Диагностика вирусных и фитоплазменных болезней
Метод индикаторный растений
Метод индикаторных растений — является очень распространенным методом диагностики вирусных и вироидных болезней и идентификации их возбудителей. В основу метода индикаторных растений положено использование растений-индикаторов, которые, в большинстве случаев дают четкие и специфичные симптомы, характерные для определённого вида патогена. Травянистые растения-индикаторы заражают механической инокуляцией соком, в результате заражение может проявляться в виде местных некрозов, изменением окраски и угнетением роста.
Для вируса аспермии томата в качестве индикатора используют молодые растения табака (Nicotiana glutinosa), для диагностики Х-вируса картофеля — амарант шаровидный (Gomphrena globosa). Для выявления заражённости томата вироидом веретеновидности клубней картофеля в качестве индикаторов используют скополию (Scopolia sinensis) или чувствительные сорта томата. В ряде случаев для заражения можно использовать отдельные изолированные листья растений-индикаторов. Соконепереносимые вирусы прививают на индикаторные растения различными методами. В редких случаях, чтобы для передачи вируса
используют насекомых-преносчиков и растение-паразит повилику.
Метод основан на реакции преципитации (образование осадка) между специфичными антителами и белками (антигенами) возбудителя заболевания. Метод серологической диагностики неприменим для идентификации вироидов из-за отсутствия белкового компонента, а также для ряда соконепереносимых вирусов со слабыми иммуногенными свойствами. Для идентификации вирусов в растении могут использоваться следующие модификации серологической диагностики:
1) Иммуноферментный анализ (ИФА) – наиболее высокочувствительный метод, который позволяет получать количественные оценки. В его основе лежит специфическое распознавание поверхностных антигенов вируса антителами, в присутствии ферментов. Данный метод широко используется на практике для идентификации вирусов сельскохозяйственных культур, подходит для серийных анализов.
2) Капельный метод. Проводится следующим образом. На предметном стекле каплю сока растения смешивают с каплей антисыворотки. Через пару минут проводят оценку реакции под микроскопом при малом увеличении в темном поле или даже визуально, без микроскопа.
3) Метод двойной диффузии – проводится в агаровом геле, для определения сферических и других мелких вирусов. Проводится по такой методике, в одни лунки, которые вырезаны в слое агаровой среды, добавляют антисыворотку, а в другие – очищенный сок растения. В геле вирусные частицы и антитела дифундируют друг другу на встречу, и в месте встречи образуют отчетливые линии преципитации в случае их комплиментарной специфичности.
4) Метод радиальной иммунодиффузии. При использовании данного метода антисыворотку добавляют непосредственно в агаровую среду, при этом лунки заполняют соком растений. Реакция является положительной, если вокруг лунок образуются преципитаны в форме колец.
5) Метод адсорбции. Метод основан на том, что перед реакцией с антигеном антитела связывают каким-либо инертным материалом с крупными частицами, например, латексом. При реакции с антигеном происходит хорошо заметная агглютинация всего комплекса.
Метод электронной микроскопии
На ультратонких срезах пораженных тканей растений, при помощи электронных микроскопов можно определить строение, форму и даже размеры вирусов или вироидов. Электронный микроскоп нередко используют в сочетании с серологическими методами (иммуноэлектронная микроскопия), при этом можно обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами. Метод электронной микроскопии используется крайне редко из-за высокой стоимости оборудования и реактивов, сложности выделения вирусов и вироидов, окисления срезов растений и ряда других факторов.
В настоящее время понятие иммунитет растений формулируется как проявляемая им невосприимчивость к болезням в случае непосредственного контакта их (растений) с возбудителями, способными вызвать данную болезнь при существовании необходимых для заражения условий.
Наряду с полной невосприимчивостью (иммунитетом) различают также очень сходные между собой понятия – устойчивость или резистентностьи выносливость или толерантность.
Устойчивыми (резистентными) считают те растения (виды, сорта), которые поражаются болезнью, но в очень слабой степени.
Выносливостью (толерантностью)называют способность больных растений не снижать свою продуктивность (количество и качество урожая или снижать ее настолько незначительно, что практически это не ощущается)
Восприимчивость (поражаемость) – неспособность растений противостоять заражению и распространению патогена в его тканях, т.е. способность заражаться при контакте с достаточным количеством инфекционного начала при соответствующих внешних условиях.
У растений имеются все перечисленные типы проявления иммунитета.
Иммунитет (невосприимчивость) растений к болезням может быть врожденными передаваться по наследству. Такой иммунитет называется естественным.
Врожденный иммунитет может быть активный и пассивный.
Активным иммунитетом называют свойство растений активно противостоять возбудителю. Сюда относят антитоксические реакции растений, образование защитных некрозов (участков отмершей ткани вокруг паразита
Пассивный иммунитет - это свойство растений препятствовать развитию паразита независимо от наличия инфекции. Он связан с анатомо-морфологическими, физико-химическими, физиолого-биохимическими и другими особенностями растений (наличие воскового налета, толщина кутикулы, химический состав растений, осматическое давление, реакция клеточного сока, наличие физиологически активных веществ, эфирных масел, фитонцидов и т.д.). Однако такое деление иммунитета на категории условно.
Наряду с естественным иммунитетом растениям может быть свойственен приобретенный (искусственный) иммунитет - свойство растений не поражаться тем или иным возбудителем, приобретенное растением в процессе онтогенеза.
Приобретенный иммунитет может быть инфекционный, если возникает у растения в результате выздоровления от болезни.
Неинфекционный приобретенный иммунитет может быть создан с помощью специальных приемов под влиянием обработки растений или семян иммунизирующими средствами. Этот тип иммунитета имеет большое значение в практике защиты с.х. растений от болезней.
Повышение устойчивости растений к болезням с помощью искусственных приемов называют иммунизацией, которая может быть химической и биологической.
Химическая иммунизациязаключается в использовании различных химических веществ, способных повышать устойчивость растений к болезням. В качестве химических иммунизаторов используют удобрения, микроэлементы, антиметаболиты. Приобретенный неинфекционный иммунитет может быть создан путем использования удобрений. Так, увеличение дозы калийных удобрений повышает лёжкость корнеплодов в период хранения.
Биологическая иммунизациязаключается в использовании в качестве иммунизаторов других живых организмов или продуктов их жизнедеятельности (антибиотиков, ослабленных или убитых культур фитопатогенных организмов и т.д.).
Устойчивость растений может быть достигнута обработкой их вакцинами – ослабленными культурами патогенов или экстрактами из них.
37.Болезни растений, вызываемые мучнисторосяными грибами. Источники инфекции.
Порядок Настоящие мучнисторосяные, или Эризифальные (Erysiphales). Мучнисторосяные грибы — высокоспециализированные облигатные паразиты высших растений, вызывающие болезнь, называемую мучнистой росой.
Мицелий белый или серый, позднее часто темнеющий, многоклеточный, с одним или несколькими ядрами, поверхностный, прикрепляющийся к субстрату с помощью аппрессорий, от которых отрастают гифы, проникающие с помощью гаусторий в ткани растения. У грибов из рода филлактиния (Phyllactinia) мицелий полуэндофитный. Основная его масса развивается на поверхности субстрата и одновременно отдельные ветви проникают через устьица в ткани листа. У грибов из рода левейллула (Leveillula) вначале образуется исключительно эндофитный мицелий, глубоко проникающий внутрь тканей питающего растения и распространяющийся по межклетникам. Впоследствии такой эндофитный мицелий выходит через устьица на поверхность субстрата, где развивается обильное конидиальное спороношение.
В конце вегетации на тех же растениях у мучнисторосяных в результате полового процесса развиваются шаровидные, белые, потом коричневые клейстотеции с различными наружными выростами или придатками. Придатки удерживают на мицелии незрелые плодовые тела, а после созревания способствуют их соединению в рыхлые комки, легко переносимые ветром. Мучнисторосяные грибы классифицируютсяпо форме придатков, а также по числу сумок в клейстотециях. Сумки бывают по одной или в виде пучков, шаро- или эллипсовидные, без выводного отверстия и ггарафиз, с 2 — 8 аскоспорами. За счет повышения осмотического давления клейстотеций разрывается, сумки растрескиваются и споры выбрасываются из них на некоторое расстояние. Таким образом, в жизненном цикле этих грибов имеются две стадии — конидиальная (бесполая, или анаморфная) и половая (сумчатая, или телеоморфная).
Мучнисторосяные грибы распространены повсеместно. Они зарегистрированы более чем на 10000 видах растений-хозяев.
Вирусы и вироиды – мельчай-е возбуд-ли бол-ей чел-ка,живот-х и раст-й. Они не им.кл.строения,не растут на искусств-х питат-х средах. Размн-ся только в жив-х кл. орган.-хозяина. Вирионы-зрелые вирусные частицы,они содер-т только один из типов нукл-х кислот-ДНК или РНК. Они не спос-ы ни расти,ни дел-ся. Для биосинтеза исп-т рибосомы кл.раст-хозяев,что опр-ся как паразитизм.Вирусы м.разм-ся только в живой кл. Как только они попад-т в кл.раст-хоз.,распад-ся на белок и нукл.к-ту. В рез-те сборки обр-ся зрелые вирионы,у кот-х мол-лы РНК окр-ы белк-й обол-й. В этом сост-ии мн.вирусы обр-т в кл. разл-е включения:кристалл-я и аморфная. Штаммы-это генет-ки измен-е формы вирусов,возник-е в процессе репликации вирионов. По устой-ти в изолир-ом виде вирусы принято разд-ть на 2 гр.: стойкие(сохр-т целост-ть частиц при нагр-ии и подкис-ии,инфекц-ть в отжатом соке) и нестойкие(сод-ся в раст-х в низк-х конц-х и инактивир-ся). Вирусы м.прон-ть в раст-я только ч/з повр-ю покр-ю тк. Вирусы проник-т в раст.ч/з ранки, нанес-е насек-ми –перенос-ми, или ч/з механ-е повреж-я и перемещаются из кл.в кл. по плазмодесмам,от одной части раст.к др.-по провод-ей системе. По хар-ру возд-я на пораж-й орг-м вирусы делят на 2 большие гр.- вирусы мозаич-го и желтушного типа. Хар-я особ-ть прояв-я забол-й желтуш-х вирусов- деформ-я всего раст.или отд-х его частей(скруч-е листьев,карлик-ть, черезмер-я кустист-ть,израст-е). Желт.вир.влияют на сосуд-ю сист.раст., вызыв-т отмир-е и разр-ю кл.флоэмы и т.д. В рез-те зараж-я мозаич-ми вир.измен.окр-ка пораж-х орг-в. Моз.вир.обит-т в кл.парен-мы и перед-ся насек-ми тлями,а желт.вир. обит-т во флоэме и перед-ся цикад-ми. Симптомы вирус-х бол-й: мозаики, деформации листьев, местные,системные и внутр-е некрозы. Методы диагностики: серологич-й(в-ва,кот-е при введении животным обр-т антитела и пол-ли назв-е антигенов), раст.-индикат-в(исп.виды раст.,реагир-х на зараж-е вирусами), внутрикл-х включ-й(обр-е в кл.специфич-х отлож-й-включений), визуальный(по внеш-м симптомам),устан-е инфек-ти(передача вируса от изуч-го раст. контр-му), электр-я микроскопия.
Фитоплазмы-это гр.фитопат-х орг-в,заним-х промеж-е полож-е м/у бакт-ми и вирусами. Кл.им.гантелеобр-ю форму, не им.клеточ стенки, окружены мембраной,чем и отлич-ся от бактерии. Они объед-ы в класс Mollicutes. Заболевание фитопл.:стабборы цитрус-х, карл-ть кукурузы, столбур томатов, курч-ю мелколист-ть щелковицы, филлодию клевера, махровость смородины. Заселяют в основном флоэму.Переносчики: цикадки, листоблошки, светоноски Методы диагностики: раст.-индикат-в(исп.виды раст.,реагир-х на зараж-е вирусами), электр-я микроскопии, микробиологический (заражают им растение, после появления симптомов снова изолируют возб-ля в чисту культуру)
1.Виды прогноза и их назначение.С целью хар-ки ожид-го измен-я и эконом-го значения отдельных видов,оказ-х вред-е возд-е исп-т 3 вида прогнозов: многолетние, долгосрочные и краткосрочные. Многол-е прог.хар-т: 1)сложив-ся средн.уровень экономич-го знач-я отдель-х вред-х видов или их комплексов на каждой культуре, в регионе и стране в целом,а также вероятную частоту этого отклонения по годам;2)вероятное измен-е всех отмеч-х показ-й в будущем в связи с перспективой развития специализации с/х произ-ва и его эколог-ю обстан-ку с учетом солнечной радиации.Эти прогнозы разр-т науч-е учережд-я сроком не менее 5 лет. Они предн-ы для обос-я программ научной раб., планир-я произв-х средств защиты, совершен-е стр-ры службы з/р в случае знач-го усиления вредон-ти отдель-х видов,стан-ся базой для совер-я теорий и техн-й з/р. Долгоср-е прог.разр-ся на предст-й год или сезон. Они хар-т: применит-ы к отд-ым регионам,ожид-е заселение и распр-е вред-х видов, плот-ть посел-я вред-ей и интен-ть разв-я бол-ей, интен-ть размн-я, темпы развития, выживаемость,вредон-ть. Все эти показ-ли срав-ся с предыд-им годом. Разраб-ся науч-ми учереж-ми совм-о с опер-ой службой з/р. Они служат для орган-ии профилак-х меропр-й, текущ-го план-й защит-х меропр-й, затрат матер-о техн-х и труд-х ресур-в. Прог. На сезон разр-ся в основ-м со стан-й з/р для наиб-ее вред-х видов и бол-й, способ-х вызв-ть эпифит-й. Краткоср-е прог.сост-т на срок от неск-х дней до месяца для быстро распростр-ся вред-й и бол-й и яв-ся уточняющими. Их разраб-т в регионе, также при непредвид-ой эколог-ой обст-ке чаще всего погод-х условий. На основе этих прог-в м. дополн-о включ-ся в план защит-й меры. Их разр-т специал-ты опер-ой службы.
2.Основные задачи пункта сигнализации и прогноза.Профил-я защита вегетир-х посевов и насажд-й, выбор сроков и опред-е место пров-я защит-х мероприятий опир-ся на фенол-ий прогноз и прог.вредон-ти. Фенол-е прог. Опред-т дату наступ-я фенол-х явлений. Их разраб-т на период, непрев-ий продол-ть одной генерации и устан-е сроков до 1мес. Эти прог.служат основой для опр-я потен-ой вредон-ти отд-ых видов и устан-я сроков пров-я защ-х меропр-й. Прог.вред-ти предн-н для опр-я ожид-го уровня, потерь урожая и установ-е экон-ой целесообр-ти защит-х меропр-й. Для экстрен-го оповещения хоз-в о рекомен-х сроках проведения защит-х меропр.против конкр-го вида или комплекса вида госуд-ой службы з/р пров-ся сигнал-я. Далее хоз-ом пред-т опред-ть, какие поля и насаждения подлежат обработке.
3.Основные методы учета вредителей, применяемые для оценки фитосанитарного состояния посевов и насаждений: маршрутные обслед-я и детальные учеты. Цель-исслед-е фауны вр-ей, видового состава возб-ей бол-ей, сбор информации о простр-ой струк-ре попул-й. В рез-те устан-т засел-е и незасел-е вредным видом биотопы и опр-т размеры засел-х площадей. Маршрут выбир-т на основании плана землеполь-я и распр-я культур с учетом предш-в, хар-ра рельефа, типа почвы и т.д. Для набл-й и учетов исп-т методы визуальн-е осмотры площадок и растений, кошение сачком. По рез-м маршр.обслед.сост-т картосхемы распр-я вред-й и бол-й на кот-х указ-т интен-ть разм-я. При детальных учетах опр-т числ-ть вред-х орг-в. Сущес-т разл-е класс-ции методов учета. Так, если за основу взять местооб-е вред-го обьекта, то выделяют: учет почвооб-х вред-й;учет вред-й, обит-х на раст-х; учет вред-й, обит-х внутри раст-х тк.; учет нанос-х повр-й. Можно классиф-ть методы учета по технике пров-я: визуальные; с исп-м разл-х ловушек,сачка; почвен-е раскопки. Чтобы данные, получ-е в раз-х регионах и в разные годы, были сопоставимы, реком-ся исп-ть един-е методы учета для отд-х видов вред-й
4.Принципы действия феромонных ловушек. Их роль в краткосрочном
прогнозировании насекомых - вредителей (приведите примеры). В брачный период самцы прил-т к самкам,ориентируясь на специфич-е вещ-во, выдел-е самками. В практике феромоны исп-т для учета яблонной, вост-й, сливовой плодожорок, калифорн-ой щитовки, степного и посевного щелкунов, гроздевой листовертки, картофельной моли, озимой и др. подгрыз-х совок. Ловушки состоят из крышки,дна и крючка для подвешивания. На дно помещ-т вкладыш, смазан-й спец-м клеем, в центр вкладыша – капсулу синтетич-м феромоном опред-го вида насек-х. С помощью фер.лов.обесп-ся надзор за числ-тью, опр-ся сроки и целесообраз-ть пров-я защит-х меропр-й. Эффект-ть фер.лов.зависит от их констр-ии, высоты устан-ки над раст-ми, типа исп-го клея,силы ветра и типы дозатора.
5.Основы долгосрочного прогноза для вредителей и болезней многолетней тенденцией.Разраб-т ежегодно в областя, краях, респуб-х. По ним опр-т необх-е объемы средств защиты раст., планир-т профилак-е и истреб-е работы. Прогнозы содержат хар-ку ожидаемой ситуации в кажд.конкр-ом р-не и реком-ии по з/р от всех видов вред-й. Доводят до свед-я всех хоз-в. Разраб-т обзоры распр-я вред-х объектов, в которых дают анализ фактич-го полож-я за прош-й год и оцен-т эффек-ть провед-х защит-х работ.
Визуальная диагностика — наиболее простой метод. Хотя в ряде случаев и удается достоверно установить вирусную природу заболевания по его внешним признакам (например, кольцевые или линейные хлоротичные узоры на молодых листьях), их идентификация затруднена частым бессимптомным характером развития болезней. Так, большинство промышленных сортов земляники являются скрытыми носителями вирусной инфекции. С другой стороны, вирусные симптомы сходны с симптомами неинфекционных болезней, вызванных недостатком (избытком) макро- и микроэлементов (азота, магния, железа, меди, хлора). Действие гербицидов, регуляторов роста на растения при неправильном применении также может быть сходно по симптоматике с вирусными болезнями. Поэтому визуальная диагностика требует дополнительных методов исследований.
При диагностике вирусных заболеваний требуется установить инфекционность заболевания. Для этого вирус нужно передать на здоровое растение. Чтобы определить вирусы, распространяющиеся контактно-механическим способом, проводят инокуляцию соком больного растения. Для этого растительный материал растирают в ступке, из растертой массы отжимают сок, фильтруют и осторожно втирают в лист молодого здорового растения. Через определенное время (5—20 дней) наблюдают за развитием симптомов. Универсальный метод передачи вирусной инфекции — прививка, когда больной привой (черешок листа, верхушка побега) прививают на здоровый подвой. Редко для передачи вирусов используют насекомых-пере- носчиков и растение-паразит — повилику.
Метод индикаторных растений — широко распространенный метод диагностики вирусных болезней и идентификации вирусов. Он основан на использовании тест-растений (индикаторных растений), дающих четкие, часто строго специфичные по отношению к определенному виду вируса симптомы. Заражение травянистых растений- индикаторов осуществляют механической инокуляцией соком. Симптомы проявляются в виде местных некрозов, реже системной реакцией (изменением окраски, угнетением роста). Для вируса аспермии томата в качестве индикатора можно использовать молодые растения табака (Nicotiana glutinosa), для диагностики Х-вируса картофеля — амарант шаровидный (Gomphrena globosa). В редких случаях для заражения используют отдельные изолированные листья растений- индикаторов. Соконепереносимые вирусы переносят на индикаторные растения методом прививки. Так, для диагностики вирусов земляники используют прививку черешком листа на индикаторные клоны земляники лесной (Fragaria vesca).
Несмотря на то, что это довольно длительный, экономически затратный и трудоемкий метод идентификации вируса (нужны теплицы, семена многих растений и др.), конечный результат (характер симптомов) является довольно точным и является одним из основополагающих критериев отличия вирусов друг от друга по биологическим свойствам.
Серологический метод широко распространен при диагностике вирусов. Если теплокровному животному, например кролику, ввести в кровь очищенный препарат растительного вируса, иммунный аппарат животного в ответ на введение чужеродного белка (антигена) начнет вырабатывать специфичные к этому белку антитела, связывающие его. С помощью специальных методик эти антитела можно выделить из сыворотки и использовать для определения вирусов непосредственно в соке растения. Разработаны методы, которые позволяют вырабатывать антитела из культуры in vitro клеток животного. В результате реакции между антителом и антигеном образуется осадок (преципитат, или серум), различимый визуально или с помощью микроскопа. В основе связи антиген—антитело лежит принцип ключа и замка, т.е. она очень специфична. Каждое определение необходимо проводить в присутствии соответствующего контроля.
Разработано несколько модификаций метода.
Метод электронной микроскопии дает возможность быстро получить информацию о наличии вирусных частиц в растении. С помощью электронных микроскопов в ультратонких срезах пораженных частей растений можно установить форму, строение и даже размеры вирусов. Трансмиссионный электронный микроскоп используют для серийных анализов вирусной инфекции в соке им- муноэлектронной микроскопией, при которой можно обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами.
Метод гель-электрофореза основан на электрофоретическом разделении предварительно очищенных нуклеиновых кислот вируса (вироида) или его белкового компонента в полиакриламидном (агарозном) геле при силе тока 3 и 6 мА с последующим окрашиванием красителем зон соответственно нуклеиновых кислот или белков. При сравнении высоты полученных окрашенных линий с высотой стандартных, или маркерных, зон определяют массу (соответственно и размеры) вирусных структур.
Молекулярно-генетические методы основаны на знании строения молекулы РНК вируса или вироида. Отличаются высокой надежностью, чувствительностью, быстротой, пригодны для серийной диагностики. К недостаткам относятся высокая стоимость реактивов и оборудования для проведения методов, а также необходимость предварительного изучения генетических кодов патогенов.
Метод ДНК-зондов — другая модификация молекулярно-биологического метода, также основана на принципе комплементарности видоспецифичных последовательностей нуклеиновых кислот. Синтезируют специфические к РНК вируса или вироида зонды, которые представляют собой комплементарные цепи ДНК (кДНК), полученные с помощью обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц, затем их метят радиоактивным фосфором (Р 32), вводят в бактерии
К методу пересадки растений на другой участок прибегают для подтверждения или опровержения вирусной природы заболевания. Например, для определения причин хлороза растений их можно пересадить на заведомо благоприятную почву. Если заболевание неинфекционное, то через некоторое время у растений восстановится типичная зеленая окраска. При вирусном заболевании хлороз сохранится.
Метод включений. Развитие некоторых вирусов в клетках растения сопровождается образованием в них скопления вирусных частиц (включений, или кристаллов Ивановского), которые обнаруживаются с помощью обычного светового микроскопа. Каждому виду вируса свойственна своя форма вирусных включений, образующихся обычно в клетках волосков или эпидермиса листьев. Например, для вируса табачной мозаики характерны игловидные и гексагональные кристаллы; для Х-вируса картофеля и вируса мозаики пшеницы типично образование сферических аморфных тел.
Для выявления зеленой крапчатой мозаики огурца, скручивания листьев картофеля и некоторых других болезней применяют химические аналитические методы диагностики в пораженных тканях растений.
Метод визуальной диагностики
В большинстве случаев определить вирусную природу болезни не трудно. Обычно ее определяют по внешним признакам, таким как линейные хлоротичные узоры или кольцевые узоры на молодых листьях. Однако, их идентификация часто затруднена, так как вирусы имеют бессимптомный (латентный) характер развития. Симптоматика зависит от состояния организма, агрессивности штамма патогена, внешних условий и продолжительности пребывания вируса или вироида в клетках хозяина. Например, симптомы заболевания отчетливо выражены у растений, росших на ярком свету и при умеренной температуре, при высокой температуре и недостаточном освещении симптоматика заболевания может быть совсем не выражена.
Посветление жилок самых молодых листьев нередко является одним из первых признаков системной вирусной инфекции. Жилки становятся жёлтыми и полупрозрачными. Листья, образующиеся позже, могут быть мозаичными, крапчатыми или совсем жёлтыми (хлоротичными).
Инкубационный период заболевания зависит от вида вируса, растения-хозяина и условий среды, но в любом случае он составляет несколько дней или недель.
Если первые симптомы вироза заметны на рассаде, то источник инфекции находился либо в семенах, либо заражение произошло при посредстве переносчика. Если заражённые растения расположены в культуре совершенно случайно или же только в рядках, посаженных из одной партии, то это говорит о том, что, скорее всего, был заражен посадочный материал. Если на отдельных участках поля обнаруживаются заболевшие растения, причём появление заражённых участков связано с почвенными различиями, имеются все основания предполагать распространение вирусов через почву.
Следует отметить также, что существуют симптомы, свойственные вирозам, но вызванные другими причинами (поражения фитоплазмами, некоторыми бактериями и сосущими вредителями). К появлению симптомов, сходных с вирусной инфекцией, часто приводят нарушения минерального питания, например, связанные с дефицитом железа (рис. 1). Различные деформации органов могут вызывать регуляторы роста и гербициды различной природы (рис. 2).
Таким образом, при помощи метода визуальной диагностики, точной идентификации по внешним признакам поражения вирусами и вироидами невозможна, однозначный ответ может быть получен только с использованием инструментальных методов (иммуноферментный анализ, ПЦР-анализ и т. д. ).
Метод индикаторный растений
Метод индикаторных растений — является очень распространенным методом диагностики вирусных и вироидных болезней и идентификации их возбудителей. В основу метода индикаторных растений положено использование растений-индикаторов, которые, в большинстве случаев дают четкие и специфичные симптомы, характерные для определённого вида патогена. Травянистые растения-индикаторы заражают механической инокуляцией соком, в результате заражение может проявляться в виде местных некрозов, изменением окраски и угнетением роста.
Для вируса аспермии томата в качестве индикатора используют молодые растения табака (Nicotiana glutinosa), для диагностики Х-вируса картофеля — амарант шаровидный (Gomphrena globosa). Для выявления заражённости томата вироидом веретеновидности клубней картофеля в качестве индикаторов используют скополию (Scopolia sinensis) или чувствительные сорта томата. В ряде случаев для заражения можно использовать отдельные изолированные листья растений-индикаторов. Соконепереносимые вирусы прививают на индикаторные растения различными методами. В редких случаях, чтобы для передачи вируса используют насекомых-преносчиков и растение-паразит повилику.
Серологически метод диагностики
Метод основан на реакции преципитации (образование осадка) между специфичными антителами и белками (антигенами) возбудителя заболевания. Метод серологической диагностики неприменим для идентификации вироидов из-за отсутствия белкового компонента, а также для ряда соконепереносимых вирусов со слабыми иммуногенными свойствами. Для идентификации вирусов в растении могут использоваться следующие модификации серологической диагностики:
1) Иммуноферментный анализ (ИФА) — наиболее высокочувствительный метод, который позволяет получать количественные оценки. В его основе лежит специфическое распознавание поверхностных антигенов вируса антителами, в присутствии ферментов. Данный метод широко используется на практике для идентификации вирусов сельскохозяйственных культур, подходит для серийных анализов.
2) Капельный метод. Проводится следующим образом. На предметном стекле каплю сока растения смешивают с каплей антисыворотки. Через пару минут проводят оценку реакции под микроскопом при малом увеличении в темном поле или даже визуально, без микроскопа.
3) Метод двойной диффузии — проводится в агаровом геле, для определения сферических и других мелких вирусов. Проводится по такой методике, в одни лунки, которые вырезаны в слое агаровой среды, добавляют антисыворотку, а в другие – очищенный сок растения. В геле вирусные частицы и антитела дифундируют друг другу на встречу, и в месте встречи образуют отчетливые линии преципитации в случае их комплиментарной специфичности.
4) Метод радиальной иммунодиффузии. При использовании данного метода антисыворотку добавляют непосредственно в агаровую среду, при этом лунки заполняют соком растений. Реакция является положительной, если вокруг лунок образуются преципитаны в форме колец.
5) Метод адсорбции. Метод основан на том, что перед реакцией с антигеном антитела связывают каким-либо инертным материалом с крупными частицами, например, латексом. При реакции с антигеном происходит хорошо заметная агглютинация всего комплекса.
Метод электронной микроскопии
На ультратонких срезах пораженных тканей растений, при помощи электронных микроскопов можно определить строение, форму и даже размеры вирусов или вироидов. Электронный микроскоп нередко используют в сочетании с серологическими методами (иммуноэлектронная микроскопия), при этом можно обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами. Метод электронной микроскопии используется крайне редко из-за высокой стоимости оборудования и реактивов, сложности выделения вирусов и вироидов, окисления срезов растений и ряда других факторов.
Электронный микроскоп фото
Метод электрофореза
Этот метод основан на разделении предварительно очищенных нуклеиновых кислот вируса (вироида) или его белков в геле под действием электрического тока, с последующим окрашиванием зон. Метод электрофореза позволяет определить массу и размеры вирусных или вироидных структур. Метод широко используют для визуального исследования конечного продукта полимеразной цепной реакции. Для регистрации полученных результатов делают фотографии геля в проходящем или отражённом свете.
Молекулярно-биологические методы основаны на знании строения молекулы РНК (ДНК) вируса или вироида. Наиболее распространённым тестом является амплификация (умножение) видоспецифичных последовательностей РНК в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выделенные из исследуемых растений отдельные фрагменты РНК, специфичные только для одного вида или рода вирусов, многократно умножают с помощью ферментов в присутствии праймеров (соответствующих олигонуклеотидов). При этом их количество в конечном продукте реакции превышает исходное число копий выбранного фрагмента РНК в миллионы раз. Далее вирусные РНК (ДНК) обнаруживают методом электрофореза в геле или методом иммунофлуоресценции. Метод получает широкое распространение в практических вирусологических работах.
Метод ДНК-зондов также основан на принципе комплиментарности нуклеиновых кислот. Синтезируют специфичные зонды, которые гибридизуются только с определёнными нуклеотидными последовательностями РНК вируса или вироида. В зависимости от выбора зондов можно дифференцировать группы, виды и даже штаммы вирусов и вироидов.
Электрофорез фото
Метод включений
В последствии развития вирусов, в клетках растений образуются скопления вирусных частиц, (включений), называемых кристаллами Ивановского, которые видны с помощью обычного светового микроскопа. Каждый вирус имеет свою форму вирусных включений, которые образуются, чаще всего, в клетках эпидермиса листьев или в клетках волосков. Например, вирус табачной мозаики имеет гексагональные и игловидные кристалы; Х-вирус картофеля типично образование сферических аморфных тел. Для выявления вируса зелёной крапчатой мозаики огурца, скручивания листьев картофеля и некоторых других применяют химические аналитические методы диагностики.
Читайте также: