Методы культивирования вирусов в клеточных культурах в курином эмбрионе
1. Для культивирования вирусов используют эмбрионы в возрасте от 8 до 12 дней. Для выращивания эмбрионов оплодотворенные яйца помещают в термостат при 38° С, в котором находится посуда с водой для создания влажности. Два раза в день яйца вынимают для проветривания. Периодически яйца просматривают в овоскоп на жизнеспособность. Живые эмбрионы отличаются подвижностью, пульсацией сердца, хорошо контурируемыми сосудами. Перед заражением эмбрион осматривают в овоскоп и намечают границы воздушного мешка, а также расположение зародыша.
2. Для предотвращения инфицирования эмбриона посторонними микробами заражение проводят в асептических условиях с использованием стерильного инструмента (ставят в стаканчик со спиртом) в помещении, облученном бактерицидными лампами. Скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают 70 % спиртом, обжигают, смазывают 2 % йодом, вторично протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал обрабатывают антибиотиками для удаления бактериальной флоры.
3. Существует несколько способов заражения куриного эмбриона. Чаще всего материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости, на хорион-аллантоисную оболочку и в желточный мешок.
При заражении в аллантоисную полость в скорлупе над воздушной камерой проделывают небольшое отверстие с помощью ножниц или скальпеля. Туберкулиновым шприцем вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры. Прокол в скорлупе заливают расплавленным парафином.
При заражении на хорион-аллантоисную оболочку ножницами вскрывается скорлупа над воздушной камерой, пинцетом приподнимается подскорлуповая оболочка и шприцем на оболочку наносят 0,2-0,5 мл вируссодержащего материала при вертикальном положении эмбриона. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого замазывают парафином.
Заражение в амниотическую полость осуществляется длинной иглой через отверстие в воздушной камере. Иглу вводят в темной комнате под контролем овоскопа. При попадании иглы в полость эмбрион сдвигается. Заражение приводит к непосредственному контакту вируса с тканями эмбриона, поэтому в данном случае вирус размножается не только в полости, но и в тканях зародыша.
При заражении в желточный мешок вируссодержащий материал вводят иглой длиной 3-4 см, которой проделывают отверстие в воздушной камере. Иглу ведут к центру с небольшим отклонением книзу при горизонтальном положении эмбриона. Отверстие в скорлупе запаивают каплей парафина.
После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37°С.
4. Через 48-72 часа (срок максимального накопления вирусов) производят вскрытие зараженных эмбрионов. Перед вскрытием эмбрионы оставляют на ночь при 4° С. После обработки скорлупы спиртом и 2 % раствором йода ее рассекают ножницами немного выше очерченной карандашом границы воздушной камеры, наклоняя яйцо так, чтобы избежать попадания скорлупы в полость. Скорлупу отбрасывают, осторожно снимают ее оболочку и рассматривают хорион-аллантоисную оболочку. Затем пастеровской пипеткой прокалывают эту оболочку в участке, свободном от сосудов, и отсасывают аллантоисную жидкость. После этого извлекают хорион-аллантоисную оболочку, дважды промывают физиологическим раствором, помещают в чашку Петри и отмечают на черном фоне наличие специфических поражений.
5. О репродукции вируса судят по специфическому характеру поражений на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, по РГА – реакции гемагглютинации (склеивание эритроцитов).
Особенно четко очаги поражения на хорион-аллантоисной оболочке появляются в месте заражения в виде геморрагий, белесоватых очагов (вирус кори или гриппа вызывает образование оспин на оболочке).
По РГА устанавливают присутствие вируса в аллантоисной жидкости. РГА основана на способности некоторых вирусов адсорбироваться на поверхности эритроцитов и, изменяя их поверхность, вызывать склеивание. РГА ставят на стекле или в пробирках: готовят двукратное разведение вируссодержащего материала, добавляют 1 % взвесь отмытых куриных эритроцитов и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 30-40 минут после оседания эритроцитов в контрольной пробе, в которую вместо вируссодержащего материала добавляют аллантоисную жидкость незараженного эмбриона. При гемагглютинации образуется зернистый осадок с фестончатыми краями, а в контроле – осадок в виде диска с ровными краями. Наличие гемагглютинации в опытных пробирках при ее отсутствии в контроле указывает на присутствие вируса в исследуемой жидкости.
Культивирование вирусов человека и животных проводят с целью лабораторной диагностики вирусных инфекций, для изучения патогенеза и иммунитета при вирусных инфекциях, а также для получения диагностических и вакцинных препаратов. Вирусы культивируют на трех биологических моделях: в организме лабораторных животных, в развивающихся эмбрионах птиц (чаще на куриных эмбрионах) и культурах клеток (тканей).
Лабораторных животных (взрослых или новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами (подкожно, внутримышечно, интраназально, интрацеребрально и т. д.) в зависимости от тропизма вирусов. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях весьма ограничено из-за видовой невосприимчивости животных ко многим вирусам человека, контаминации животных посторонними микробами, а также по экономическим и этическим соображениям.
О репродукции вирусов в организме животных судят по развитию у них видимых клинических проявлений заболевания, па-томорфологическим изменениям органов и тканей, а также на основании реакции гемаг-глютинации (РГА) с суспензией из органов, содержащих вирусы. РГА основана на способности многих вирусов вызывать склеивание (агглютинацию) эритроцитов человека, птиц и млекопитающих в результате взаимодействия вирусных белков (гемагглютининов) с рецепторами эритроцитов.
Куриные эмбрионы (5—12-дневные) заражают путем введения исследуемого матери-
ала в различные полости и ткани зародыша. Таким образом можно культивировать вирусы гриппа, герпеса, натуральной оспы и др. Достоинствами модели являются: возможность накопления вирусов в больших количествах; отсутствие скрытых вирусных инфекций; доступность для любой лаборатории. О репродукции вирусов в куриных эмбрионах свидетельствуют: специфические поражения оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния); гибель эмбриона; положительная РГА с вируссодержащей жидкостью, полученной из полостей зараженного зародыша.
Методику культивирования вирусов в развивающихся эмбрионах птиц используют при промышленном выращивании вирусов. Однако многие вирусы не размножаются в эмбрионах птиц; почти неограниченные возможности для культивирования вирусов появились после открытия метода культур клеток.
Культуру клеток (тканей) наиболее часто применяют для культивирования вирусов. Метод культур клеток разработан в 50-х годах XX века Дж. Эндерсом и соавт., получившими за это открытие Нобелевскую премию. Клетки, полученные из различных органов итканей человека, животных, птиц и других биологических объектов, размножают вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде. Большое распространение получили культурыклеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих, по сравнению с нормальными клетками взрослого организма, более активной способностью к росту и размножению.
При выращивании культур клеток необходимо выполнение ряда условий:
1) соблюдение правил асептики: 2) использование лабораторной посуды из нейтрального стекла (пробирки, флаконы, матрасы) или специальных реакторов для получения биотехнологической продукции; 3) использование сложных по составу питательных сред (среда 199, Игла), содержащих минеральные соли, аминокислоты, витамины, глюкозу, сыворотку крови животных или человека, буферные растворы для поддержания стабильного рН; 4) добавление антибиотиков к питательной среде для подавления роста посторонних микробов;
5) соблюдение оптимальной температуры (36— 38,5 °С) роста клеток.
В зависимости от техники приготовления различают однослойные, суспензионные и органные культуры клеток:
Однослойные культуры клеток — клетки способны прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла лабораторной посуды в виде монослоя. Они получили наибольшее применение в вирусологии.
□ Суспензионные культуры клеток — клетки размножаются во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании с помощью магнитной мешалки или во вращающемся барабане. Их используют для получения большого количества клеток, например, при промышленном получении вирусных вакцин.
□ Органные культуры — цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применяются ограниченно).
Культуры клеток в процессе их культивирования способны проходить десятки генераций. По числу жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяют на: 1) первичные, или первично-трипсинизированные; 2) перевиваемые, или стабильные; 3) полуперевиваемые.
Первичные культуры способны размножаться только в первых генерациях, т. е. выдерживают не более 5— 10 пассажей после выделения из тканей. В основе получения первичных культур лежит обработка кусочков тканей (эмбриональных, опухолевых или нормальных) протеолитическими ферментами, например трипсином, который разрушает межклеточные связи в тканях и органах с образованием изолированных клеток.
Перевиваемые, или стабильные, культуры клеток способны размножаться в лабораторных условиях неопределенно длительный срок (десятки лет), т. е. выдерживают многочисленные пассажи. Их получают преимущественно из опухолевых или эмбриональных тканей, обладающих большой потенцией роста. Перевиваемые культуры клеток имеют преимущества перед первичными культурами. К ним относятся: продолжительность их культивирования, высокая скорость размно-
жения опухолевых и эмбриональных клеток, меньшая трудоемкость, способность культур сохранять свои свойства в замороженном состоянии в течение многих лет, возможность использования международных линий культур во многих лабораториях мира. Однако злокачественный характер клеток и соматические мутации, претерпеваемые нормальными клетками в гпоцессе многочисленных генераций, ограничивают использование этого вида культур, в частности невозможно их применение в производстве вирусных вакцин.
Полуперевиваемые культуры клеток имеют ограниченную продолжительность жизни и выдерживают 40—50 пассажей. Их обычно получают из диплоидных клеток эмбриона человека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, характерный для соматических клеток исходной ткани, и не претерпевают злокачественной трансформации. Поэтому полуперевиваемые культуры клеток могут быть использованы как в диагностике, так и в производстве вакцин.
Внедрение в вирусологию метода культур клеток позволило выделить и идентифицировать многочисленные ранее неизвестные вирусы, так как почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие чувствительные клетки, в которых он способен репродуцироваться. Метод дал возможность изучать взаимодействие вирусов с клеткой на молекулярном уровне, получать высококачественные вакцинные и диагностические препараты, проводить вирусологические исследования в стандартных условиях.
ЦПД — патологические изменения морфологии клеток, вплоть до их гибели, возникающие в результате репродукции вирусов, и наблюдаемые под микроскопом (рис. 3.11). В зависимости от особенностей репродуцирующихся вирусов ЦПД может отличаться. В одних случаях быстро вакуолизируется ци-
топлазма, разрушаются митохондрии, округляются и гибнут клетки, а в других — формируются гигантские многоядерные клетки (так называемые симпласты) или наблюдается явление клеточной пролиферации, которое в итоге заканчивается деструкцией клеток. Таким образом, характер ЦПД позволяет использовать этот феномен не только для индикации вирусов, но и для их ориентировочной идентификации в культуре клеток.
Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по внутриклеточным вклю-
чениям, которые образуются в ядре или цитоплазме зараженных клеток (рис. 3.12). Часто включения представляют собой скопления вирусных частиц или отдельных компонентов вирусов, иногда могут содержать клеточный материал. Выявляют включения с помощью светового или люминесцентного микроскопа после окрашивания зараженных клеток соответственно анилиновыми красителями или флюорохромами. Включения могут отличаться по величине (от 0,2 до 25 мкм), форме (округлые или неправильные) и численности (одиночные и множественные). Характерные цитоплазматические включения формируются в клетках, инфицированных вирусом натуральной оспы (тельца Гварниери), бешенства (тельца Бабеша—Негри), а внутриядерные включения — при заражении аденовирусами или вирусами герпеса.
В основе реакции гемадсорбции лежит способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Целый ряд вирусов (гриппа, парагриппа и др.) обладают гемадсорбирующими свойствами, что позволяет использовать реакцию гемадсорбции для индикации этих вирусов даже при отсутствии выраженного ЦПД в культуре клеток. Механизмы реакции гемадсорбции и гемагглютинации сходны. Поэтому для обнаружения репродукции некоторых вирусов в культуре клеток можно использовать
реакцию гемагглютинации с культуральной жидкостью, т. е. с питательной средой, содержащей размножившиеся вирусы.
Дата добавления: 2016-02-04 ; просмотров: 3590 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
ВНИМАНИЕ! САЙТ ЛЕКЦИИ.ОРГ проводит недельный опрос. ПРИМИТЕ УЧАСТИЕ. ВСЕГО 1 МИНУТА.
С тех пор как обнаружили, что вирусы гриппа размножаются в куриных эмбрионах, этот метод стал широко применяться в вирусологии, так как прост в применении и не является дорогим.
Используют 7-9 дневные куриные эмбрионы (полный цикл развития 21 день).
Перед заражением поверхность обрабатывают спиртом, раствором йода, в скорлупе делают отверстие и заражают стерильным шприцем.
Способы заражения: в амниотическую полость, в аллантоисную полость или в желточный мешок. Вирусы размножаются на соответствующих оболочках, накапливаются в полостной жидкости, которую затем и можно собрать для дальнейшего исследования.
Эмбрионы культивируют при 37 град. 3 суток, затем снова обрабатывают скорлупу, вскрывают стерильными инструментами эмбрион и собирают вируссодержащую жидкость. Все работы по заражению и вскрытию производят в боксе.
Культивирование на культурах клеток.
Культуры клеток стали применять в вирусологии в последние десятилетия, это дало возможность культивировать и изучать гораздо более широкий спектр вирусов, так как не все человеческие вирусы возможно выделить на животных или на эмбрионах. Таким образом, современная вирусология пользуется клеточными культурами, которых получено в настоящее время огромное множество.
Разновидности клеточных культур
а) первичные -получают из эмбриональной ткани, путем ее измельчения, обработки трипсином для дезагрегации (разъединения) клеток и дальнейшего культивирования
in vitroв специальной культуральной жидкости.
б) перевиваемые– получают из опухолевой ткани, они отличаются тем, что их можно культивировать неограниченно долго, меняя только культуральную среду и посуду.
В процессе культвирования на стекле получается монослой: то есть один слой клеток.
Теперь можно заразить эти клетки исследуемым материалом с предполагаемым вирусом, либо уже имеющимися вирусами. Посуду с клетками, зараженными и незараженными, культивируют в термостате при 37 градусах.
Процесс накопления вирионов в клеточной культуре длится примерно 48 – 72 часа.
Подбирая подходящие культуры, можно культивировать практически все человеческие вирусы.
Следующая стадия изучения – индикация и идентификация вирусов.
Методы индикации.
Индикация – это обнаружение вирусов непосредственно в исследуемом материале или в культуральной жидкости или в зараженных клетках.
I.Если вирионы находятся в жидкости, то обнаружить их можно с помощью реакции гемагглютинации.
Суть реакции: некоторые виды вирусов способны спонтанно склеивать (то есть вызывать гемагглютинацию) каких – либо эритроцитов. Например, вирионы гриппа склеивают эритроциты кур, некоторые аденовирусы – эритроциты крысы и т.д.
Таким образом, с помощью взвеси эритроцитов в физиологическом растворе можно обнаружить вирусы в вируссодержащей жидкости.
II.Если вирусы размножаются в клеточной культуре, но являются гемагглютинирующими, то можно обнаружить их с помощью реакции гемадсорбции: на культуру наносят взвесь эритроцитов, инкубируют, сливают – если культура заражена, то эритроциты прилипнут прямо к зараженным клеткам – это видно в световой микроскоп.
III.Другие эффекты:
а) вирусы вызывают разрушение монослоя – это называется цитопатогенное действие вируса - ЦПД.
б) вирусы вызывают морфологические изменения клеток: внутриклеточные или внутриядерные включения, образование синцития, симпластов (то есть слияние нескольких клеток в одно образование из-за повреждения клеточных мембран).
Разные варианты ЦПД могут быть характерными для разных вирусов, что дает возможность их дифференцировать.
Таким образом, тем или иным путем можно констатировать наличие размножающихся вирусов либо в культуральной жидкости, либо в культуре клеток.
Бактериофаги - это вирусы бактерий. Основная характеристика: Большинство – ДНК-содержащие. Разнообразны по форме. Каждому виду бактерий соответствует свой бактериофаг (специфичность).
Читайте также:
|
