Среда левенштейна-йенсена для выделения микобактерий туберкулеза
Для культивирования микобактерии туберкулеза используют различные питательные среды: плотные, полужидкие, жидкие (синтетические и полусинтетические). Однако ни одна из них не обладает качествами, предъявляемыми к ним современной бактериологической диагностикой туберкулеза. В связи с этим для повышения результативности культурального метода рекомендуется применять посев патологического материала одновременно на несколько (2-3) питательных сред. Для выделения чистых культур микобактерии туберкулеза чаще всего применяют различные по составу плотные питательные среды. В качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя и определения его лекарственной чувствительности ВОЗ рекомендована среда Левенштейна-Йенсена. Это плотная яичная среда, на которой хороший рост микобактерии туберкулеза получают на 15-25-й день после посева бактериоскопически положительного материала.
В последние годы широкое распространение в нашей стране получила яичная среда II, предложенная Э.Р. Финном (среда Финна-II). Она отличается от среды Левенштейна-Йенсена тем, что вместо b-аспарагина в ней используется глутамат натрия. На этой среде рост микобайтерий туберкулеза появляется на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна-Йенсена. Процент выделения культур на этой среде на 6—8% выше, чем на среде Левенштейна-Йенсена.
Для повышения вероятности получения роста микобактерии рекомендуется засевать патологический материал на 2—3 различные по составу питательные среды одновременно. В настоящее время, кроме безаспарагиновой среды Финна-И, в практику внедряется еще одна безаспарагиновая среда, разработанная В.А. Аникиным. По данным Московского НИИ туберкулеза, применение сред, сбалансированных по солевому составу и источникам азотистого питания иначе, чем среда Левенштейна-Йенсена, культуральная диагностика туберкулеза улучшается в среднем на 6,7%. Это особенно важно при таких формах туберкулеза, при которых возбудитель паразитирует в условиях ацидоза и анаэробиоза, в частности, при туберкулезе мочеполовых органов.
Для повышения результативности культурального метода наряду с применением одновременно нескольких различных по составу питательных сред для посева рекомендуется повторное многократное исследование материала, так как в настоящее время отмечается состояние олигобациллярности у большинства больных даже со свежевыявленными деструктивными поражениями в легких. Олигобациллярность проявляется не только малым количеством возбудителей в диагностическом материале, но и транзиторностью, эпизодичностью их выделения. Поэтому часто посев даже на 3 различные питательные среды не обеспечивает полной информации о состоянии бактериовыделения.
Для повышения информативности культурального метода практикуется повторное многократное исследование материала от больных. По данным Центрального НИИ туберкулеза, методика 3-кратного первичного комплексного исследования бактериоскопическими и культуральными методами у впервые выявленных больных деструктивным туберкулезом легких дает дополнительно 3,4% положительных результатов, а у больных хроническим деструктивным туберкулезом, лечившихся до поступления в стационар, — 5,8% по сравнению с данными одноразового исследования. Однако, по данным ряда авторов, и 3-кратные посевы недостаточны для выявления истинной картины бактериовыделения. Так, установлено, что при обследовании нелечившихся больных максимальный прирост информации о бактериовыделении можно получить при 6-кратных повторных посевах материала, при этом количество положительных результатов возрастает на 36—37% по сравнению с данными 3-кратного посева. У больных после 3-месячного лечения ценность многократного исследования патологического материала методом посева возрастает и при 6-кратном исследовании показатель прироста положительных результатов может достигать 70%, а после 6 мес лечения он возрастает до 82%.
Таким образом, кратность исследования и состав питательных сред имеют важное значение для культуральной диагностики туберкулеза.
В связи с тем что в процессе интенсивной химиотерапии происходит повреждение различных метаболических систем микробной клетки, ряд микроорганизмов в микобактериальной популяции утрачивает способность нормально развиваться на питательных средах. Отмечается снижение жизнеспособности микобактерий, что может проявляться отсутствием роста на общепринятых питательных средах, а также возникновением способности расти только на осмотически сбалансированных (полужидкие или даже жидкие) питательных средах. Так, по данным И.Р. До рожковой, в процессе интенсивной противотуберкулезной химиотерапии часть микобактериальной популяции, утрачивая способность расти на плотных питательных средах, в то же время приобретает свойство расти на полужидких питательных средах, образуя микроколонии в верхнем наиболее аэрируемом участке питательной среды. Эта потребность в повышенной аэрации четко проявляется также при культивировании микобактерий в жидких питательных средах с увеличенной аэрацией, которая достигается при культивировании посевов во вращающемся термостате (Н.М. Макаревич).
После посева и закрытия пробирок материал должен быть распределен по всей поверхности питательной среды, для этого пробирки наклоняют. Пробирки должны находиться в горизонтальном положении в течение 24—48 ч, после чего их следует перевести в вертикальное положение.
Посевы нужно просматривать еженедельно. При этом обязательно регистрируются параметры:
- а) появление роста — срок появления, начиная со дня посева;
- б) интенсивность роста — число колоний, этот показатель имеет большое диагностическое и прогностическое значение, особенно если посевы производятся в динамике;
- в) загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами;
- г) отсутствие роста.
При первичном посеве бактериоскопически отрицательного материала на плотные среды средняя продолжительность роста составляет 20—46 дней. Отдельные штаммы растут 60 и даже 90 дней. Это заставляет выдерживать посевы в термостате в течение 3 мес, еженедельно проверяя появление роста.
Обычно вирулентные культуры микобактерий туберкулеза растут на плотных питательных средах в виде R-форм колоний различной величины и вида. Колонии сухие, морщинистые, цвета слоновой кости, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых резко отличается от оранжевого или желтого пигмента сапрофитных или атипичных микобактерий. Последние обычно растут в S-форме. Следует отметить, что на среде Финна-II колонии микобактерий туберкулеза могут быть более влажными.
После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы). Гладкие колонии характерны также для Mycobacterium bovis, которые также патогенны для человека.
Интенсивность роста обозначают по 4-балльной системе: + единичные колонии; ++ от 20 до 100 колоний; +++ от 100 до 200 колоний; мм несосчитываемое число колоний (сливной рост). В двух последних случаях имеется обильное бактериовыделение, которое является показателем активности процесса и/или неэффективности лечения.
Если морфология колоний или палочек вызывает сомнения в их туберкулезной природе или культуры выделены из материала, который может содержать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и др.), мазки дополнительно обесцвечивают спиртом (в течение 45—60 мин) или жавелевой водой (в течение 1—2 ч). Следует учитывать, что молодые культуры микобактерий туберкулеза могут обесцвечиваться спиртом и жавелевой водой, так как они еще слабо кислотоустойчивы. В таких случаях культуры следует выдержать еще несколько дней (5—10) в термостате и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их кислотоустойчивости.
Авирулентные сапрофитные и атипичные микобактерий обычно грубее, толще, иногда менее интенсивно окрашены и, как правило, не образуют жгутообразных сплетений (корд-фактор отсутствует). Однако некоторые виды атипичных микобактерий (фотохромогенные) могут расти в R-форме. Многие атипичные и сапрофитные микобактерий имеют кислотоустойчивые зерна, весьма сходные с таковыми у вирулентных микобактерий туберкулеза.
В тех случаях, когда выделяются культуры, вызывающие сомнения в плане их принадлежности к микобактериям туберкулеза, их изучают, используя комплекс специальных исследований, позволяющих дифференцировать типичные микобактерий туберкулеза от нетуберкулезных (атипичных) микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов.
Как отмечалось выше, в случае появления на питательных средах роста колоний и установления с помощью микроскопии окрашенных по Цилю — Нильсену мазков факта, что выросшая культура относится к кислотоустойчивым микобактериям, производится количественная оценка результатов посева. С этой целью применяют различные схемы оценки (одна из них приведена выше). В Центральном НИИ туберкулеза используют количественную оценку бактериовыделения методом посева по 3 степеням:
- скудное — на плотных питательных средах вырастает 1—20 колоний во всех пробирках, использованных для данного посева;
- умеренное — от 21 до 100 колоний во всех пробирках;
- обильное — обнаруживается рост более 100 колоний во всех пробирках.
Описание "Среды для микобактерий туберкулеза"Среда предназначена для выделения МБТ, атипичных микобактерий из инфицированного материала (мокрота, моча и др). Представляет собой однородную массу светло-зеленого цвета в виде косячка с гладкой поверхностью и незначительным конденсатом на дне пробирки. Состав: калий дигидроортофосфат, магний сернокислый 7-водный, натрий лимоннокислый трехзамещенный, L .-аспарагин, глицерин, малахитовый зеленый, яйцо куриное, вода дистиллированная. Приготовление. Питательная среда готова к употреблению. Учет результатов. Рост на питательной среде МБТ бычьего вида и человеческого вида обнаруживается через 21-40 сут. МБТ человеческого вида растут в виде шероховатых R -колоний желтого цвета, могут встречаться сливающиеся между собой S -варианты. МБТ бычьего вида растут в виде гладких влажных колоний сероватого цвета. При отсутствии роста посевы инкубировать до 2,5 мес. Упаковка. Среда в пробирках по 6,5 мл, свернутая в скошенном положении. Пробирки упакованы в коробку по 10 штук. Хранение. Хранить препарат следует в вертикальном положении в коробках в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С. Срок годности - З месяца. Среда Левенштейна-Йенсена готовая к употреблению обладает бесспорным преимуществом перед аналогичной средой - лиофилизатом, а именно: высеваемость микробактерий на 20% выше, чем на лиофильно высушенной среде, что существенно для бактериологической диагностики. Кроме того, экономятся время, материальные и трудовые затраты. Основа предназначена для приготовления в лабораторных условиях среды Левенштейна-Йенсена, которая используется для выделения, культивирования и для определения лекарственной чувствительности МБТ. Представляет собой мелкодисперсный порошок темно-зеленого цвета, гигроскопичен, светочувствителен. Состав: калий дигидроортофосфат, магний сернокислый, натрий лимоннокислый трехзамещенный, L .-аспарагин, глицерин, малахитовый зеленый. Приготовление. 14,90 г основы растворить в 1 л дистиллированной воды, добавить 21,7 мл глицерина, тщательно перемешать и довести до кипения. Стерилизовать автоклавированием в течение 20 мин. при температуре 121° С, затем охладить до температуры 45-50°С. для приготовления среды Левенштейна-Йенсена после охлаждения в основу стерильно внести 1667 мл яичной массы, перемещать, разлить в пробирки по 6,5 мл. Коагуляцию проводить при температуре 85°С в течение 45 мин. в скошенном положении под углом 20-30°. Затем пробирки поставить на 2 сут. в термостат при температуре (З7±1)°С для контроля стерильности. При необходимости для определения лекарственной устойчивости МБТ перед свертыванием в среду добавляют противотуберкулезные препараты в различных концентрациях. Учет результатов. Рост на питательной среде МБТ человеческого и бычьего вида обнаруживается через 21-40 сут. МБТ человеческого вида растут в виде шероховатых R -колоний желтого цвета, могут встречаться сливающиеся между собой S -варианты. МБТ бычьего вида растут в виде гладких влажных колоний сероватого цвета. При отсутствии роста посевы инкубировать до 2,5 мес. Упаковка. Препарат расфасовывают по 200 г в полиэтиленовые банки. Хранение. Хранить препарат следует в герметично закрытой упаковке в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 30° С. Срок годности - 2 года. Преимущество основы: возможность определения лекарственной устойчивости микобактерий путем добавления противотуберкулезных препаратов в процессе изготовления среды, удобство в использовании. Основа предназначена для приготовления в лабораторных условиях среды финна-II, применяемую для выделения и культивирования МБТ, атипичных микобактерий из клинического материала. Представляет собой мелкодисперный порошок темно-зеленого цвета, гигроскопичен, светочувствителен. Состав: калий дигидроортофосфат, магний сернокислый 7-водный, натрий лимоннокислый трехзамещенный, квасцы железоаммонийные, аммоний лимоннокислый однозамещенный, натрий глутаминовокислый, крахмал водорастворимый, малахитовый зеленый. Приготовление. 52,2 г основы растворить в 1 л дистиллированной воды, добавить 20,0 мл глицерина, тщательно перемещать и довести до кипения, кипятить 2 мин., стерилизовать автоклавированием в течение 20 мин при температуре 121°С, остудить до температуры 45-50°С. для приготовления среды финна-II после охлаждения в основу стерильно внести 2 л яичной массы, перемешать, разлить в стерильные пробирки по 6,5 мл. Коагуляцию проводить при температуре 85°С в течение 45 мин, в скошенном положении под углом 20-30°. Затем пробирки поставить на 2 сут. в термостат при температуре (37±1)°С для контроля стерильности. Готовая основа должна быть темно-зеленого цвета. Готовую основу можно использовать в течение 1 мес. при условии хранения ее при температуре 2-8° С. Учет результатов. Рост на питательной среде МЬТ человеческого и бычьего вида обнаруживается через 21-40 сут. МБТ человеческого вида растут в виде шероховатых R -колоний желтого цвета, могут встречаться сливающиеся между собой S -варианты. МБТ бычьего вида растут в виде гладких влажных колоний сероватого цвета. При отсутствии роста посевы инкубировать до 2,5 мес. Упаковка. Препарат расфасовывают по 200 г в полиэтиленовые банки. Хранение. Хранить препарат следует в герметично закрытой упаковке в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 30°С. Срок годности - 2 года. Преимущество основы: высеваемость МБТ на среде Финна-II на 6-8% выше, чем на среде Левенштейна-Йенсена. Использование двух сред одновременно повышает процент выделения МБТ из патологического материала. Среда предназначена для культивирования, ускоренного выявления МБТ культурально-микроскопическим методом и определения лекарственной чувствительности МБТ. Представляет собой мелкодисперсный порошок светло-желтого цвета, гигроскопичен, светочувствителен. Состав: панкреатический гидролизат казеина, зкстракт кормовых дрожжей, калий дигидроортофосфат, динатрий фосфат обезвоженный, магний сернокислый, натрий лимоннокислый трехзамещенный, железо лимонноаммиачное. Приготовление. Препарат, в количестве указанном на этикетке, размешать в 970 мл дистиллированной воды, содержащей 30 мл глицерина, кипятить в течение 1-2 мин., профильтровать через бумажный фильтр, разлить в стерильные пробирки по 2 мл и стерилизовать автоклавированием при температуре 121° С в течение 15 мин. Среду охладить до температуры 20-25° С и внести в каждую пробирку по 0,2 мл плазмы человеческой крови или нормальной лошадиной сыворотки. Готовая среда должна быть светло-желтой. Упаковка. Препарат расфасовывают по 150 г в полиэтиленовые банки. Хранение. Хранить препарат следует в герметично закрытой упаковке в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 30° С. Срок годности - 1 год. Преимущество препарата перед аналогичной средой Школьниковой лабораторного изготовления: стандартность, высокое качество, простота в приготовлении. Патент N 2193061 от 20.11.2001 Среда предназначена для определения чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам. Представляет собой однородную массу светло-зеленого цвета в виде косячка с гладкой поверхностью и незначительным конденсатом на дне пробирки. Состав: калий дигидроортофосфат, магний сернокислый 7-водный, натрий лимоннокислый трехзамещенный, L .-аспарагин, глицерин, малахитовый зеленый, яйцо куриное, вода дистиллированная, стрептомицин (или канамицин, или рифампицин, или этионамид, или этамбутол, или тубазид). Приготовление. Питательная среда готова к употреблению. Учет результатов. Визуально регистрируют рост на питательной среде МБТ через 27-29 сут. и проводят подсчет колоний микобактерий, выросших на поверхности среды. Посев исследуемых культур проводить согласно приказу N 109 от 21 марта 2003 г . Упаковка. Среда в пробирках по 6,5 мл, свернутая в скошенном положении. Пробирки упакованы в коробку по 10 штук. Хранение. Хранить препарат следует в вертикальном положении в коробках в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С. Срок годности —2 месяца. Преимущество среды: экономия времени, трудовых и материальных затрат. Среда предназначена для ускоренного определения лекарственной устойчивости МБТ (в течение 7 суток). Представляет собой мелкодисперсный порошок кремового цвета, гигроскопичный, светочувствительный. Состав: натрий-1.-глутаминовокислый кислый, калий дигидроортофосфат, динатрий фосфат б/в, магний сернокислый, железо лимонноаммиачное, Натрий лимоннокислый трехзамещенный, марганец-ii сернокислый 5-водный, тиамин-бромид. Приготовление. Навеску препарата размешать в 940 мл дистиллированной воды, кипятить в течение 1 мин., профильтровать через бумажный фильтр, разлить в стерильные пробирки по 2 мл, стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 20 мин. Готовая среда должна быть бесцветной. Пробирки со средой (без лекарственных препаратов) можно использовать в течение 7 суток при условии хранения их в холодильнике при температуре 2-8° С. Пробирки со средой, содержащей препараты, должны быть использованы в тот же день. Перед использованием в каждую пробирку внести по 0,2 мл нормальной лошадиной сыворотки и 0,1 мл раствора одного из противотуберкулезных препаратов. После внесения растворов препаратов в пробирки с 2 мл питательной среды конечная концентрация их должна соответствовать стандартным критериям резистентности МБТ: изониазид — 1 мкг/мл, рифампицин —2 мкг/мл, стрептомицин — 5 мкг/мл, этамбутол 2 мкг/мл. Исследуемые культуры, выросшие на плотной (яичной) среде взвесить на торсионных весах и внести в пробирку с 1 мл среды Сотона, растереть стеклянной палочкой и добавить среду Сотона до получения суспензии 2 мг/мл. По 0,1 мл суспензии внести в пробирки со средой и раствором противотуберкулезных препаратов (конечная концентрация микробов 0,1 мг/мл). Посевы инкубировать в термостате в течение 7 суток при температуре (371)°С. После окончания срока инкубации в пробирку внести по 0,1 мл 2%-ного раствора 2,3,5 трифенилтетразолия хлористого в среде Сотона. Учет результатов. Учет реакции проводить через 3, 6, 24 часа. Появление розового осадка в пробирках со средой и противотуберкулезными препаратами свидетельствует о наличии устойчивости МБТ к данному препарату. Количественный учет реакции: + - розовый осадок в центре донышка пробирки; ++ - розовый осадок покрывает дно пробирки; - розовый осадок покрывает дно и поднимается на стенки пробирки. Посев исследуемых культур проводить согласно методическим рекомендациям , М., 2003. Упаковка. Препарат расфасовывают по 200 г в полиэтиленовые банки. Хранение. Хранить препарат следует в герметично закрытой упаковке в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 30° С. Срок годности -2 года. Основа питательной среды типа Миддлбрука предназначена для выделения и культивирования МБТ из клинического материала при диагностике туберкулеза. Основу среды (без крахмала) можно использовать для определения лекарственной устойчивости МБТ после внесения в среду соответствующего противотуберкулезного препарата. Представляет собой мелкодисперсный порошок желтого цвета, гигроскопичен, светочувствителен. Состав: панкреатический гидролизат казеина, зкстракт кормовых дрожжей, аммоний сернокислый, 1.-глутаминовая кислота, калий дигидроортофосфат, динатрий фосфат обезвоженный, Натрий лимоннокислый трехзамещенный, железо лимонноаммиачное, магний сернокислый, крахмал водорастворимый, натрий хлористый, малахитовый зеленый, агар микробиологический. Приготовление. 45,4 г препарата размешать в 840 мл дистиллированной воды, добавить 10 мл глицерина, тщательно перемешать и довести до кипения, кипятить 2 мин. Раз- лить во флаконы, стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 20 мин., затем остудить до температуры 45-50°С. В основу стерильно внести 150 мл нормальной лошадиной сыворотки, перемещать, разлить в стерильные пробирки по 6,5 мл Затем пробирки необходимо выдержать в термостате 2 сут. при температуре (З71)°С для контроля стерильности. Готовая среда светло-зеленого цвета. Готовую среду можно использовать в течение 1 мес., при условии хранения ее при температуре 2-8°С. Учет результатов. Рост на среде МБТ обнаруживается через 21-40 сут. МБТ человеческого вида растут в виде шероховатых -колоний белого или желтоватого цвета, могут встречаться сливающиеся между собой 5-варианты. МБТ бычьего вида растут в виде гладких влажных колоний сероватого цвета. При отсутствии роста посевы инкубировать до 2,5 мес. Упаковка. Препарат расфасовывают по 200 г в полиэтиленовые банки. Хранение. Хранить препарат следует в герметично закрытой упаковке в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 30° С. Срок годности -2 года. Преимущество основы: возможность определения лекарственной устойчивости микобактерий путем добавления противотуберкулезных препаратов в процессе изготовления среды, удобство в использовании. Основа питательного бульона типа Миддлбрука предназначена для культивирования МБТ из клинического материала при диагностике туберкулеза. Основу питательного бульона можно использовать для определения лекарственной устойчивости МБТ после внесения в среду соответствующего противотуберкулезного препарата. Представляет собой мелкодисперсный порошок желтого цвета, гигроскопичен, светочувствителен. Состав: панкреатический гидролизат казеина, экстракт кормовых дрожжей, аммоний сернокислый, 1-глутаминовая кислота, калий дигидроортофосфат, динатрий фосфат обезвоженный, натрий лимоннокислый трехзамещенный, железо лимонноаммиачное, магний сернокислый. Приготовление. 14,7 г препарата растворить в 900 мл дистиллированной воды, добавить 4 мл глицерина, тщательно перемешать и довести до кипения, кипятить 1 мин. Разлить во флаконы, стерилизовать автоклавированием при температуре 121°С в течение 20 мин., затем остудить до температуры 45-50° С, затем стерильно внести 100 мл нормальной лошадиной сыворотки, перемешать, разлить в стерильные пробирки по 4,5 мл. Затем пробирки поставить на 1 сут. в термостат при температуре (З71)°С для контроля стерильности. Готовая среда желтого цвета. Готовую среду можно использовать в течение 10 сут. при условии хранения ее при температуре 2-8°С. Учет результатов. Рост МБТ обнаруживается на 9-1 Одень в виде придонного роста, возможно образование пленки на поверхности среды. Посев исследуемых культур и определение лекарственной устойчивости проводить согласно приказу 109 от 21 марта 2003 г . О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации>, М., 2003. Упаковка. Препарат расфасовывают по 200 г в полиэтиленовые банки. Хранение. Хранить препарат следует в герметично закрытой упаковке в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 30° С. Срок годности – 1 год. Преимущество основы: возможность определения лекарственной устойчивости микоба ктерий путем добавления противотуберкулезных препаратов в процессе изготовления среды, удобство в использовании, стандартность по сравнению со средой лабораторного приготовления. Основа питательной среды предназначена для выделения и культивирования МБТ из клинического материала при диагностике внелегочного туберкулеза. Представляет собой мелкодисперсный порошок темно-зеленого цвета, гигроскопичен, светочувствителен. Состав: магний сернокислый 7-водный, натрий лимоннокислый трехзамещенный, квасцы железоаммонийные, калий дигидроортофосфат, аммоний лимоннокислый однозамещенный, натрий глутаминовокислый, крахмал водорастворимый, 1.-цистеин гидрохлорид, малахитовый зеленый. Приготовление. 53 г препарата размешать в 980 мл дистиллированной воды, добавить 20,0 мл. глицерина, тщательно перемешать, довести до кипения, кипятить в течение 2 мин., разлить во флаконы и стерилизовать автоклавированием в течение 20 мин. при температуре 1 21°С. Остудить до температуры 45-50°С, затем добавить 2 л яичной массы, перемешать и разлить в стерильные пробирки по 6,5 мл Коагуляцию среды провести при температуре 85°С в течение 45 мин. в скошенном положении под углом 20-30°. Затем пробирки необходимо выдержать в термостате 2 сут. при температуре (З7±1)°С для контроля стерильности. Готовая основа должна быть темно-зеленого цвета. Готовую основу можно использовать в течение 1 мес. при условии хранения ее при температуре 2-8°С. Учет результатов. Рост на питательной среде МБТ обнаруживается на 21-40 сут. МБТ человеческого вида растут в виде шероховатых Р-колоний белого или слегка желтоватого цвета, могут встречаться сливающиеся между собой 5-варианты. МБТ бычьего вида растут в виде гладких влажных колоний сероватого цвета. При отсутствии роста посевы инкубировать до 2,5 мес. Упаковка. Препарат расфасовывают по 200 г в полиэтиленовые банки. Хранение. Хранить препарат следует в герметично закрытой упаковке в сухом, защищенном от света месте при температуре от 2 до 30° С. Срок годности - 2 года. Преимущество основы: удобство в использовании, стандартность по сравнению со средой лабораторного приготовления. Подготовка материала к посеву: деконтаминация – освобождение материала от сопутствующей гноеродной и гнилостной микрофлоры (обработка материала 10% раствором фосфорнокис-лого натрия, 3% серной кислотой, 4% раствором едкого натрия, 5% щавелевой кислотой); разжижение и гомогенизация – придание материалу гомогенной консистен-ции (встряхивание негомогенного материала в стерильных флаконах со стекля-ными бусами или битым стеклом); Жидкие материалы предварительно центрифугируют и обработке подвергают только осадок. Асептически полученные материалы, не нуждающиеся в декон-таминации. Микроскопическое и культуральное исследование должны прово-диться параллельно только из одной и той же пробы диагностического материала. На твердых питательных средах МБТ дают рост через 3-6 недель (иногда на 60-90 день). Оптимальная температура для культивирования - 37-38с, с хоро-шим доступом воздуха, но могут развиваться и в анаэробных условиях. Инку-бацию проводят в течение 12 недель. На плотных питательных средах МБТ растут в виде светло-кремового морщинистого или чешуйчатого суховатого налета, запах культур ароматический, очень характерный. При росте на плот-ных питательных средах различают 2 типа колоний: Характеристика колоний МБТ
 На жидких питательных средах МБТ растут на поверхности среды в виде неж-ной сухой пленки, которая со временем утолщается, становится бугристо-морщинистой и приобретает желтоватый оттенок. Могут расти (более скудно) в средах из минеральных солей, особенно аммония. В микроколониях вирулент-ные МБТ располагаются в виде жгутов и кос, авирулентные образуют беспоря-дочные скопления. При культуральном исследовании ответ о выделении кислотоустойчивых мико-бактерий дается только после микроскопии окрашенного по Цилю-Нильсену мазка выросших колоний. Молодые культуры могут сравнительно легко обесцвечиваться спиртом, т.к обладают слабой кислотоустойчивостью. Оценку и учет результатов посева производят по следующим критериям: появление роста колоний на средах не ранее 3-4 недель инкубации срок появления роста, начиная со дня посева наличие колоний характерной морфология и окраски микроскопическое подтверждение кислотоустойчивости выделенного микроорганизма при окраске по Цилю-Нильсену загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами Для идентификации M. tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий исполь-зуют различные биохимические тесты (ниациновый, нитратредуктазный тесты, тест с термостабильной каталазой, тест с салициловокислым натрием и др.) Интенсивность роста обозначают по 3-х балльной системе: (1+) — 1— 20 КОЕ — "скудное" бактериовыделение; (2+) — 21—100 КОЕ — "умеренное" бактериовыделение; (3+) — > 100 КОЕ — "обильное" бактериовыделение. *КОЭ –колонийобразующая единица
Система ВАСТЕС В настоящее время для сокращения сроков выращивания МБТ и определения лекарственной устойчивости широко применяются методы с использованием жидких питательных сред и автоматизированных систем: ВАСТЕС 460, ВАСТЕС 960, ВАСТЕС 9000 MB, MB/BacТ/Alert 3D, VersaTREK. Система ВАСТЕС позволяет одновременно исследовать лекарственную устойчивость к ПТП. Для этого используют те же готовые жидкие питательные среды с добавлением ПТП в абсолютной концентрации. Учет лекарственной устойчивости идет в течение 6 недель. К недостаткам методов, ограничивающим возможность его широкого применения, относятся: высокая себестоимость исследования; необходимость применения радиоактивных изотопов и специального радио-метрического оборудования, сложность работы с изотопной технологией; необходимость дополнительного посева на плотную питательную среду при возникновении проблем с идентификацией или интерпретацией результатов. Читайте также:
| ||||||||||||||||
