Контроль специфической активности вируса

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС
"Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток

Настоящая фармакопейная статья определяет основные требования к биологическим методам испытаний препаратов интерферона с использованием клеточных культур и распространяется на субстанции и лекарственные формы интерферона человеческого всех типов природного и генно-инженерного происхождения.

Биологические методы с использованием клеточных культур применяют для определения следующих показателей качества препаратов интерферона:

2. Специфическая активность

3. Токсичность (для интерферона альфа-типа).

Методы определения подлинности и специфической активности основаны на способности интерферона подавлять цитопатическое действие вируса на клеточную культуру. При проведении испытаний используют клетки, чувствительные к данному типу интерферона и к вирусу-индикатору. Выбор комбинации "клеточная культура/вирус" основывается на том, какая из них обеспечивает наиболее чувствительный ответ для данного типа интерферона в сравнении со стандартным образцом (СО). Наиболее часто используются следующие комбинации клетка/вирус: клетки бычьих почек Madin-Darby (MDBK), лимфоидные клетки человека Л-41, диплоидные клетки человека Л-68 /вирус везикулярного стоматита (VSV); клетки линии Vero, Нер2С, L929, Л-41/вирус энцефаломиокардита мышей (EMCV); клетки фибробластов человека/вирус леса Семлики, вирус Синдбис.

Подготовка к испытаниям.

Клетки . Культуру клеток выращивают способом, предусмотренным для данного вида клеток в частной фармакопейной статье, таким образом, чтобы обеспечить образование полноценного монослоя в лунках культуральных планшетов в количестве, необходимом для проведения анализа.

Образцы препарата . Пробоподготовка используемых образцов для анализа производится в соответствии с указаниями, приведенными в частных фармакопейных статьях на конкретный препарат.

Приготовление суспензии индикаторного вируса . Суспензию индикаторного вируса готовят в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи на препарат.

Раздел 1. Подлинность

Подлинность препаратов интерферона определяют путем нейтрализации противовирусной активности испытуемого препарата (ИП) стандартным образцом анти-интерферонового иммуноглобулина (IgG) или анти-интерфероновыми поликлональными антителами, предусмотренными в нормативной документации (НД) на соответствующий препарат. Реакцию нейтрализации противовирусной активности ИП проводят в культуре клеток, чувствительных к данному типу интерферона, в присутствии индикаторного вируса.

Порядок определения подлинности

Для определения подлинности препаратов интерферона используют монослой культур клеток, чувствительных к исследуемому типу интерферона, полученного при температуре °С в атмосфере с % в 96-луночных культуральных планшетах, при конечной концентрации клеток 25000-30 000 кл/лунку.

Готовят разведения стандарта анти-интерферонового иммуноглобулина или анти-интерфероновых поликлональных антител, рабочую дозу ИП и стандарта для определения активности интерферона (СО).

Испытуемый препарат и стандартный образец интерферона разводят таким образом, чтобы конечное разведение содержало 10 ед. противовирусной активности интерферона (без перевода в МЕ).

Готовят двукратные разведения стандарта анти-интерфероновых иммуноглобулинов или анти-интерфероновых поликлональных антител до концентраций, указанных в частных фармакопейных статьях на конкретные препараты.

Объединяют в пробирках равные объемы (по 0,5 мл) соответствующих разведений анти-интерферонового иммуноглобулина (анти-интерфероновых поликлональных антител) с рабочей дозой испытуемого препарата и СО. Инкубируют полученные смеси при температуре °С в течение 1 ч. Из лунок микропанелей с культурой клеток выливают ростовую питательную среду, в лунки вносят по 0,1 мл нейтрализованной смеси, не менее чем по 4 лунки на каждое разведение анти-интерферонового иммуноглобулина (анти-интерфероновых поликлональных антител).

Для оценки качества монослоя клеток в процессе постановки реакции (контроль) оставляют не менее 4 лунок, в которые не вносят нейтрализованную смесь. В этих лунках заменяют ростовую питательную среду на поддерживающую, которая должна обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетках вируса. В качестве поддерживающей среды обычно используют питательную среду без сыворотки плодов коров с добавлением антибиотиков.

Для контроля дозы индикаторного вируса оставляют 16 лунок в микропанели с культурой клеток, предварительно заменив в этих лунках ростовую питательную среду на поддерживающую.

Проверяют дозу вируса-индикатора и активность стандартного образца интерферона как описано в разделе 2 "Специфическая активность".

После внесения индикаторного вируса в лунки микропанелей с культурой клетки инкубируют при температуре °С в атмосфере с % до появления первых признаков цитопатических изменений в клетках с индикаторным вирусом в дозе 1 мл (обычно в течение 48 ч). Монослой в лунках с 0,1 мл индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках.

Учет и интерпретация результатов.

Учёт результатов осуществляют при условии, что доза внесённого вируса соответствует 100 мл и при отсутствии признаков дегенерации в контрольной культуре клеток.

Нейтрализация активности испытуемого образца анти-интерфероновым иммуноглобулином (поликлональными антителами) в сравнении с МСО/СО, свидетельствует о том, что в испытуемом образце содержится интерферон соответствующего типа.

Раздел 2. Специфическая активность

Определение специфической активности является основным методом количественной оценки качества препаратов интерферона.

Активность интерферона определяют путем сравнения протективного действия испытуемого препарата (ИП) с аналогичным действием международного стандартного образца (МСО) или соответствующего стандартного образца (СО), откалиброванного в Международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандарту.

Метод испытан в трех международных исследованиях под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) на международных стандартах всех типов человеческого интерферона (альфа, бета, гамма) и продемонстрировал чувствительность, надежность и воспроизводимость.

Определение специфической активности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток, чувствительных к исследуемому типу интерферона, полученном при температуре °С в атмосфере с % в 96-луночных культуральных планшетах. Плотность клеточной культуры при этом составляет 25000-30000 клеток в каждой лунке.

Противовирусную активность определяют в сравнении с МСО/СО активности человеческого лейкоцитарного интерферона для препаратов природного происхождения и в сравнении с МСО/СО активности человеческого рекомбинантного интерферона для генно-инженерных препаратов соответственно.

Готовят серию десятикратных и двукратных разведений исследуемого препарата в поддерживающей среде (на 4 разведения выше и ниже предполагаемого титра активности). Параллельно готовят соответствующие разведения стандартного образца.

Из лунок планшетов с клеточным монослоем удаляют ростовую среду и вносят приготовленные разведения испытуемого препарата и стандарта (по 100 мкл), используя на каждое разведение не менее 4 лунок с культурой клеток. Для контроля дозы индикаторного вируса оставляют 16 лунок с культурой клеток, а для контроля состояния монослоя клеток - 4 лунки. В эти 20 лунок вносят по 100 мкл поддерживающей среды, используемой для приготовления разведений испытуемых препаратов. Инокулированные и контрольные культуры клеток инкубируют в течение 24 ч при температуре °С в атмосфере с % . Затем в каждую лунку с испытуемым материалом и стандартом вносят по 100 мкл вирусной суспензии, содержащей рассчитанную заранее дозу индикаторного вируса - 100 . В лунки контроля клеток вносят такой же объем (100 мкл) поддерживающей среды.

Определение дозы вируса-индикатора

Определение дозы индикаторного вируса начинают с установления его активности.

Для определения активности вируса-индикатора готовят десятикратные разведения вируса в поддерживающей среде в лунках 24-луночного планшета. Из лунок культурального планшета удаляют ростовую среду и вносят по 100 мкл приготовленных разведений вируса не менее чем по 6 лунок на каждое разведение. Инокулированные и контрольные культуры клеток инкубируют в течение 24 ч при температуре °С в атмосфере с % . За титр (активность) вируса принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок оказалась полностью пораженной цитопатическим действием. Титр вируса выражают в тканевых цитопатических дозах - .

Активность вируса вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле:

где - lg разведения ниже которого произошла 100% гибель клеток (+)

d - lg интервала между разведениями (1,0)

n - число лунок на каждую дозу (4)

р - число лунок, давших гибель (+) в и последующих разведениях.

После установления активности вируса производят подсчёт дозы для последующего внесения в лунки с испытуемым препаратом.

Одновременно с внесением вируса-индикатора осуществляется контроль взятой дозы вируса на 16 лунках с культурой клеток, предназначенных для этих целей (по 4 лунки на каждое разведение вируса).

Вносят вирус по 100 мкл, начиная с разведения, соответствующего 100 мл, и до разведения, соответствующего 0,1 мл с коэффициентом разведения равным 10.

Лунки с культурой клеток для оценки состояния монослоя клеток остаются интактными.

После внесения индикаторного вируса культуру клеток инкубируют при температуре °С в атмосфере с % до появления первых признаков цитопатических изменений в клетках с индикаторным вирусом в дозе 1 мл. Монослой в лунках с 0,1 мл индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лукнах.

Учёт активности интерферона осуществляют при условии, что доза внесённого вируса соответствует 100 мл; в лунках с клетками, зараженными индикаторным вирусом, наблюдается практически полный цитопатический эффект (80-100%), а в контрольной культуре клеток отсутствуют признаки дегенерации.

За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок полностью защищена от цитопатического действия вируса.

Титр интерферона вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле:

где - разведения ниже которого произошла 100% защита (-)

d - интервала между разведениями (1,0)

n - число лунок на каждую дозу (4)

р - число лунок, давших защиту (-) в и последующих разведениях.

Противовирусную активность интерферона в МЕ/мл вычисляют по формуле:

- противовирусная активность интерферона в исследуемом образце в МЕ/мл

- противовирусную активность СО интерферона в МЕ/мл

- титр исследуемого образца

- титр СО в данном опыте

Возможен инструментальный учет результатов с использованием селективного окрашивания живых клеток, защищенных интерфероном от действия вируса, элюирования красителя, фотометрирования оптической плотности элюата и последующей компьютерной обработки результатов. Описание инструментального метода приводят в частных фармакопейных статьях.

Раздел 3. Токсичность

Для определения токсичности препаратов интерферона альфа-типа на клеточных культурах используют монослойные перевиваемые или диплоидные клетки, чувствительные к данному типу интерферона и применяемые для определения его специфической активности (см. раздел "Общие положения"). Клетки выращивают способом, указанным в соответствующей ФСП на препарат (так же, как и для определения специфической активности). В лунки с 1-3- суточным монослоем вносят по 0,1 мл препарата в разведении, указанном для каждого конкретного препарата в частной фармакопейной статье. В лунки с контрольной культурой вносят поддерживающую среду без препарата. Культуры выдерживают в течение 24-48 ч при температуре °С в атмосфере с % , после чего просматривают под микроскопом. Клеточный монослой должен оставаться неповрежденным, без признаков дегенерации и не отличаться от контрольных проб.

> Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина сибиреязвенная комбинированная"

Содержание Информация Министерства здравоохранения РФ от 24 сентября 2013 г. "Общие фармакопейные статьи и фармакопейные статьи.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Исследовали на модели культур клеток зависимость специфической инфекционной активности вируса бешенства промышленных (фиксированных) штаммов L. Pasteur и CVS от длительности и температуры хранения. Вирусную суспензию накапливали в клеточной культуре / С13 и замораживали при -20 и -80°С. Анализ специфической активности проводили через 1 неделю, 1, 2, 3, 6 и 12 месяцев хранения. Экспериментально установили, что для исследованных штаммов более эффективной для длительного хранения является температура -80°С.

Ключевые слова: вирус бешенства, вируссодержащая суспензия, антирабический иммуноглобулин, антирабическая вакцина, долгосрочное хранение, низкие температуры

The dependence of specific infectious activity on the cell culture model of rabies virus industrial (fixed) strains L. Pasteur and CVS from the duration and storage temperature was investigated. Viral suspension was produced by cell culture / C13 and frozen at -20 and -80°C. Analysis of the specific activity was performed after 1 week, 1, 2, 3, 6 and 12 months of storage. It was experimentally discovered that the temperature -80°C is more effective for storage for the studied strains.

Keywords: rabies virus, virus-containing suspension, rabies immunoglobulin, rabies vaccine, long-term storage, low temperature

Введение

Бешенство является опасным нейроинфекционным заболеванием теплокровных животных (в том числе и человека), которое встречается более чем в 150 странах мира [7, 10]. Возбудителем данного заболевания является РНК-содержащий вирус рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae, порядка Mononegavirales. Заражение бешенством главным образом происходит через укус, в ходе которого инфекция передаётся со слюной. Основной мишенью вируса бешенства является центральная нервная система (ЦНС). Вирус бешенства является единственным из царства Virae, который поражает всех теплокровных животных с летальностью 100 %. От укусов животных, больных бешенством, ежегодно в мире погибает более 55 000 человек. В связи с этим согласно оценке Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) бешенство входит в пятёрку болезней, которые наносят наибольший ущерб человечеству и мировой экономике. Единственным методом борьбы с данным заболеванием являются пред- и постэкспозиционная профилактика, в рамках которой используются антирабические иммуноглобулин (АИГ) и вакцина (в дальнейшем — антирабические препараты) [1, 7, 10, 11].

Для получения антирабических препаратов и контроля их качества используются аттенуированные (или фиксированные) штаммы вируса бешенства, которые получают в ходе воздействия на полевые изоляты мутагенов или других факторов, позволяющих менять свойства вирионов. В отличие от полевых изолятов штаммы фиксированного вируса бешенства могут быть полностью или частично лишены способности к заражению целого организма животного или человека, но сохраняют возможность заражать ткани и клетки при непосредственном контакте. Наиболее распространёнными в производстве антирабических препаратов являются фиксированные штаммы вируса бешенства L. Pasteur и CVS, выделенные более 100 лет назад из полевых изолятов, ослабленные путём пассирования через мозг кроликов и адаптированные к мозгу мышей и клеточным линиям. С 1996 года ВОЗ рекомендует при производстве антирабических препаратов полностью отказаться от использования вируса бешенства, полученного пассированием через мозговую ткань животных, и использовать для накопления вирусной суспензии клеточные культуры [8, 11].

Цель исследования

Цель исследования — экспериментально определить эффективный температурный режим для долгосрочного хранения суспензии вируса бешенства штаммов L. Pasteur и CVS в условиях производства.

Материалы и методы

В качестве субстрата для накопления суспензии вируса бешенства использовали перевиваемую клеточную линию ВНК-21 / C13 (ATCC CCL-10), которая широко применяется для производства культуральной вакцины против бешенства [5, 6, 8, 12]. Клеточную линию накапливали в пристеночном монослое 1 сутки в стерильных пластиковых флаконах (SPL, Германия). В ходе исследования использовали фиксированные штаммы вируса бешенства L. Pasteur (адаптированный к клеточной линии Vero, № 2061 / Vero, 15 пассаж) и CVS (challenge virus standard), рекомендованные ВОЗ для производства АИГ и антирабических вакцин для животных и человека [8, 12]. Штамм L. Pasteur был адаптирован к клеточной линии ВНК-21 / C13 [6] и предоставлен Институтом Пастера (Нови-Сад, Сербия) вместе с технологическим регламентом производства антирабического антигена.

Вирусную суспензию культивировали в течении 4-х суток с момента заражения в поддерживающей среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) c 0, 2 % бычьего альбумина (PAA, Австрия) в СО₂-инкубаторе (Binder, Германия) при 33ºС и 5 % СО₂. Сбор вирусной суспензии проводили на 4 сутки после заражения. Полученную вирусную суспензию центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут в рефрижераторной центрифуге (MPW, Польша) при 4ºС для удаления клеточного детрита. Супернатант собирали, добавляли к нему сахарозу с конечной концентрацией 5 %, расфасовывали в пластиковые криопробирки (PAA, Австрия) и замораживали при -20 и -80ºС в морозильных камерах (National Lab, Германия). Контроль температуры, при которой хранили криопробирки, производили с помощью спиртовых термометров [5, 6, 8, 12].

Для определения специфической инфекционной активности вирусной суспензии использовали метод титрации вируса в культуре клеток линии ВНК-21 / C13. Суспензию вируса бешенства размораживали через 1 неделю, 1 , 2, 3, 6 и 12 месяцев хрнения при низких температурах (срок наблюдения) и титровали с коэффициентом разведения 5 на культуре клеток ВНК-21 / C13 в 96-луночных планшетах (SPL, Германия) в 5-ти повторах (n = 5). Культивировали клетки 48 часов в СО₂-инкубаторе при 37ºС и 5 % СО₂, затем фиксировали монослой клеточной лини охлаждённым при -20ºС ацетоном. Так как промышленные штаммы вируса бешенства не оказывают на клеточные линии цитопатогенного действия, то для определения инфекционной активности вирусной суспензии использовали метод непрямой флуоресценции. Для этого применяли специфические моноклональные антитела к вирусу бешенства, меченные изотиоцинатом флуоресцина (FITC) (Fujirebio, U.S.A.), которыми производили окрашивание клеточного монослоя. Учёт результатов производили с помощью медицинского микроскопа (МИКМЕД-6, ЛОМО, Россия) (увеличение 100×) с люминисцентной насадкой. При микроскопировании учитывали яркое специфическое свечение зелёного цвета, которое свидетельствует о наличии вируса бешенства в клетках, и лунки с таким свечением отмечали как положительные (рисунок 1) [4, 5, 9, 12].

Рисунок 1 — Клетки лини ВНК-21 / С13, инфицированные вирусом бешенства штамма L. Pasteur. Окраска FITC-меченными моноклональными антителами, увеличение 100×

Расчёт титра вируса проводили с помощью формулы Спирмена-Карбера и выражали в десятичном логарифме 50 %-ой фокусформирующей инфицирующей дозы (lg FFD₅₀):

, где

x₀ — lg наибольшего разведения, в котором во всех лунках отмечается положительное свечение;

d — lg фактора разведения;

n_i — общее количество лунок, приходящихся на каждое разведение титрации вирусной суспензии;

r_i — количество положительных лунок в каждом разведении титрации вирусной суспензии [3, 9, 12].

Статистический анализ данных осуществляли с помощью стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel-2010 и Past. Вид распределения определяли с помощью W-критерия Шапиро-Уилка, достоверность различий между группами данных рассчитывали с использованием параметрического t-критерия Стьюдента (для групп с нормальным распределением данных). Расхождение считали статистически значимым при p ≤ 0, 05.

Результаты и обсуждение

В ходе проведенных исследований была проанализирована сохранность специфической инфекционной активности суспензии вируса бешенства штаммов L. Pasteur и CVS после хранения при температурах -20 и -80°С через 1 неделю, 1, 2, 3, 6 и 12 месяцев (срок наблюдения). В качестве контроля использовали данные по хранению вируса на протяжении 1-ой недели.

При анализе данных по хранению вирусной суспензии промышленного штамма L. Pasteur при -20ºС были получены следующие результаты. Активность вирусной суспензии через 1 неделю после замораживания при температуре -20°С составила 8,11±0,29 lg FFD₅₀ (n = 5) (рисунок 2). При сравнении данных по специфической активности вируса после 1-ого месяца хранения различия не были статистически значимыми (р ≥ 0, 05). После 2-х месяцев хранения при этой температуре активность вируса данного штамма начала снижаться (р ≤ 0, 05 ). Аналогичные данные были получены при сравнении активности вирусной суспензии после хранения на протяжении 3-х, 6-ти и 12-ти месяцев при температуре -20°С. Различия между данными по специфической активности после указанных сроков хранения были статистически значимы (р ≤ 0, 05). Через 12 месяцев хранения при температуре -20°С активность вируса штамма L. Pasteur составила 4, 75 ± 0, 19 lg FFD₅₀, что на 3, 36 lg FFD₅₀ меньше, чем данные контроля.

Рисунок 2 — Динамика изменения инфекционной активности вируса бешенства штамма L. Pasteur в ходе хранения при температурах -20°С и -80°С, * — статистически значимые различия между контролем и последующими сроками хранения; # — статистически значимые различия между каждым из сроков; $ — статистически значимые различия между показателями активности одного срока хранения, но при разных температурах

Специфическая инфекционная активность вирусной суспензии штамма L. Pasteur через 1 неделю после замораживания при температуре -80°С составила 8, 18 ± 0, 19 lg FFD₅₀ (n = 5) и не изменялась в течение 2-х месяцев (р ≥ 0, 05). Между 2-м и 3-м месяцами хранения при температуре -80°С инфекционная активность вируса начала достоверно снижаться (р ≤ 0, 05 ), как и на протяжении последующего хранения. Через 12 месяцев хранения при температуре -80°С активность вируса штамма L. Pasteur составила 5, 66 ± 0, 29 lg FFD₅₀, что на 2, 52 lg FFD₅₀ меньше, чем данные контроля. Со 2-ого по 12-й месяцы хранения при -80°С показатели инфекционной активности были достоверно выше (р ≤ 0, 05 ), по сравнению с образцами, хранившимися при -20°С.

Активность вирусной суспензии промышленного штамма CVS через 1 неделю после хранения при температуре -20°С составила 6, 78 ± 0, 19 lg FFD₅₀ (n = 5) (рисунок 3) и не изменялась до 2-х месяцев хранения (р ≥ 0, 05). Между 2-м и 3-м месяцами хранения при данной температуре произошло достоверное снижение (р ≤ 0, 05 ), активности, как и на протяжении последующего хранения. Через 12 месяцев хранения при температуре -20°С активность штамма CVS составила 4, 96 ± 0, 29 lg FFD₅₀, что на 1, 82 lg FFD₅₀ меньше, чем специфическая активность вируса при хранении в данном температурном режиме в течение недели.

Рисунок 3 — Динамика изменения инфекционной активности вируса бешенства штамма CVS в ходе хранения при температурах -20°С и -80°С, * — статистически значимые различия между контролем и последующими сроками хранения; # — статистически значимые различия между каждым из сроков; $ — статистически значимые различия между показателями активности одного срока хранения, но при разных температурах

Активность вирусной суспензии штамма CVS через 1 неделю после замораживания при температуре -80°С составила 6, 78 ± 0, 47 lg FFD₅₀ (n = 5) и не изменялась в течение 6-ти месяцев (р ≥ 0, 05). Достоверное снижение (р ≤ 0, 05) показателя активности вируса произошло между 6-м и 12-м месяцами хранения при данной температуре. После 12 месяцев хранения при температуре -80°С активность вирусной суспензии снизилась на 0,28 lg FFD₅₀ и составила 6, 5 ± 0, 19 lg FFD₅₀ по сравнению с данными контроля. С 3-ого по 12-й месяцы хранения при -80°С показатели инфекционной активности данного штамма были достоверно выше (р ≤ 0, 05 ), по сравнению с образцами, хранившимися при -20°С.

В результате проведенных исследований более низкие результаты сохранности обоих штаммов вируса были получены при хранении вирусной суспензии при температуре -20°С. Это может быть связано с тем, что эвтектическая температура солевых растворов, входящих в состав среды консервирования и ультраструктурных компонентов вирионов находится ниже -20°С, и вирионы подвергаются действию повреждающих факторов, связанных с кристаллизацией жидкой фазы, изменением рН и гиперконцентрацией электролитов [2].

Результаты исследования показали, что фиксированный штамм CVS более устойчив к хранению при низких температурах, чем штамм L. Pasteur. Предположительно, различия криоустойчивости изучавшихся промышленных штаммов вируса бешенства обусловлены особенностями строения их капсидов. Этот вопрос требует отдельного изучения.

Полученные результаты по сохранности вируса бешенства промышленных штаммов в суспензии не соответствуют требованиям производства, так как необходимо сохранение спицефической ативности вируса на протяжении более длительных сроков. Поэтому следует провести исследования по применению различных режимов замораживания вирусной суспензии и использованию различных криозащитных сред. Полученные данные, вероятно, смогут позволить хранить промышленные штаммы вируса бешенства при низких температурах более длительное время без потери их специфической активности.

Содержимое (Table of Contents)

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья определяет основные требования к биологическим методам испытаний препаратов интерферона с использованием клеточных культур и распространяется на субстанции и лекарственные формы интерферона человеческого всех типов природного и генно-инженерного происхождения.

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Биологические методы с использованием клеточных культур применяют для определения следующих показателей качества препаратов интерферона:

1. Специфическая активность
2. Подлинность

Методы определения специфической активности и подлинности основаны на способности интерферона подавлять цитопатическое действие индикаторного вируса в культуре клеток в сравнении со стандартным образцом интерферона (СО). Испытания проводят с использованием соответствующих линий клеток, чувствительных к определенному типу интерферона и к индикаторному вирусу.

Наиболее часто используют следующие комбинации клетка/вирус:

• линия клеток карциномы легкого человека А-549, линия клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, линия клеток карциномы гортани человека Нер-2с, линия клеток фибробластов мыши L-929/ вирус энцефаломиокардита мышей (EMCV);
• клетки бычьих почек Madin-Darby MDBK, линия клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, линия лимфоидных клеток человека Л-41, линия клеток карциномы легкого человека А-549, линия клеток фибробластов мыши L-929, линия клеток амниона человека WISH/ вирус везикулярного стоматита (VSV);
• клетки фибробластов человека/ вирус леса Семлики (SFV), вирус Синдбис (virus Sindbis) или иные.

В качестве СО может быть использован международный стандартный образец активности интерферона соответствующего типа или стандартный образец, откалиброванный в Международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандарту.

Испытания проводят в асептических условиях.

Подготовка к испытаниям

Требования к клеточным линиям (общие условия культивирования и пересева клеток, пассаж, на котором клетки проявляют оптимальную эффективность при проведении испытания, допустимый предел жизнеспособности клеток при пересевах и при взятии клеточной суспензии в испытание, процент сформированного монослоя) указывают в нормативной документации.

Пробоподготовку испытуемых образцов проводят в соответствии с указаниями, приведенными в нормативной документации. Для некоторых лекарственных форм препаратов интерферона (суппозитории, мази, гели и т.д.) при пробоподготовке необходимо экстрагирование активного вещества (интерферона) в раствор, с соблюдением следующих условий: используемые реагенты не должны оказывать токсического действия на культуру клеток в разведениях, необходимых для исследования; использование реагентов для экстрагирования должно быть обоснованным.

Суспензию индикаторного вируса готовят в соответствии с указаниями в нормативной документации на лекарственное средство, содержащее интерферон. Титр вируса должен быть не менее 10 5 ТЦД/мл.

К составу питательных сред, предназначенных для культур клеток животных и человека, предъявляют определенные требования. Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Возможно использование стандартных коммерческих сред для ведения культур клеток: Игла MEM, МЕМ, DMEM (двойная модификация среды Игла), среды 199 , среды RPMI и др. Для стимуляции роста, прикрепления и деления клеток обычно добавляют 5 – 10 % инактивированной сыворотки коров/крупного рогатого скота. В среду для разведений интерферона добавляют 2 – 5 % сыворотки. Для обеспечения бактериологической стерильности в питательные среды вводят антибиотики: пенициллин (натриевая соль), стрептомицин (хлоркальциевый комплекс) из расчета 100—200 ЕД каждого на 1 мл среды , микостатин (нистатин) из расчета 20—25 ЕД на 1 мл или гентамицин (конечная концентрация 10 мкг/мл). Содержание L-глютамина в питательной среде должно быть около 292 мг/л.

В качестве поддерживающей среды обычно используют питательную среду без сыворотки с добавлением антибиотиков и L-глютамина.

Постоянство рН среды является одним из главных условий культивирования. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Диапазоны рН и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток.

Оценить количество жизнеспособных клеток возможно при помощи красителей: метиленового синего, кристаллического фиолетового, тиазолинового синего (МТТ), Аламара голубого и других.

Раздел 1. Специфическая активность

Противовирусную активность интерферона определяют путем сравнения защитного действия испытуемого препарата (ИП) с аналогичным действием стандартного образца активности интерферона (СО).

Определение специфической активности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток, полученном при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂ в лунках 96-луночных плоскодонных культуральных планшетов.

Количество клеток, вносимых в каждую лунку планшета, должно быть достаточным для дальнейшего экспоненциального роста клеточной культуры и образования полноценного монослоя при вышеуказанных условиях культивирования в течение 24-48 ч.

Готовят серию разведений испытуемого препарата в среде для разведений интерферона с содержанием 2 – 5 % сыворотки (на 4 разведения выше и ниже предполагаемого титра активности). Параллельно готовят такие же разведения СО в среде для разведения интерферона. Рабочие разведения ИП и СО должны быть указаны в нормативной документации.

Из лунок планшетов с клеточным монослоем удаляют ростовую среду и вносят приготовленные разведения ИП и соответствующего СО, используя на каждое разведение не менее 4-х лунок с культурой клеток.

Возможно внесение ИП и СО в лунки планшета до внесения культуры клеток. В этом случае клеточный монослой будет формироваться с внесённым интерфероном.

Для контроля дозы индикаторного вируса оставляют 16 лунок с культурой клеток, а для контроля состояния монослоя клеток – 4 лунки. В эти 20 лунок вносят поддерживающую среду.

96-луночные планшеты с культурой клеток, разведениями ИП и СО инкубируют в течение 24-48 ч при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂. Затем в каждую лунку с ИП и соответствующим СО вносят вирусную суспензию, содержащую рассчитанную заранее дозу индикаторного вируса — 100 ТЦД₅₀. В лунки контроля клеток вносят такой же объем поддерживающей среды.

Определение дозы индикаторного вируса начинают с установления его активности.

Для определения активности вируса-индикатора готовят десятикратные разведения вируса в поддерживающей среде (от 10 -1 до 10 -8 ). Из лунок 96-луночного планшета с клеточным монослоем удаляют ростовую среду. После этого вносят в лунки планшета, используемые для определения дозы вируса, поддерживающую среду в объеме, равном объему испытуемого образца. Затем вносят приготовленные разведения индикаторного вируса (не менее, чем по 4 лунки на каждое разведение) в объеме, равном объему внесенной до этого поддерживающей среды. 96-луночный планшет с разведениями вируса инкубируют в течение 24-48 ч при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂. За титр (активность) вируса принимают величину, обратную разведению вируса, при котором клеточный монослой в 50 % лунок оказался полностью пораженным цитопатическим действием. Титр вируса выражают в тканевых цитопатических дозах – ТЦД₅₀/мл.

Активность вируса вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле:

Lg ED₅₀ – десятичный логарифм титра вируса;

D_max – десятичный логарифм разведения, ниже которого произошла 100 % гибель клеток (+);

d — десятичный логарифм интервала между разведениями (=1,0);

n — число лунок, приходящееся на каждое разведение вируса (=4);

р — число лунок, давших гибель (+) в разведении, ниже которого произошла 100 % гибель клеток, и последующих разведениях.

После установления активности вируса производят подсчёт дозы для последующего внесения в лунки с испытуемым препаратом (100 ТЦД₅₀).

Одновременно с внесением вируса-индикатора осуществляют контроль взятой дозы вируса на 16-ти лунках с культурой клеток (по 4 лунки на каждое разведение вируса).

Вносят вирус, начиная с разведения, соответствующего 100 ТЦД₅₀, и до разведения, соответствующего 0,1 ТЦД₅₀ с коэффициентом разведения равным 10.

Лунки с культурой клеток для оценки состояния монослоя клеток остаются интактными.

После внесения индикаторного вируса в дозе 100 ТЦД₅₀ 96-луночный планшет инкубируют в течение 24-48 ч при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂ до появления первых признаков цитопатических изменений в клеточном монослое с индикаторным вирусом в дозе 1 ТЦД₅₀. Монослой в лунках с 0,1 ТЦД₅₀ индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках.

Учёт активности интерферона осуществляют через 24-48 ч при выполнении следующих условий:

• доза внесённого вируса соответствует 100 ТЦД₅₀;
• в лунках с клетками и минимальными концентрациями ИП и СО, зараженными индикаторным вирусом, наблюдается практически полный цитопатический эффект (80 -100 %);
• в лунках с контролем клеток отсутствуют признаки дегенерации.

Учёт активности интерферона осуществляют визуально или инструментально.

производится микроскопически при 100-кратном увеличении через 24-48 ч после внесения индикаторного вируса. За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50 % лунок полностью защищена от цитопатического действия вируса.

Титр интерферона вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле:

D_max – двоичный логарифм разведения, ниже которого произошла 100 % защита (-);

d — двоичный логарифм интервала между разведениями (=1,0);

n — число лунок на каждую дозу (=4);

р — число лунок, давших защиту (-) в разведении, ниже которого произошла 100 % защита, и последующих разведениях.

Противовирусную активность интерферона (А_х) в исследуемом образце в МЕ вычисляют по формуле:

А_со — противовирусная активность СО интерферона в МЕ;

Инструментальный учет активности интерферона предполагает селективное окрашивание живых клеток, защищенных интерфероном от действия вируса, элюирование красителя, фотометрирование оптической плотности элюата и статистическую обработку результатов с помощью метода параллельных линий.

Как правило, результаты исследования снижения цитопатического эффекта соответствуют сигмоидальному графику доза-ответ: зависимость значений оптической плотности элюата ИП и СО от логарифма их разведения.

При расчете активности интерферона по сигмоидальным кривым ИП и СО должны быть соблюдены следующие условия:

• Измеренные оптические плотности для ИП и СО должны находиться в одном диапазоне оптических единиц, ограниченном значениями оптической плотности, измеренными в лунках контроля клеток и вируса;
• Полученные данные должны отвечать требованиям к параллельности, линейности и величине угла наклона кривых доза-ответ для СО и ИП, указанным в нормативной документации.

Используя линейный участок графика, рассчитывают титр ИП и СО, а затем рассчитывают активность интерферона по формуле:

А_со — противовирусная активность СО интерферона в МЕ;

а_х — титр ИП, то есть разведение ИП, в котором наблюдается 50 %-е поражение клеточного монослоя индикаторным вирусом;

а_со — титр СО, то есть разведение СО, в котором наблюдается 50 %-е поражение клеточного монослоя индикаторным вирусом.

Описание инструментального метода приводят в нормативной документации.

Раздел 2. Подлинность

Подлинность препаратов интерферона определяют путем нейтрализации противовирусной активности ИП моно- или поликлональными антителами против соответствующего типа интерферона, предусмотренными в нормативной документации на препарат. Реакцию нейтрализации противовирусной активности ИП проводят в культуре клеток, чувствительных к данному типу интерферона, в присутствии индикаторного вируса.

Определение подлинности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток.

Количество клеток, вносимых в каждую лунку 96-луночных культуральных планшетов, должно быть достаточным для дальнейшего экспоненциального роста клеточной культуры и образования полноценного монослоя в условиях культивирования при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂ в течение 24-48 ч.

Нейтрализующие антитела разводят средой для разведения до концентраций, указанных в нормативной документации.

Для приготовления нейтрализованной смеси подготовленные разведения антител объединяют в равных объемах с рабочими дозами ИП и СО. Полученную смесь инкубируют при температуре (37±1) о С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂ в течение 1 ч.

Из лунок 96-луночного планшета с монослоем культуры клеток удаляют ростовую среду, вносят в лунки планшета нейтрализованную смесь, не менее чем по 4 лунки на каждое разведение антител.

Нейтрализованную смесь допустимо вносить в лунки 96-луночного планшета как до внесения культуры клеток, так и после него.

Для оценки качества монослоя клеток в процессе постановки реакции нейтрализации (контроль) оставляют не менее 4 лунок, в которые не вносят нейтрализованную смесь. В этих лунках заменяют ростовую среду на поддерживающую.

Для контроля защитного действия интерферона также оставляют по 4 лунки на рабочие разведения СО и ИП без нейтрализующих антител.

Индикаторный вирус в дозе 100 ТЦД₅₀ вносят во все лунки 96-луночного планшета, кроме 4 лунок, предназначенных для контроля монослоя клеток.

После внесения индикаторного вируса в лунки с культурой клеток планшеты инкубируют при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО₂ до появления первых признаков цитопатических изменений в клетках с индикаторным вирусом в дозе 1 ТЦД₅₀ (обычно в течение 24-48 ч). Монослой в лунках с 0,1 ТЦД₅₀ индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках.

Учёт результатов осуществляют при выполнении следующих условий:

• доза внесённого вируса соответствует 100 ТЦД₅₀;
• отсутствуют признаки дегенерации в контроле клеток и в лунках с рабочими разведениями СО и ИП без нейтрализующих антител.

Нейтрализация активности испытуемого образца анти-интерфероновыми антителами в сравнении с СО в аналогичном разведении свидетельствует о том, что в испытуемом образце содержится интерферон соответствующего типа.

Подробное описание проведения реакции нейтрализации приводят в нормативной документации.