Что такое цитопатическое действие вирусов

Цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеющее три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток (симпластов); развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;

Внутриклеточные включения, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток.

На уровне клетки выделяют автономные инфекции, если вирусный геном реплицируется независимо от клеточного, и интегрированные инфекции, если вирусный геном включается в состав клеточного. Автономная инфекция делится на продуктивную, при которой образуется инфекционное потомство вирионов, и абортивную, при которой инфекционный процесс обрывается, и новые вирусные частицы не образуются совсем или образуются в небольшом количестве. Продуктивная и абортивная инфекции могут быть острыми и хроническими. Острая инфекция в зависимости от исхода подразделяется на цитолитическую и нецитолитическую. Цитолитическая инфекция завершается деструкцией клеток, или ЦПД, а вирус, вызывающий ЦПД, называется цитопатогенным.

На уровне организма вирусные инфекции делятся на 2 группы:

1) очаговые — вирус репродуцируется в клетках локально у места входных ворот;
2) генерализованные — вирус после локального размножения гематогенно или лимфогенно разносится в различные органы и ткани и формирует вторичные очаги инфекции. Примеры очаговой инфекции — ОРВИ и ОКИ, генерализованной — полиомиелит, корь, оспа.

Острая инфекция протекает непродолжительно, сопровождается выделением вируса в окружающую среду, заканчивается чаще выздоровлением, относится к самолимитирующимся инфекциям. Она может проявляться типичными симптомами (манифестная), а может быть бессимптомной (инаппарантная).

При длительном взаимодействии вируса с макроорганизмом возникает персистентная инфекция (ПИ). В зависимости от состояния организма один и тот же вирус может вызвать как острую инфекцию, так и персистентную, хроническую (вирусы кори, герпеса, гепатитов В, С, аденовирусы). Клинические проявления при ПИ могут быть выраженными, слабо выраженными или отсутствуют совсем. При этом вирус может выделяться в окружающую среду или нет. По этим признакам ПИ подразделяются на латентные, хронические и медленные. Латентные инфекции — скрытые, протекают без клинических проявлений и без выделения вируса. Вызываются онкогенными вирусами, ВИЧ, вирусами герпеса и аденовирусами. Хронические инфекции характеризуются периодами обострений, когда вирус выделяется в окружающую среду, и ремиссий. Примерами таких инфекций являются герпетическая, аденовирусная, гепатиты В и С и др. Медленные инфекции имеют длительный инкубационный период и протекают с медленным развитием симптомов, ведущих к тяжелому нарушению функций организма и летальному исходу.

[7. Включения при вирусных заболеваниях. Природа, локализация. Диагностическое значение.

8. Общие принципы диагностики вирусных инфекций. Методы экспресс-диагностики. Молекулярно-биологическое типирование.]

Культуры клеток, классификация, характеристика. Культивирование вирусов на культурах клеток. Подготовка материала, заражение культуры. Методы индикации и идентификации вирусов.

Для культивирования вирусов в лабораторных условиях используются следующие живые объекты: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные.

I. Культуры клеток

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на первичные (первично трипсинизированные), полуперевиваемые (диплоидные), перевиваемые, трансфецированные.

По происхождению они подразделяются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу — на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток — это клетки какой-либо ткани человека или животного, способные культивироваться в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности в специальной питательной среде, но не способные к длительному размножению. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (диплоидные) культуры клеток — клетки одного генотипа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ — из сердца обезьяны циномольгус, ПЭС — из почек эмбриона свиньи, ВНК-21 — из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС — из почки морской свинки и др.), отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению в клетках таких свойств, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.

Другой источник перевиваемых клеточных линий — злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Получены и наиболее широко в вирусологической практике применяются следующие линии перевиваемых клеток: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Hep-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака легкого в костный мозг; RH — из опухоли почки человека.

Трансфецированные культуры клеток. Разработаны экспериментальные линии культур клеток методом трансфекции (переноса) генов вирусов, контролирующих биосинтез поверхностных антигенов. Такие культуры клеток экспрессируют поверхностный белок определенного вируса (HBs-антиген, gp120 и др.) на мембране клеток культуры. Такие культуры клеток используются с целью изучения иммунологических механизмов патогенеза вирусных инфекций, разработки химиотерапевтических и иммунобиологических препаратов.

Для обеспечения жизнедеятельности культивируемых клеток необходимы питательные среды. По назначению они делятся на ростовые и поддерживающие. В ростовых питательных средах должно содержаться больше питательных веществ, обеспечивающих активное размножение клеток и формирование монослоя. Поддерживающие среды обеспечивают переживание клеток в уже сформированном монослое в период размножения в них вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред — сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит. С целью предотвращения возможного роста микроорганизмов в питательные среды вносят антибиотики.

Последнее изменение этой страницы: 2017-02-17; Нарушение авторского права страницы

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Их подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. Количество вирусных частиц определяют методом титрования по цитопатическому действию (ЦПД) в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для определения их видовой принадлежности. Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотонич. р-ром NaCl. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты. Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток, либо амниотической жидкости куриного эмбриона. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах: используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, осповакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек. Его также используют для дифференциации, селекции вирусов, а также для определения их концентрации в исследуемом материале. Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Выбор экспериментальных животныхопределяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Для заражения используют обезьян, кроликов, морских свинок, хомячков, белых крыс и мышей. Лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) - путем накожного и внутрикожного заражения. Формирование включений: включения наиболее часто формируются при вирусных и хламидиозной инфекциях. Они могут состоять или из собранных вирусных частиц, или из остатков вирусных нуклеиновых кислот. Включения могут образовываться в ядре и цитоплазме клеток. Их присутствие может помогать в установлении правильного диагноза при гистологическом исследовании. Цитомегаловирус- увеличение клеток (цитомегалия).Эозинофильные большие внутриядерные включения, окруженные светлым ободком. Вирусы герпеса- большие эозинофильные внутриядерные включения, окруженные светлом ободком. Ядра в виде матового стекла. Гигантские клетки с 3-8 ядрами. Вирус натуральной оспы -большие, зернистые, округлые эозинофильные цитоплазматические включения (тельца Гарньери). Вирус бешенства-округлые, 2-10 мкм в диаметре, эозинофильные цитоплазматические включения (тельца Негри). Вирус гепатита В-цитоплазма в виде матового стекла. Вирус кори- многоядерные (10-1000 ядер) гигантские клетки Вартина-Финкельдея. Маленькие эозинофильные внутриядерные включения. Вирус контагиозного моллюска-гомогенные эозинофильные цитоплазматические включения, заполняющие клетку и оттесняющие ядро.

Репродукция большинства вирусов сопровождается подавлением синтеза клеточных ДНК, РНК и белков, чтобы предотвратить или ограничить выработку интерферона и обеспечить собственную репродукцию прежде, чем в организме разовьется полноценный иммунный ответ. Чаще всего вирусы специфически угнетают синтез клеточных белков, нарушая образование инициаторного комплекса трансляции, поскольку для трансляции вирусных мРНК этот комплекс обычно не нужен. Например, протеаза вируса полиомиелита расщепляет компонент инициаторного комплекса трансляции. У вируса простого герпеса один из белков матрикса вызывает быстрое разрушение клеточных мРНК.

101.Взаимодействие вируса с клеткой. Формы вирусной инфекции.

Взаимодействие идет в единой биологической системе на генетическом уровне.Существует четыре типа взаимодействия:1) продуктивная вирусная инфекция (взаимодействие, в результате которого происходит репродукция вируса, а клетки погибают);2) абортивная вирусная инфекция (взаимодействие, при котором репродукции вируса не происходит, а клетка восстанавливает нарушенную функцию);3) латентная вирусная инфекция (идет репродукция вируса, а клетка сохраняет свою функциональную активность);4) вирус-индуцированная трансформация (взаимодействие, при котором клетка, инфицированная вирусом, приобретает новые, ранее не присущие ей свойства).После адсорбции вирионы проникают внутрь путем эндоцитоза (виропексиса) или в результате слияния вирусной и клеточной мембран. Образующиеся вакуоли, содержащие целые вирионы или их внутренние компоненты, попадают в лизосомы, в которых осуществляется депротеинизация, т. е. "раздевание" вируса, в результате чего вирусные белки разрушаются. Освобожденные от белков нуклеиновые кислоты вирусов проникают по клеточным каналам в ядро клетки или остаются в цитоплазме.Нуклеиновые кислоты вирусов реализуют генетическую программу по созданию вирусного потомства и определяют наследственные свойства вирусов. С помощью специальных ферментов (полимераз) снимаются копии с родительской нуклеиновой кислоты (происходит репликация), а также синтезируются информационные РНК, которые соединяются с рибосомами и осуществляют синтез дочерних вирусных белков (трансляцию).После того как в зараженной клетке накопится достаточное количество компонентов вируса, начинается сборка вирионов потомства. Процесс этот происходит обычно вблизи клеточных мембран, которые иногда принимают в нем непосредственное участие. В составе вновь образованных вирионов часто обнаруживаются вещества, характерные для клетки, в которой размножается вирус. В таких случаях заключительный этап формирования вирионов представляет собой обволакивание их слоем клеточной мембраны.Последним этапом взаимодействия вирусов с клетками является выход или освобождение из клетки дочерних вирусных частиц. Простые вирусы, лишенные суперкапсида, вызывают деструкцию клетки и попадают в межклеточное пространство. Другие вирусы, имеющие липопротеидную оболочку, выходят из клетки путем почкования. При этом клетка длительное время сохраняет жизнеспособность. В отдельных случаях вирусы накапливаются в цитоплазме или ядре зараженных клеток, образуя кристаллоподобные скопления - тельца включений. Вирусные инфекции подразделяют на антропонозные, присущие только человеку (например, полиомиелит), и зоонозные, являющиеся болезнями животных, к которым восприимчив также человек (например, бешенство). Выделяют природно-очаговые Вир.инф., наблюдающиеся только в их природных очагах, существование которых обусловлено поддержанием вируса в природе независимо от человека. Возбудители большинства этих болезней передаются человеку и животным кровососущими насекомыми — клещами, комарами, москитами. Инфицируя человека, вирусы могут поражать различные органы и системы, и по этому признаку их удобно разделять на кишечные (например, ротавирусы), респираторные (например, вирус гриппа), поражающие ц.н.с. (например, вирусы энцефалитов), внутренние органы (например, вирусы гепатитов), кожу и слизистые оболочки (например, вирус ветряной оспы), сосудистую систему (например, вирусы геморрагических лихорадок), иммунную систему (например, вирус иммунного дефицита человека, вызывающий ВИЧ-инфекцию.

102.Особенности противовирусного иммунитета. Интерфероны, мех-мы дей-ия.

103. Вирусы гриппа, парагриппа. Св-ва. Изменчивость вируса, ее эпидемическое значение, особенности иммунитета. Принципы для специфического лечения и профилактики.Вир.гриппа-РНК сод.вирус,относится к сем.Ортомиксовируса. Им-т округлую форму. В сост. оболочки вир. Гриппавход.геммаглютинины и нейраминидаза. Вир. Гриппа подразд. На3 типа:АВС. Они сод-т 2 антигена:S антиген связан с нуклеокапсидом-общ.для всех типов и V антиген-геммаглютенин, определяющий типы и штаммоспецифичность. Вирус гриппа, вызываетаглютинацию эритроцитов у более 20 видов животных. Вирус гриппа обладает общими антигенами с изоантигенами эритроцитов человека. Это обуславл. Неспособность нек-х людей продуцировать против него антитела. Вир гриппа хор.размн.в амниотической и аллантоической оболочках куриных эмбрионов. Вир.В активно репродуцир.в клудьтурах почек обезьян, при комнt°иннактивир-яс ч/з неск-ко часов, нагревание до 65° погибает в течении 5-10 мин. Чуствителен к высушиванию, бычтро разрушается в кислой и щелочной среде по дей-м УФО-луч, эфиров, хлораминов. Вир.гриппа передается возд.кап. путем при чихании и кашле, разговоре.Он вызыв.ч/з опред эпидемию и эндемии. Проникнув в орг.восприимчив.человека ч/з носоглотку, вир.гриппа внедряется в кл.поверхн.эпителия,сл.обл.верхн.дых. путей. Важн. Ролдь в развитии заб-ия пренадл.интоксикации,к-ая развив. в рез-те всасыв.в кровь вируса и его токсичн.белков. Постинфекционный иммунететобусл.антителами АТ к гемагглютинину и нейраминидазе,к-ые быстр.образ.в выс.титрах больных гриппом. Он носит типа и штаммоспецифический хар-р и обеспеч.невосприимч.людей к вирусу. Если тип А-в теч 1-2 лет, В-3-5 лет, С-пожизненно.Профилактика:Иммунизация: д/я акт.иммунизации примен.живые и инактив-ые вакцины, при вакцинации иннактивир-ой вакц.эффект. 60-70%. Для пассивной профилактики примен.противогрипозные Igчел-ка(из крови доноров иммунизир.гриппозн.вакциной). Для профилактики и купирования симптомов применяют производные аммантадина(ремантадин). Симпт.профил-ка-интерфероон.Лечение: Иммуно-стимулирующие препараты(витамина С); Противовирусные препараты(Существуют два класса препаратов: ингибиторы нейраминидазы и ингибиторы M2 (производные адамантана); Симптоматическое лечение: для облегчения носового дыхания действенны нафтизин, санорин, галазолин.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеет три основных типа:

- кругло- или мелкоклеточная дегенерация;

-образование многоядерных гигантских клеток (симпластов);

- развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;

Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимза мазках из зараженных клеток. Они бывают эозинофильные и базофильные.

По локализации в клетке различают:

Характерные ядерные включения формируются в клетках, зараженных вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения - вирусами оспы (тельца Гварниери и Пашена), бешенства (тельца Бабеша-Негри) и другие. По форме, размерам, структуре, отношению к красителям вирусные включения строго специфичны. Например, тельца Гуарниери имеют округлую, серповидную или амебоидную форму диаметром 1-10 мкм, тельца Бабеша-Негри -овальные или эллипсоидные, достигающие 20 мкм, включения реовирусов серповидные, наполовину охватывающие клеточное ядро, коревые включения - в виде почкующихся мелких дрожжей.

Симпласты представлены гигантскими многоядерными клетками (например, клетки Цапка, выявляемые при герпетических поражениях), образующимися в результате модификации ЦПМ лизосомальными ферментами. Реже наблюдают образование синцитиев— больших конгломератов цитоплазмы, содержащих сотни и тысячи ядер связанных между собой клеток. Образование синцитиев обусловлено модификацией ЦПМ поверхностными гликопротеинами и характерно для парамиксовирусов.

49. Взаимодействие вируса с клеткой, способы проникновения, морфогенез и выход вирусов из клетки

Типы взаимодействия вируса с клеткой. Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный, абортивный и ин-тегративный.

Продуктивный тип — завершается обра­зованием нового поколения вирионов и ги­белью (лизисом) зараженных клеток (цитоли-тическая форма). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитическая форма).

Абортивный тип — не завершается обра­зованием новых вирионов, поскольку инфек­ционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов.

Интегративный тип, или вирогения — характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация).

Адсорбция. Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это высокоспецифический процесс. Вирус адсорбирует­ся на определенных участках клеточной мембраны — так назы­ваемых рецепторах. Клеточные рецепторы могут иметь разную хи­мическую природу, представляя собой белки, углеводные ком­поненты белков и липидов, липиды. Число специфических ре­цепторов на поверхности одной клетки колеблется от 10 4 до 10 5 . Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц.

Проникновение в клетку. Существует два способа проникнове­ния вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорб­ции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка кле­точной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, ко­торая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транс­портироваться в любом направлении в разные участки цитоплаз­мы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки. По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга.

Биосинтез компонентов вируса. Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирус­ные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение ви­русного потомства.

Реализация генетической информации вируса осуществляет­ся в соответствии с процес­сами транскрипции, трансляции и репликации.

Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру:

1. Формирование вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм;

2. Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодей­ствии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала форми­руются нуклеокапсиды, с которыми взаимодействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа);

3. Формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидкости, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки;

4. Сложно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы).

Время, необходимое для осуществления полного цикла реп­родукции вирусов, варьирует от 5—6 ч (вирусы гриппа, нату­ральной оспы и др.) до нескольких суток (вирусы кори, адено­вирусы и др.). Образовавшиеся вирусы способны инфицировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репро­дукции.

1. а) Цитопатический эффект - дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит, в основном, от вида вируса.

Промикроскопировать культуру ткани, зараженную вирусом осповакцины. Зарисовать.

б) Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.

Методика реакции. В пробирки о зараженной вирусом культурой ткани вносят 0,2 мл 0,4% взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубация и вида вируса. Учёт реакции производят под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образуют характерные скопления.

Зарисовать картину гемадсорбции.

в) Цветная реакция. В основу реакции положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, снижающие рН среды. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, в силу чего подавляется их метаболизм и не происходит изме­нение рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый красный. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7 – оранжевый и при рН ниже 7 – желтый.

Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой), рH питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. В случае размножения вируса клетки дегенерируют, и среда сохраняет исходный красный цвет.

Метод цветных проб может быть использован для титрования ви­руса или вируснейтрализирующих антител.

Цветные пробы зарисовать.

г) Метод бляшек предложен Р. Дюльбекко для получения изолированных колоний вируса. В основе метода лежит появление в монослое зараженных вирусом клеток обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующегося из одной вирусной частицы.

Метод заключается в следующем. В специальном флаконе на стенке выращивают монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражают вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону, и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек разной формы и величины, что зависит от вида вируса.

Феномен бляшкообразования зарисовать.

Метод цветных проб: 1 – культура ткани, не заражённая вирусом; 2– культура ткани, заражённая вирусом	Культура ткани, заражённая вирусом полиомиелита (феномен бляшкообразования)

д) Метод флуоресцирующих антител основан на появлении специфического свечения в местах локализации вируса при обработке зараженной ткани флуоресцирующими антителами. Заражаемую культуру ткани выращивают на стеклянных пластинках. Препарат промывают физиологическим раствором, подсушивают и фиксируют в ацетоне при 4 ° С в течение 10 мин. Затем препарат окрашивают специфической флуоресцирующей сывороткой в течение 30 мин при 37 ° С. После окраски препарат промывают физиологическим раствором и высушивают. Просмотр препарата производят с помощью люминесцентного микроскопа.

2. а) Вскрытие куриных эмбрионов. Работу проводят в стерильных условиях. Яйцо ставят воздушным мешком кверху, место вскрытия смазывают спиртом, йодом, еще раз спиртом, обжигают, снимают колпачок и ножницами удаляют прилегающую к отверстию часть скорлупы. Пинцетом снимают подскорлупную обо­лочку, прокалывают пастеровской пипеткой хорионаллантоисную обо­лочку и из полости отсасывают аллантоисную жидкость, содержащую вирус. Жидкость помещают в стерильную пробирку.

Для исследования хорионаллантоисной оболочки из яйца удаляют всё содержимое. Оболочка остается на внутренней поверхности скорлупы или выпадает вместе с содержимым яйца. Оболочку осторожно вынимают пинцетом, помещают в чашку Петри, промывают физиологиче­ским раствором, тщательно расправляют и рассматривают на темном фоне изменения, имеющиеся в ней. Изменения на оболочке строго специфичны. Например, вирус осповакцины вызывает образование многочисленных беловатых втянутых в центре бляшек.

б) Реакция гемагглютинации. Аллантоисную жидкость проверяют на содержание вируса путем агглютинации куриных эритроцитов на стекле (и в пробирках - титрование вируса). Для постановки реакции на стекле к капле вируссодержащего материала добавляют одну каплю 5% взвеси эритроцитов. Реакция проходит в течение 5 мин.

1 – опыт (к капле аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа, добавляют каплю 5% взвеси куриных эритроцитов) 2 – контроль (эритроциты + физ. р-р).

в) Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) может быть использована для определения типа ви­руса или типа и титра антител. Для определения типа вируса на пред­метное стекло наносят по одной капле вирусосодержащего материала (количество капель должно соответствовать количеству сывороток). В приготовленные капли последовательно вносят по одной капле типовых сывороток. Контролем служит физиологический раствор и нормальная сыворотка. Затем в каждую каплю вносят по одной капле 5% взвеси эритроцитов. Результат регистрируют через 5 мин. При соответствии вируса типу сыворотки антитела связывают гемагглютинин вируса, и гемагглютинация не наступает (РТГА положительная). Эта реакция может быть поставлена и в пробирках с целью титрования вируса или анти­тел (антигемагглютининов).

Схема определения типа вируса реакцией торможения гемагглютиниции.

	В каплю вируссодержащей жидкости добавляют каплю типовой сыворотки и каплю 5% взвеси эритроцитов. К– контроль (эритроциты + физ. раствор).
Заключение:__________________________________________________________ _____________________________________________________________________

Контрольные вопросы

Как обнаруживают наличие вируса в культуре ткани?

Почему при размножении вируса цвет среды не изменяется?

С какой целью может быть использован метод цветных проб?

Какие изменения наступают в клетках при размножении вируса?

Как ставят реакцию гемадсорбции? Как выглядит положительная реакция гемадсорбции?

Что собой представляет метод бляшек?

Как обнаруживают вирус гриппа в курином эмбрионе?

Как вскрывают зараженный эмбрион?

Почему происходит реакция агглютинации эритроцитов в присутст­вии вируса гриппа? Каков механизм этой реакции?

Что такое реакция торможения (нейтрализация) гемагглютинации? Для чего она используется?

Как обнаруживают изменения в хорионаллантоисной оболочке, вы­званные вирусом?