбудитель туберкулеза при микроскопическом исследовании, является мокрота.
Для правильного сбора и направления мокроты на исследование в лабораторию нужно помнить следующее (табл. 1):
- мокроту следует собирать в специально оборудованном, хорошо проветриваемом помещении или на улице, в специально отведенном изолированном месте;
- медицинский работник, контролирующий сбор мокроты, должен быть в защитной маске (респираторе) и стоять сбоку от больного или наблюдать за процессом через стеклянную дверь комнаты для сбора мокроты. Поток воздуха должен быть направлен от медработника к пациенту. Никогда не стойте перед кашляющим больным!
- для получения мокроты больной должен сделать несколько глубоких вдохов и выдохов, задержать дыхание и резко выдохнуть;
- если у больного в данный момент нет мокроты, повторите попытку сбора мокроты через некоторое время;
- контейнер для сбора мокроты стерилен и открывать его можно только при сплевывании мокроты;
- после того, как мокрота попала в контейнер, его надо плотно закрыть крышкой;
- номер образца пишется на боковой стенке контейнера. Нельзя писать номер на крышке контейнера;
- хранить контейнеры с собранной мокротой надо в специально отведенном, желательно прохладном месте, а перевозить в специальных плотно закрытых биксах.
Если вместо мокроты собрана слюна, сбор мокроты следует повторить.
Накануне вечером, перед сбором утреннего образца мокроты, необходимо почистить зубы. Собрать образец мокроты утром, до утреннего туалета и приема пищи.
Табл. 1. Инструкции по сбору мокроты у пациентов с подозрением на туберкулез легких
| Условия сбора мокроты | Контейнер для сбора мокроты |
Рекомендации по сбору мокроты в медицинском учреждении:
Мокроту можно хранить до 1 недели, но надо стараться отправить ее на исследование в лабораторию как можно скорее. Рекомендации по сбору мокроты в домашних условиях:
| Для сбора мокроты необходим чистый контейнер из прочного материала, не пропускающий жидкости.
Рекомендуется, чтобы контейнер был:
Для очистки и стерилизации контейнеры многоразового использования кипятите в воде с мылом, другим чистящим средством или дезинфецирующим веществом в течение, по крайней мере, 30 минут. Затем тщательно прополощите контейнеры в чистой воде и стерилизуйте в сухожаровом шкафу |
| Безопасность медицинских работников | Инструкции и рекомендации для пациентов |
Руководя действиями больного, который откашливает мокроту, соблюдайте правила инфекционного контроля.
| Подробно опишите, для чего и каким образом нужно собирать мокроту, чтобы больной ясно представлял свои действия. Чтобы помочь больному собрать качественный образец мокроты, следует:
|
У всех пациентов с подозрением на туберкулез (даже при отсутствии рентгенологических изменений) необходимо провести исследование трех образцов мокроты на КУМ. Там, где позволяет возможность, медработники должны собрать 3 образца мокроты в течение 2 дней согласно следующему графику.
Первый образец мокроты собирается под наблюдением медицинского работника во время приема пациента с подозрением на туберкулез (первый день). Нужно предупредить пациента о необходимости прийти на прием на следующий день.
Перед уходом пациент получает контейнер для сбора второго образца мокроты, в который нужно собрать утреннюю мокроту дома, до прихода на прием (второй день). На внешней стороне контейнера должен быть написан номер образца (1,2 или 3), который сдал пациент в рамках одного исследования. Пациенту важно объяснить, что, встав
утром, он должен откашлять мокроту в контейнер и как можно скорее принести собранный образец в медицинское учреждение ответственному за сбор материала медицинскому работнику.
Когда пациент приходит на прием со вторым образцом мокроты (второй день), то в присутствии медицинского работника он должен собрать третий образец.
В условиях стационара собирают три образца мокроты в течение трех дней, утром до приема пищи.
Транспортировка собранных образцов мокроты и их регистрация могут проводиться в нескольких вариантах. При этом важно, чтобы исключалась возможность ошибок. Рассмотрим несколько вариантов.
Образцы собираются в ЛПУ, отдаленном от клинико-диагностической лаборатории (КДЛ), в которой проводятся микроскопические исследования.
При сборе первого образца мокроты пациент оставляет форму № 05-ТБ/у в кабинете сбора мокроты (кашлевой комнате). Образец регистрируется в форме № 04-1-ТБ/у и отправляется в КДЛ в тот же или на следующий день, не дожидаясь, когда пациент соберет все пробы. В этом случае в КДЛ создается алфавитная картотека форм № 05-ТБ/у и отметки о втором (третьем) образце делает лаборант КДЛ. Этот вариант может быть использован как при сборе образцов в ЛПУ, удаленном от КДЛ, так и в том случае, когда сбор и микроскопические исследования образцов производятся в одном ЛПУ.
При четкой организации оба варианта работают эффективно.
Возможны и другие варианты организации работы, исключающие ошибки при регистрации образцов.
Федеральные клинические рекомендации по организации и проведению микробиологической и молекулярно-генетической диагностики туберкулеза
Основная цель этих рекомендаций – дать объективную основу для разработки пациент-ориентированной тактики противотуберкулезной помощи и оптимизации лечения пациентов: лечение пациентов должно предотвращать смертность, рецидивы, приобретение/амплификацию устойчивости к противотуберкулезным препаратам и распространение туберкулеза.
Основной целевой аудиторией рекомендаций являются клиницисты (фтизиатры), организаторы здравоохранения вместе с другими медицинскими работниками, занятыми лечением больных туберкулезом. Рекомендации направлены на получение данных для лечения активного туберкулеза у взрослых. Они не содержат многие смежные темы, которые описаны в других публикациях.
Рекомендации содержат отдельные положения по микробиологической и молекулярногенетической диагностике туберкулеза, влияющие на принятие решения в проведении необходимой и достаточной диагностики туберкулеза, выборе необходимого режима лечения, адекватного диагностированному случаю заболевания. Они не исключают дополнительных мер диагностики, уточняющих характеристику микроорганизма, пациента и дающих возможность применять более обосновано арсенал терапевтических мероприятий.
Упоминание тех или иных компаний или названий продуктов отдельных изготовителей не означает, что РОФ отдает им предпочтение по сравнению с другими компаниями или продуктами аналогичного характера, не упомянутыми в тексте.
Диагностика пациентов с подозрением на туберкулез органов дыхания. Среди лиц, подлежащих обследованию на туберкулез или микобактериоз, в соответствии с действующим Порядком оказания медицинской помощи больным туберкулезом в Российской Федерации, обследованию с целью диагностики туберкулеза органов дыхания подлежат пациенты, имеющие кашель с мокротой, или другие пациенты, при наличии соответствующей клинико-рентгенологической картины и после консультации фтизиатра, в том числе выявленные при диспансеризации по изменениям в рентгено/флюорограммах.
Диагностический материал. При туберкулезе легких, наиболее распространенной и эпидемически опасной форме заболевания, доступным и часто исследуемым диагностическим материалом является мокрота. При подозрении на другие формы туберкулез органов дыхания или при невозможности собрать мокроту у пациента с подозрением на туберкулез легких, могут исследоваться и другие виды диагностических материалов (промывные воды бронхов, аспирационный материал, бронхоальвеолярный лаваж, браш-биоптат, биоптат, экссудат и др.).
Исследования внелегочных диагностических материалов проводятся только с целью дифференциальной диагностики туберкулеза внелегочной локализации, при наличии показаний, по назначению фтизиатра и/или после консультации фтизиатра соответствующего профиля. Приоритетным является подтверждение/исключение наличия микобактерий туберкулезного комплекса (МБТК) в диагностическом материале методами с максимальной доступной чувствительностью и специфичностью. В связи с этим основными методами являются культуральные исследования на жидких и/или плотных средах и молекулярно-генетические методы (МГМ).
Приоритет исследования определяется лечащим врачом и зависит от клинической ситуации, информативности предыдущих исследований. Чтобы минимизировать вероятность расхождения в результатах, полученных разными методами, комплексное исследование должно проводиться из одной аликвоты клинического материала.
Методы микроскопии. Диагностическая чувствительность метода микроскопии обычно составляет не более 50% от всех больных туберкулезом легких, однако если говорить о наиболее инфекционно-опасных больных (у которых бактериовыделение подтверждено культуральным методом), диагностическая чувствительность метода микроскопии в этом случае достигает 90%.
Методы микроскопии не позволяют дифференцировать микобактерии туберкулеза от нетуберкулезных микобактерий и дают возможность выявлять кислотоустойчивые микроорганизмы (КУМ) только при наличии, по крайней мере, 5000-10000 бактериальных клеток в мл мокроты.
В настоящее время методы микроскопии, обладающие относительно невысокой чувствительностью, сохраняют, тем не менее, свою актуальность, так как позволяют быстро и с минимальными финансовыми затратами выявлять наиболее эпидемически значимых больных туберкулезом и оценивать массивность бактериовыделения.
Методы микроскопии в обязательном порядке включаются во все схемы обследования пациентов в связи с необходимостью определения статуса бактериовыделения согласно классификатору заболеваний и дальнейшему диспансерному наблюдению пациента или при необходимости его целевой госпитализации в специализированное отделение противотуберкулезных учреждений. Современные методы микроскопии требуют обучения персонала. Методы микроскопии настоятельно рекомендуется включать в алгоритм микробиологической диагностики туберкулеза.
Микроскопия с окраской по Цилю-Нильсену. Световая микроскопия препаратов с окраской по Цилю-Нильсену (Ц-Н), приготовленных непосредственно из нативных образцов мокроты или других диагностических материалов, доступна для лабораторий всех уровней. В бактериологических лабораториях (БЛ) медицинских организаций фтизиатрического профиля субъекта РФ данный метод является актуальным при необходимости экстренного (в течение 1 часа) выявления больных туберкулезом и микобактериозом на первичном этапе обследования до госпитализации с целью определения статуса бактериовыделения.
Идентификация выросших микроорганизмов микроскопией с окраской по Цилю-Нильсену. При получении роста культуры микроорганизмов на плотной и/или жидкой питательных средах необходимо провести ее идентификацию, а также исключить наличие контаминации посторонней микрофлорой. Метод окраски по Цилю-Нильсену может быть использован для идентификации выросших микроорганизмов при отсутствии возможности использования современных молекулярных методов.
Методы люминесцентной микроскопии в бактериологических лабораториях медицинских организаций фтизиатрического профиля субъекта РФ в качестве основного метода микроскопического исследования рекомендуется применять методы люминесцентной микроскопии, где в качестве источника излучения может использоваться ртутная лампа или светодиодный излучатель (LED).
Основное преимущество люминесцентной микроскопии перед микроскопией с окраской по Цилю-Нильсену состоит в экономии времени, затрачиваемого на просмотр препарата, за счёт использования меньших увеличений объектива и, соответственно, возможности просматривать большую площадь мазка в поле зрения. Диагностическая чувствительность микроскопии с окраской люминесцентными красителями в среднем на 10% выше, чем микроскопии с окраской по Цилю-Нильсену, однако метод люминесцентной микроскопии требует значительной технической компетенции, а также более высоких капиталовложений и расходов.
Светодиодная (LED) микроскопия. LED технология позволяет сделать микроскопию более доступным анализом за счет более низкой стоимости как самих микроскопов, так и их сервисного обслуживания. Оценка, проведенная ВОЗ, подтвердила диагностическую точность LED микроскопии по сравнению с традиционной люминесцентной микроскопией и большую эффективность LED по сравнению с микроскопией по Цилю-Нильсену. Поэтому можно рекомендовать заменять традиционную люминесцентную микроскопию LED микроскопией, которая в качестве альтернативы традиционной световой микроскопии по Цилю-Нильсену может применяться как в крупных, так и в небольших лабораториях.
В связи с тем, что светодиодные люминесцентные микроскопы не требуют высококвалифицированного технического обслуживания и имеют значительно больший срок службы ламп по сравнению с обычными моделями люминесцентных микроскопов, применение данного метода является оправданным с экономической точки зрения и позволяет широко распространить технологию люминесцентной микроскопии для диагностики туберкулеза. Метод светодиодной люминесцентной микроскопии (LED) может быть рекомендован к применению вместо традиционной микроскопии/
Культуральные методы. Культуральные методы диагностики (методы посева диагностического материала на питательные среды с последующей идентификацией выросших микроорганизмов) являются основными методами выделения микобактерий туберкулеза. Их специфичность превышает специфичность микроскопических методов, а предел обнаружения значительно выше: он позволяет выявить микобактерии (МБ) при наличии в 1 мл исследуемого диагностического материала нескольких сотен и даже десятков жизнеспособных микроорганизмов.
С помощью культурального метода удается выявить на 20-40% больше случаев туберкулезом с бактериовыделением по сравнению с методом микроскопии среди впервые выявленных больных. Культуральный метод позволяет выделить культуру возбудителя, необходимую для определения его видовой принадлежности и определения спектра и степени лекарственной устойчивости. Видовая идентификация выделенной культуры с помощью комплекса современных молекулярных методов позволяет сразу же дифференцировать микобактерии туберкулеза от нетуберкулезных микобактерий и неспецифической микрофлоры.
Культуральные исследования являются достаточно трудоемкими и требуют значительных капиталовложений, наличия помещений и материально-технической базы для приготовления питательных сред, обработки образцов и культивирования микроорганизмов, специализированного лабораторного оборудования и надлежащих условий, обеспечивающих биологическую безопасность. Кроме того, культуральная диагностика требует специализированного обучения персонала.
Медленный рост микобактерий туберкулеза требует значительного времени ожидания результатов исследования. В среднем, при посеве диагностического материала от впервые выявленных больных для получения результатов на плотных средах требуется 21-36 дней, на жидких средах – 12-22 дня. Методы культивирования на жидкой и плотной питательных средах могут осуществляться в бактериологических лабораториях разных уровней.
Культивирование на плотных питательных средах. Метод культивирования микобактерий на плотных средах является менее дорогостоящим, чем в системах культивирования на жидких средах, но получение роста микобактерий на плотных средах занимает гораздо более длительное время (до получения отрицательного результата – 12 недель), чем культивирование микобактерий на жидких средах (42-46 дней). Процесс приготовления плотных питательных сред (ППС) проводится в каждой бактериологической лаборатории самостоятельно и сложно поддается стандартизации.
Однако указанный метод позволяет получить культуру микобактерий для проведения её дальнейших исследований и может быть рекомендован для использования в бактериологической лаборатории на всех этапах диагностики и контроля химиотерапии. Метод культивирования на плотной питательной среде остаётся востребованным и рекомендуется к использованию в лабораторной практике для диагностики туберкулеза в комплексе с другими методами исследования/
Культивирование на жидкой питательной среде в автоматизированной системе учета роста микроорганизмов. С 2006 г. международным сообществом были одобрены несколько новых тестов и диагностических подходов, включая использование жидких питательных сред с быстрой идентификацией в качестве стандартного эталона для подтверждения этиологии заболевания.
Культивирование на жидкой среде повышает выявление микобактерий примерно на 10% по сравнению с плотными питательными средами. В настоящее время широко используются системы с автоматической детекцией учета роста микобактерий, которые позволяют значительно ускорить получение результата. В бактериологических лабораториях медицинских организаций фтизиатрического профиля РФ преобладающей является автоматизированная система BACTEC MGIT 960/320.
Преимущества автоматизированной системы культивирования BACTEC MGIT 960/320 перед культуральными исследованиями на плотных питательных средах обеспечиваются высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных по ISO9001 производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных протоколов исследований. Посев на жидкие питательные среды настоятельно рекомендуется при диагностических исследованиях, для обследования впервые выявленных больных и повторных случаев лечения.
*Импакт фактор за 2018 г. по данным РИНЦ
Журнал входит в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК.
Читайте в новом номере
ЦНИИ туберкулеза РАМН, Москва
В настоящее время лабораторная диагностика занимает ведущее место в выявлении многих инфекционных заболеваний. Подтверждение диагноза туберкулеза основывается на результатах микробиологических анализов при выделении из биологического материала возбудителя – микобактерий туберкулеза. Современная микробиологическая диагностика туберкулеза состоит из нескольких основных групп анализов, направленных на выявление возбудителя, определение лекарственной чувствительности и типирование микобактерий.
Обнаружение возбудителя начинается с наиболее простых и быстрых бактериоскопических методов с использованием светового микроскопа с окраской по Циль–Нильсену и люминесцентного с окраской флюорохромами. Преимущество бактериоскопии – в быстроте получения результата. Однако возможности ее ограничены из–за низкой чувствительности. Этот метод является наиболее экономичным и рекомендован ВОЗ в качестве основного для выявления заразных больных (табл. 1).
При антибактериальной терапии обнаружение микобактерий туберкулеза имеет прогностическое значение. Поэтому бактериовыделение оценивается количественно. Золотым стандартом выявления микобактерий признаны культуральные исследования. Для посева патологического материала используют яичные среды: Левенштейна–Йенсена, среду Финна II, Мордовского и др. Количество микобактерий (или колоний в пробирке при культуральном методе исследования) в процессе химиотерапии является ориентировочным показателем ее эффективности или косвенным свидетельством развития устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам.
Для повышения процента выделения микобактерий посевы патологического материала проводят на несколько сред, в том числе и на жидкие в автоматизированных системах учета роста типа BACTEC, что позволяет удовлетворить все культуральные потребности возбудителя. Посевы инкубируют до двух с половиной месяцев. При отсутствии роста к этому времени посев считается отрицательным. Наиболее чувствительным способом обнаружения микобактерий туберкулеза считается метод биологической пробы – заражение диагностическим материалом высокочувствительных к туберкулезу морских свинок.
Развитие молекулярной биологии позволило значительно повысить эффективность обнаружения микобактерий. Базовым методом молекулярно–генетических исследований является полимеразная цепная реакция (ПЦР), направленная на выявление ДНК микобактерий в диагностическом материале. ПЦР дает экспоненциальное увеличение специфического участка ДНК возбудителя: 20 циклов ПЦР приводят к увеличению исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле.
Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением. Однако при постановке диагноза результаты ПЦР являются дополнительными и должны сопоставляться с данными клинического обследования, рентгенографии, микроскопии мазка, посева и даже ответа на специфическое лечение.
Интереснейшая область исследования, которая открывается благодаря ПЦР–диагностике, – изучение латентной инфекции M. tuberculosis. По современной концепции туберкулезной инфекции, из 100 человек, контактирующих с M. tuberculosis, 90 могут быть инфицированы, но только у 10 развивается активная болезнь. У остальных 90% инфекция будет оставаться латентной из–за противотуберкулезного иммунитета. Положительные ответы ПЦР при отрицательных результатах посевов патологического материала отмечаются у 55% лиц, подвергавшихся бытовым контактам с M. tuberculosis, и у 80% лиц, у которых туберкулез протекал без рентгенографических проявлений. Проведение ПЦР–исследований у пациентов из групп риска выявляло больных с отрицательными результатами микроскопии и посевов, но с субклинической инфекцией M. tuberculosis [11]. Подобные результаты были получены и в наших исследованиях [6].
Определение лекарственной устойчивости микобактерий
Для определения лекарственной устойчивости микобактерий используется несколько групп методов (табл. 2). По приказу № 558 МЗ РФ от 1978 г. в бактериологических лабораториях России используется метод абсолютных концентраций. В лаборатории ЦНИИТ РАМН внедрен ускоренный метод по тестированию нитратредуктазной активности микобактерий с помощью реактива Грисса.
В крупных противотуберкулезных центрах используются методы определения лекарственной устойчивости в жидких средах с автоматизированной радиометрической и флюоресцентной системой учета роста микобактерий типа ВАСТЕК, позволяющие сокращать срок анализа до 14 дней.
В последнее время разрабатываются новые методы оценки лекарственной устойчивости на уровне генотипа [10]. Работа по изучению молекулярных механизмов резистентности показала наличие у микобактерий генов, связанных с устойчивостью к различным препаратам: к изониазиду – гены katG, inhA, kasA, к рифампицину – rpoB, к стрептомицину – rpsL и 16SрРНК, к этамбутолу – emb1, к фторхинолонам – gyrA и т.д. [7].
Широкомасштабные исследования по изучению спектра мутаций в геноме устойчивых микобактерий показали, что наиболее распространенными были мутации в 531, 526 и 516 кодонах rpoB гена, устойчивость к изониазиду характеризовалась мутациями в 315 кодоне katG гена. В целом спектр мутаций не отличался от выявленных исследователями в разных регионах мира [2].
Доступность данных по молекулярной основе лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам дала возможность разработки новых, основанных на ПЦР, методов, представленных в табл. 2. Наши работы, проведенные совместно с Институтом физико–химической медицины МЗ РФ и Институтом молекулярной биологии РАН, продемонстрировали перспективность использования молекулярно–генетических методов для быстрого определения лекарственной устойчивости [1, 3, 4].
Наибольшие надежды по совершенствованию методов для определения лекарственной устойчивости микобактерий связаны с развитием микрочиповой технологии, позволяющей определять устойчивость одновременно к нескольким противотуберкулезным препаратам микобактерий непосредственно из диагностического материала в течение 2 дней [9].
Комплекс методов имеется и для типирования микобактерий, когда используются традиционные культуральные и биохимические методы, биологические, а также молекулярно–генетические (табл. 3). На основе молекулярно–генетического типирования микобактерий интенсивно развивается область молекулярно–эпидемиологических исследований, в которой по генотипу микобактерии выявляются очаги и прослеживаются пути распространения туберкулезной инфекции [5, 8].
#Pt6982.gif В заключение необходимо подчеркнуть, что в настоящее время имеется научный потенциал для совершенствования бактериологических исследований, а благодаря успехам молекулярной биологии существует возможность значительного сокращения сроков выявления микобактерий, определения лекарственной устойчивости и контроля за эффективностью химиотерапии.
1. Альтшуллер М.Л. и др. Применение аллель–специфической амплификации и SSCP для выявления устойчивости к рифампицину клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis. // БЭБиМ, 1999; 128(11): 555–8.
2. Генерозов Э.В. и др. Молекулярная характеристика полирезистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis из России. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2000; 1: 11–7.
3. Генерозов Э.В.и др. Детекция и характеристика мутаций в rроВ гене резистентных к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. // Проблемы туберкулеза, 1999; 2: 39–42.
4. В.М. Михайлович и др. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ–микрочипе для обнаружения рифампицин–резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis // БЭБ и М, 2001, 1: 112–7.
5. Черноусова Л.Н.и др. Молекулярная эпидемиология туберкулеза в тюрьмах. // Актуальные проблемы пенитенциарной медицины. Мат–лы международной научно–практич. конференции, Минск, 2001: 48–50.
6. Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., Голышевская В.И. Роль ПЦР–анализа в комплексных бактериологических анализах во фтизиатрии. // Проблемы туберкулеза, 2001; 3: 58–60.
Читайте также: