Нуклеозиды и их действие на вирусы

К сожалению, долгое время лекарств для борьбы с вирусами не было. Первые средства для лечения вирусных инфекций появились только в 50-х годах двадцатого века, и с тех пор не прекращается поиск новых противовирусных препаратов, эффективных и безопасных. Так, в 1957 году в Лондоне был открыт интерферон — некое вещество, которое помогало мышам не поддаваться заражению вирусами. Открытие положило начало изучению противовирусного иммунитета, и эти знания активно применяются в борьбе с вирусами.

Противовирусные препараты — эффективное оружие против ОРВИ и гриппа

Все современные противовирусные препараты можно условно разделить на две группы: средства, которые действуют на сам вирус, и препараты, которые активизируют или имитируют собственную иммунную защиту организма.

Для противовирусных средств механизм действия связан со строением и функционированием вирусной частицы. Внутренняя часть вируса обычно содержит ДНК или РНК — нуклеиновые кислоты, в которых хранится информация о вирусе. Они окружены белковой оболочкой — капсидом, а внутри и снаружи капсида могут быть прикреплены различные ферменты или сигнальные молекулы.

Противовирусные препараты прямого действия могут воздействовать на причину инфекции несколькими путями:

• Аналоги нуклеозидов, например ацикловир или ламивудин, мешают вирусу размножаться внутри клетки. Эти средства похожи на компоненты нуклеиновых кислот и встраиваются в них при попытке вируса воспроизвести себе подобных. В результате размножение вируса подавляется.
• Блокаторы активных белков вируса. Вирусы нуждаются в ферментах на всех этапах своей жизни: и при проникновении в клетку, и при размножении. При их блокировке вирус либо не способен пройти сквозь клеточную мембрану, либо подавляется репродукция вируса. Примером могут быть блокаторы протеазы или блокаторы нейраминидазы.

Организм человека способен бороться с вирусной инфекцией самостоятельно, для этого у него есть два вида защиты. Неспецифическая защита, которой все равно, с каким вирусом бороться, представлена в виде активных веществ — интерферонов. Специфический иммунитет, наоборот, направлен на конкретную инфекцию, однако для его работы организм должен сначала встретиться с возбудителем. Именно специфический иммунитет лежит в основе вакцин, например от полиомиелита или краснухи.

Противовирусные препараты при простуде можно условно разделить на 5 групп. Две из них влияют на инфекцию с помощью противовирусного иммунитета, остальные блокируют ферменты на поверхности вируса — гемагглютинин, нейраминидазу и М2-белок. Рассмотрим каждую из этих групп подробнее.

Блокаторы М2-каналов

М2-ингибиторы являются одними из первых препаратов, специфичных против вируса гриппа. Сюда относятся производные адамантана, амантадин и римантадин, открытые в 60-х годах ХХ века. Это трициклические амины, которые подавляют размножение вируса гриппа А. Они действуют на мембранный белок М2, который расположен на поверхности вирусного капсида и необходим для высвобождения вируса. К сожалению, в настоящее время все больше вирусов гриппа имеют устойчивость к этой группе препаратов из-за мутаций М2-протеина, в связи с чем FDA не рекомендует их к применению [2] .

Ингибиторы нейраминидазы

Нейраминидаза — это фермент на поверхности вируса гриппа, который играет важную роль при проникновении в клетку, а также при высвобождении новых вирусных частиц. Блокирующие этот фермент препараты, осельтамивир и занамивир, применяются при лечении гриппа А и В. Хотя устойчивость вирусов к этим средствам возможна, она встречается реже, чем в группе блокаторов М2-белка.

Ингибиторы гемагглютинина

Этот препарат был зарегистрирован в 1974 году и прошел не только проверку временем, но и многочисленные клинические испытания. С 2011 года препарат участвует в масштабном исследовании АРБИТР на базе 15 медицинских центров [3] . Предварительные результаты показывают уменьшение тяжести заболевания на фоне приема умифеновира, уменьшение выраженности катарального и интоксикационного синдромов. Отмечена хорошая переносимость препарата пациентами.

Лейкоцитарные интерфероны

Представлены в основном препаратами на основе рекомбинантного человеческого интерферона альфа. Интерфероны — это естественный механизм подавления вирусной инфекции в организме, даже если организм человека впервые встречается с этим вирусом. Поэтому назначение интерферона обычно необходимо при тех вирусных инфекциях, для которых не разработано специфических противовирусных препаратов. Эти препараты получают из лейкоцитов донорской крови или с помощью бактериальных культур; выпускаются в форме капель, геля, суппозиториев.

Индукторы интерферона

Это средства, которые стимулируют выработку интерферона в организме. Таким образом усиливается противовирусный потенциал собственного иммунитета человека. К этой группе можно отнести тилорон, кагоцел и другие. Нередко индукторы интерферона используют в комбинации со специфическими противовирусными препаратами.

Каждая группа препаратов имеет свои плюсы и минусы, и выбирать лучшие противовирусные препараты нужно с учетом клинической ситуации. Для примера можно сравнить ряд популярных противовирусных препаратов для взрослых и детей.

Включен в группу противовирусных средств. Действующее вещество — умифеновир — отвечает за специфическое подавление вирусов гриппа А и В, а также действует и на другие вирусы-возбудители ОРВИ: коронавирус, риновирус, аденовирус, респираторно-синцитиальный вирус и вирус парагриппа. Благодаря индукции интерферона и стимуляции клеточных реакций иммунитета препарат увеличивает сопротивляемость организма к вирусным инфекциям.

При лечении гриппа и ОРВИ у взрослых эффект препарата особенно выражен в начальном остром периоде болезни и проявляется уменьшением сроков и тяжести проявлений заболевания, более скорым выведением вируса.

• профилактика и лечение гриппа А и В, а также других ОРВИ у детей и взрослых;
• комплексная терапия рецидивирующего герпеса;
• профилактика инфекционных осложнений после операции;
• комплексное лечение острых кишечных инфекций, вызванных ротавирусом, у детей старше 6 лет.

Препарат противопоказан при гиперчувствительности к компонентам, в первом триместре беременности и в период грудного вскармливания. Ограничения по возрасту различаются в зависимости от формы препарата. Во втором и третьем периоде беременности применять средство необходимо с осторожностью, по согласованию с врачом. Побочные эффекты при приеме встречаются редко, возможны аллергические реакции.

В случае эпидемии ОРВИ, в том числе гриппа, для неспецифической профилактики препарат применяют дважды в неделю в разовой дозе в течение 3 недель.

Для лечения гриппа и других ОРВИ прием препарата желательно начать с момента первых симптомов заболевания, не позднее 3 дней от начала болезни. Курс приема составляет 5 дней, в разовой дозе 4 раза в сутки (каждые 6 часов).

Стоимость* курса лечения гриппа для взрослого составит 926 рублей (2 упаковки капсул по 200 мг).

Таблетки, содержащие 50 мг умифеновира, обойдутся в 156 рублей за упаковку из 10 таблеток или 268 рублей за 20 таблеток. Капсулы 100 мг в среднем будут стоить от 235 рублей (10 штук) до 861 рубля (40 штук). Усиленная формула по 200 мг обойдется в 463 рубля за 10 капсул.

• профилактика и лечение гриппа и других ОРВИ;
• лечение вирусных гепатитов А, В и С;
• лечение инфекций, вызванных вирусами герпеса и цитомегаловирусом;
• комплексное лечение аллергических и вирусных энцефаломиелитов, урогенитального и респираторного хламидиоза, а также туберкулеза легких.

Для лечения взрослых (старше 18 лет) при гриппе и других ОРВИ назначают по 125 мг тилорона в сутки первые 2 дня лечения, затем по 125 мг через день. На курс нужно 6 таблеток по 125 мг.

Для курса профилактики гриппа и других ОРВИ тоже необходимо 750 мг препарата: принимать по 1 таблетке (125 мг) раз в неделю в течение 6 недель.

Стоимость* курса лечения гриппа для взрослого человека составит 583 рубля (упаковка из 6 капсул по 125 мг). 10 капсул в той же дозировке обойдутся в 926 рублей, а 10 капсул по 60 мг стоят 552 рубля.

Относится к группе противовирусных средств. Действующее вещество — римантадин. Средство активно в отношении вируса гриппа А и препятствует ранней стадии репликации вируса в клетке.

Препарат имеет противопоказания: заболевания печени и почек, тиреотоксикоз, беременность и кормление грудью, а также гиперчувствительность к препарату. Отмечаются побочные действия, такие как расстройства со стороны пищеварительной системы и ЦНС, аллергические реакции. Возможна лекарственная устойчивость вируса к римантадину.

На курс лечения гриппа для взрослого потребуется одна упаковка таблеток (20 штук) в дозировке 50 мг. Стоимость* составляет до 216 рублей за упаковку в зависимости от производителя.

Осельтамивир показан для лечения гриппа у взрослых и детей в возрасте старше 1 года. Он используется для профилактики гриппа у детей старше 1 года, а также у взрослых и подростков в возрасте старше 12 лет, которые относятся к группам повышенного риска.

• гиперчувствительности к осельтамивиру или любому компоненту препарата;
• тяжелой печеночной недостаточности;
• почечной недостаточности в терминальной стадии;
• возрасте до 1 года.

Во время беременности и грудного вскармливания препарат рекомендовано применять с осторожностью, так как не было проведено контролируемых исследований в группе беременных женщин.

Принимать средство можно во время еды или независимо от приема пищи. Начинать лечение рекомендуется не позже 2 суток от начала развития симптомов. Дозировка зависит от возраста человека, а для детей важен также и вес. При поражении почек может потребоваться индивидуальное назначение дозы препарата.

В случае профилактики после контакта с больным для взрослых и детей с 8 лет назначают по 75 мг осельтамивира 1 раз в день, курс — не менее 10 дней. Во время сезонной эпидемии гриппа профилактическая дозировка препарата составляет 75 мг 1 раз в сутки в течение 6 недель.

Взрослому человеку для лечения гриппа потребуется одна упаковка из 10 капсул на курс, ее стоимость* составляет 1153 рубля.

Таким образом, на сегодняшний день медицина предлагает немалый выбор средств для борьбы с вирусами. Можно подобрать подходящий сильный противовирусный препарат почти для любого возраста и бюджета. Однако при выборе необходимо учитывать, на что направлено действие препарата, насколько он безопасен и доказана ли его эффективность. Отдавая предпочтение безопасности препарата и тщательно следуя инструкции, можно ускорить победу над вирусом и уберечь себя от осложнений.

*Информация о ценах не является публичной офертой.

Своевременное лечение простуды противовирусными препаратами может помочь ускорить выздоровление, снизить тяжесть симптомов, а главное — сократить вероятность развития осложнений.

Справиться с простудой и гриппом можно при помощи комплексной терапии, назначенной врачом.

Противовирусный препарат АРБИДОЛ ® может быть использован в комплексной терапии целого ряда вирусных заболеваний, в том числе гриппа и других ОРВИ.

Запущенный грипп может спровоцировать развитие тяжелых осложнений, таких как воспаление околоносовых пазух и т.д.

В период эпидемии гриппа и других ОРВИ противовирусные препараты способны помочь повысить сопротивляемость организма к инфекциям.

Профилактика гриппа и других ОРВИ подразумевает целый комплекс мероприятий, в который входит в том числе вакцинация, прием иммуномодулирующих и противовирусных препаратов и прочее.

Мно­гие, к со­жа­ле­нию, при прос­ту­де или грип­пе не об­ра­ща­ют­ся к вра­чу, на­зна­чая се­бе те ле­кар­ст­ва, что ре­ко­мен­до­вал спе­ци­а­лист во вре­мя про­ш­лой или по­зап­ро­ш­лой бо­лез­ни. Од­на­ко сто­ит пом­нить, что за­бо­ле­ва­ние мо­жет быть вы­зва­но раз­ны­ми при­чи­на­ми и иметь раз­ное те­че­ние, а не­нуж­ные в дан­ный мо­мент ле­кар­ст­ва не толь­ко не по­мо­гут, но и усу­гу­бят со­сто­я­ние. Не сто­ит за­ни­мать­ся са­мо­ле­че­ни­ем, об­ра­щай­тесь в по­лик­ли­ни­ку.

В настоящее время применяются следующие группы антивирусных химиопрепаратов:

1) аномальные нуклеозиды;

2) производные адамантанамина гидрохлорида;

Перспективными являются новые направ­ления химиотерапии вирусных инфекций, из которых рассматриваются два: повреждение вирусных генов и ингибиция протеолитической активности вирусов.

Аномальные нуклеозиды. Транскрипция генома ДНК-содержащих вирусов (кроме вирусов оспы) и его репли­кация осуществляются преимущественно клеточными ДНК- и РНК-полимеразами. Тем не менее, каждый ДНК-содержащий вирус индуцирует в зараженной клетке синтез собственных ферментов, обеспечивающих транс­крипцию и репликацию вирусспецифической ДНК. Инду­цированные вирусом ферменты в ряде случаев отличаются от клеточных ферментов по своим свойствам, например по стабильности к температуре, рН, концентрации ионов, по субстрат-специфичности. Поэтому в химиотерапии ин­фекций, вызываемых ДНК-содержащими вирусами, нашли применение аномальные предшественники нуклеинового обмена — производные нуклеотидов и нуклеозидов. Наи­более активными соединениями оказались аномальные нуклеозиды, которые находят все более широкое приме­нение в антивирусной терапии. Получение их основано на химической модификации природных веществ с целью создания биологически активных соединений направлен­ного действия.

Антивирусный эффект аномальных нуклеозидов в боль­шинстве случаев обусловлен внутриклеточным фосфорилированием неактивного нуклеозида до активного нуклеотида. Как аналоги нуклеотидов, они конкурируют с природными нуклеотидами за ферменты, участвующие в синтезе нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Аномальные нуклеозиды ингибируют функции вирусных полимераз, а при включении во вновь синтезируемые нуклеиновые кисло­ты делают их нефункциональными. Естественно, что это происходит не только с вирусной, но и с клеточными ДНК и РНК. Поэтому основной проблемой, ограничиваю­щей применение аномальных нуклеозидов, является от­сутствие селективности их действия и нарушение клеточ­ного метаболизма.

Хотя аномальные нуклеозиды обладают широким спект­ром действия, они мало эффективны при вирусных инфек­циях. Исключением являются заболевания, вызываемые вирусами герпеса и оспы, синтез ДНКкоторых чувствите­лен к дозам аномальных нуклеозидов, которые удовлетво­рительно переносятся организмом. Поэтому аномальные нуклеозиды нашли широкое применение в клинике при лечении кожного герпеса, герпеса глаз, половых органов, а также ветряной оспы и опоясывающего герпеса, цитомегалии и инфекций, вызываемых вирусами оспы.

Антивирусное действие аномальных нуклеозидов может значительно усилиться при их комбинированном приме­нении в том случае, если они имеют разные точки прило­жения.

Пиримидиновые аналоги. Идоксуридин (5-йод-2-дезоксиуридин). Препарат содержит атом йода у 5-го атома пиримидинового кольца и являет­ся аналогом тимидина — нуклеозида, вовлеченного в синтез ДНК. Его антивирусный эффект обусловлен включением нуклеотида, образующегося при внутриклеточном фосфорилировании нуклеозида, во вновь синтезированную вирус­ную ДНК. Препарат активен против ДНК-содержащих вирусов — вирусов простого герпеса, цитомегалии, оспо-вакцины, псевдобешенства. Селективность препарата по отношению к вирусной ДНК обусловлена большей скоро­стью синтеза ее по сравнению с клеточной в процессе репродукции вируса. Однако препарат имеет низкий тера­певтический индекс и в основном используется для мест­ного применения. Широкое применение препарат получил при герпетическом кератите, при котором он назначается в виде 0,1% раствора и 0,5% мази.

Пуриновые аналоги. Аденин-арабинозид (ара-А, или видарабид). Нуклеозид выделен из карибской губки в 60-х годах и применен вначале как противоопухолевый препарат. Позже была выявлена его антивирусная активность против вирусов герпеса и оспы. Получение нуклеозида ферментативным путем значитель­но снизило его стоимость. Ара-А является аналогом дезоксирибонуклеозида аденина. Терапевтическая эффектив­ность его такая же, как у идоксуридина, но препарат обладает меньшей токсичностью. Применяется для лече­ния герпетических кератитов, увеитов, ветряной оспы и опоясывающего герпеса. Его способность к проникнове­нию через гематоэнцефалический барьер позволил приме­нять препарат при герпетических энцефалитах. Для мест­ного применения используется 3% мазь, для внутривенно­го введения — раствор, содержащий не более 0,7 мг/мл. В связи с относительно высокой токсичностью оптималь­ной дозой является 10 мг/кг в день, вводимая в течение 12-часового периода.

Другими пуриновыми арабинозидами, применяемыми для лечения герпетических инфекций, является 5 1 -моно­фосфат аденин-арабинозида (ара-АМФ) и 5 1 -монофосфат гипоксантин-арабинозида (ара-НхМР).

Ацикловир (ациклогуанозин). Этот ано­мальный нуклеозид, 9- (2-гидроксиэтоксиметил) -гуанин, является представителем нового класса соединений, в которых сахар в аномальном нуклеозиде заменен алифати­ческой цепью. Ацикловир обладает селективной актив­ностью против вируса простого герпеса, но не обладает антивирусным действием в отношении вируса оспы.

Препарат имеет меньшую токсичность по сравнению с дру­гими аномальными нуклеозидами и подавляет рост клеток в концентрации в 3000 раз большей, чем антивирусная концентрация. Препарат активен при герпетическом кера­тите и энцефалите, кожном и половом герпесах, менее активен при инфекциях, вызванных вирусами ветряной оспы, Эпстайна — Барра, цитомегалии. Его антивирусная активность обусловлена внутриклеточным фосфорилирова-нием до 5'-монофосфата вирусспецифической тимидинки-назой в зараженных вирусом герпеса клетках, а затем в 5'-трифосфат, который специфически ингибирует вирус­ную ДНК-полимеразу. Фосфорилирование пре­парата в незараженных клетках происходит лишь в не­значительной степени и этим объясняется его селективное действие на них. Благодаря низкой токсичности и высоко­избирательному действию на синтез вирусспецифической ДНК, ацикловир является перспективным антивирусным препаратом. Он применяется местно в виде 5%мази, внутривенно в дозе 5 мг/кг в день.

Рибавирин(виразол). В 60-х годах из стрептомицетов были выделены антибиотики шоудомицин и пиразомицин, представляющие собой нуклеозиды со значи­тельной антивирусной активностью. Широкий спектр их действия подсказал синтез структурных аналогов, из которых наиболее активным антивирусным препаратом оказался рибавирин (виразол), представляющий собой 1-Р-Б-рибофуранозил-1, 2, 4-триазол-З-карбоксамид. Его антивирусный эффект основан на включении препарата в вирусспецифические РНК и ДНК и действии на вирус­ные РНК- и ДНК-полимеразы. Рибавирин имеет широкий спектр действия, обладая эффективностью против ДНК- и РНК-содержащих вирусов — вирусов гриппа, парагрип­па, кори, Коксаки, полиомиелита, риновируса, Синдбис, везикулярного стоматита, герпеса, осповакцины и др. Пре­парат применяется перорально в дозах 400—600 мг в день. Перспективным является аэрозольный способ введения его при респираторных инфекциях.

Противоопухолевые препараты. В отношении ретровирусов поиск химиотерапевтических препаратов был нап­равлен на выявление специфических ингибиторов обратной транскриптазы (ревертазы). Имеется ряд таких соеди­нений, которые в зависимости от принципа их действия могут быть разделены на несколько групп. Наибольший интерес представляют препараты, являющиеся аналогами матриц для вирусных обратных транскриптаз. Принцип их химиотерапевтического действия основан на нарушении функционирования обратных транскриптаз при химиче­ской модификации матрицы. Одним из активных соедине­ний является аналог полицитидиловой кислоты – MRC - содержащий 5-меркаптозамещенные основания цитозина. Препарат применяется при лечении лейкозов у детей. Действие ингибиторов обратных транскриптаз направлено на блокирование интеграции генома ретровирусов с кле­точной ДНК. После того, как интеграция произошла, и при эндогенных ретровирусах эти препараты неэффектив­ны.

В настоящее время противогриппозные препараты ряда адамантана являются наиболее эффективными сред­ствами химиотерапии и химиопрофилактики гриппа. Ремантадин прошел широкие клинические испытания и используется для лечения и профилактики гриппа. Лечение успешно при использовании препарата на ранних стадиях инфек­ции. При пероральном применении препараты достигают максимального уровня в крови через 4 ч, около 90% их выводится в неизмененном виде с мочой. Рекомендуемая доза 150—300 мг в сутки нетоксична для человека. Лишь при дозах, в 12 раз превышающих этот уровень, препараты проявляют эмбриотоксическое и тератогенное действие. Возможные осложнения при длительном применении встречаются в исключительно редких случаях и связаны с проникновением препарата в ЦНС, что сопровожда­ется явлениями депрессии, головокружением, беспокой­ством.

Применение амантадина и ремантадина — синтети­ческих нетоксичных противогриппозных препаратов высо­коизбирательного действия является выдающимся дости­жением химиотерапии и химиопрофилактики. Однако, не исключено, что использование этих препаратов в будущем может быть ограничено в связи с появлением устойчивых штаммов вируса гриппа.

Тиосемикарбазоны. Метисазон (Marboran) — син­тетический антивирусный препарат, активный против ви­русов оспы. Антивирусная активность обусловлена бен­зольным кольцом и боковой цепью, содержащей серу. Механизм действия препарата заключается в подавлении трансляции поздних вирусных иРНК и сборки вирусной частицы.

Антивирусная активность препарата известна с 1950 г., но впервые широкое испытание его профилактического действия было осуществлено во время вспышки натураль­ной оспы в Мадрасе в 1963 г., где метизасон показал высокую эффективность. Препарат применяется для про­филактики и лечения оспы и осложнений при вакцинации.

Метисазон плохо растворим и применяется перорально в виде суспензии в дозе 200 мг/кг и затем по 500 мг/кг массы тела дробными дозами в течение 48 ч. Максималь­ный уровень в крови достигается через 6 ч после введения. Осложнением при применении препарата является тошно­та и рвота, которые появляются через 4—6 ч после вве­дения.

Перспективен в качестве противооспенного средства тиосемикарбазон-5-циантиофенальдегид.

Приобретение устойчивости к химиопрепаратам. Об­стоятельством, осложняющим применение химиопрепаратов, является появление вариантов вирусов, устойчивых к ингибиторам: вирусов оспы к метисазону; вирусов гриппа к амантадину и ремантадину и т. д. Снижение вероятности появления устойчивых мутантов может создать комбини­рованное применение антивирусных препаратов с разным механизмом действия на репродукцию вируса, которое усиливает антивирусное действие каждого из них.

НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ХИМИОТЕРАПИИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Ингибирование протеолитической активации. В настоя­щее время накопились данные о том, что для возник­новения инфекционного процесса необходима протеолити-ческая активация вируса, т. е. нарезание одного или нескольких его белков. Сущность этого феномена заключа­ется в том, что многие вирусные белки приобретают функ­циональную активность лишь после протеолитического нарезания. У пикорна-, тога-, ретро- и других вирусов этот процесс лежит в основе формирования всех структурных вирусных белков, которые образуются в результате наре­зания белка-предшественника. У ортомиксо-, парамиксо-, рео-, бунья-, аренавирусов и др. протеолитическому нарезанию подвергаются в первую очередь гликопротеиды. Нарезание проходит по типу точечного (ограниченного) протеолиза путем разрезания белка на два фрагмента и осуществляется либо только клеточными, либо клеточными и вирусспецифическими протеазами. Для правильного на­резания белка, обеспечивающего его активацию, необходимы протеазы определенной специфичности. Универсаль­ность феномена протеолитической активации и уязвимость его для действия ингибиторов протеолитической актива­ции позволяет рассматривать его как удобную мишень для химиотерапии ряда вирусных инфекций.

Ингибиторами протеаз являются официнальные пре­параты гордокс (Венгрия), контрикал (Германия) и аминокапроновая кислота, которые применяются при панкреатитах и геморрагических состояниях. Клинические испытания отечественного препарата аминокапроновой кислоты при гриппе у детей показали высокую антивирусную актив­ность препарата и его лечебную эффективность. Наиболее эффективным способом применения является ингаляцион­ный, лечебный эффект препарата наиболее значителен на ранних этапах инфекции.

Помимо гриппа, антивирусное действие ингибиторов протеолиза проявляется при инфекциях, вызванных пикорнавирусами, парагриппозными вирусами, альфавируса­ми, аренавирусами, ротавирусами.

Рис. 1. Реутилизация нуклеотидов ДНК.
a — нуклеотиды (показан дезоксицитидинтрифосфат), необходимые для синтеза ДНК, могут быть получены путем реутилизации нуклеозидов (dC, дезоксицитидин). Три фермента (DCK — дезоксицитидинкиназа, CMPK1 — цитидинмонофосфаткиназа, NDPK — нуклеозиддифосфаткиназа) последовательно фосфорилируют dC, в результате чего образуется трифосфат, который включается в ДНК.
b — уже модифицированные нуклеозиды (показан гидроксиметилдезоксицитидин, 5hmdC), опасные для ДНК, в норме проходят лишь первый этап фосфорилирования. Но если в клетке усилена экспрессия цитидиндезаминазы (CDA), то она превращает 5hmdC в гидроксиметилдезоксиуридин (5hmdU), который проходит все три этапа фосфорилирования и включается в ДНК, что приводит к фрагментации ДНК и гибели клетки.
Рисунок из синопсиса к обсуждаемой статье в Nature

В работе английских ученых открыт и описан механизм, посредством которого предотвращается включение в ДНК модифицированных производных цитозина. Но самым значительным результатом работы представляется то, что показана принципиальная возможность использовать усиленную экспрессию цитидиндезаминазы при ряде злокачественных опухолей — известный механизм устойчивости к противораковым препаратам — для лечения рака.

Нуклеотиды — рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды, — из которых строится соответственно РНК или ДНК любых клеток, не только синтезируются в клетке de novo. Природа бережлива, и часть материала для синтеза ДНК производится при реутилизации распадающейся ДНК погибших клеток из нуклеозидов — предшественники нуклеотидов.

Нуклеозиды — это органические соединения, состоящие из азотистого (пуринового или пиримидинового) основания — аденина, гуанина, тимина или цитозина (в РНК его заменяет урацил) — и связанного с ним гликозидной связью пятичленного углевода — рибозы или дезоксирибозы (соответственно, различают рибо- и дезоксирибонуклеозиды); рис. 2. Нуклеозиды могут быть фосфорилированы киназами клетки, и тогда образуются соответствующие нуклеотиды.

Рис. 2. Строение нуклеотидов — фосфорных эфиров нуклеозидов. Рисунок с сайта ru.wikipedia.org

Название нуклеозидов происходит от входящего в их молеулу азотистого основания: в случае аденина — аденозин (дезоксиаденозин), гуанина — гуанозин (дезоксигуанозин), тимина — тимидин (дезокситимидин), урацила — уридин (дезоксиуридин), цитозина — цитидин (дезоксицитидин).

Однако в реутилизации ДНК участвуют не только стандартные нуклеозиды (точнее, дезоксирибонуклеозиды), но и их модификации, из которых чаще всего встречается метилдезоксицитидин — 5mdC (рис. 3). Известны также другие модификации дезоксицитидина — гидроксиметилдезоксицитидин (5hmdC), формилдезоксицитидин (5fdC) и карбоксидезоксицитидин (5cadC).

Рис. 3. Цитозин и его природные модификации. Слева — цитозин, далее слева направо — метилцитозин, гидроксиметилцитозин, формилцитозин, карбоксицитозин. Изображения с сайта en.wikipedia.org

Эти модификации возникают в результате эпигенетических процессов, происходящих на уже синтезированной ДНК. Так, метилирование дезоксицитидина в определенных участках ДНК служит главным образом для регуляции экспрессии генов. Включенные в геном в процессе синтеза ДНК уже модифицированные нуклеотиды распознаются как неправильные, и срабатывает система репарации: в ДНК возникают разрывы, неправильные нуклеотиды отщепляются, на их место ставятся правильные и разрывы зашиваются. Но мощности системы, ликвидирующей эти разрывы, может не хватить. В результате клетка переходит в состояние апоптоза и гибнет. Поэтому существуют механизмы, предотвращающие включение опасных модифицированных нуклеотидов в ДНК.

О метилдезоксицитидине (5mdC) уже было известно, что он реутилизируется как другой нуклеозид — дезокситимидин — после дезаминирования (удаления аминогруппы NH₂). А вот как реутилизируются другие модификации дезоксицитидина — известно не было. Поскольку в процессе реутилизации ДНК к нуклеозидам последовательно присоединяются три фосфатные группы и получаются нуклеозидтрифосфаты — субстраты для синтеза новой ДНК с помощью ДНК-полимеразы, то можно было предположить, что барьер, не позволяющий модифицированным цитозинам включиться в ДНК, должны воздвигнуть либо ферменты, участвующие в реутилизации, либо ДНК-полимераза.

Исследователи проследили, как работает цепочка реутилизации цитозина применительно к его модификациям. Дезоксицитидинтрифосфат (dC-трифосфат) образуется из дезоксицитидина (dC) в результате трех ферментативных реакций, присоединяющих к нему три фосфатные группы, выполняемых последовательно дезоксицитидинкиназой (DCK), цитидинмонофосфаткиназами (CMPK1 и CMPK2) и семейством нуклеозиддифосфаткиназ (NDPK) (рис. 1). Проверку начали с последнего звена — ДНК-полимеразы. В ДНК-полимеразной реакции in vitro гидроксиметилдезоксицитидин (5hmdC) включался в ДНК. После того как в культивируемые клетки был введен 5hmdC-трифосфат, в их ДНК был обнаружен 5hmdC. Следовательно, блокирование не связано с ДНК-полимеразой.

Далее были проверены другие звенья цепи реутилизации. В силу ряда особенностей метаболизма авторы обратили внимание прежде всего на дезоксицитидинкиназу (DCK) и цитидинмонофосфаткиназу CMPK1. Рекомбинантная (полученная методами генетической инженерии) DCK оказалась способной фосфорилировать — переносить 32 Р — на дезоксицитидин (dC), на метилдезоксицитидин (5mdC), на гидроксиметилдезоксицитидин (5hmdC), на формилдезоксицитидин (5fdC), но не на карбоксидезоксицитидин (5cadC). В то же время CMPK1 могла присоединять вторую фосфатную группу только на немодифицированный dC-монофосфат. Таким образом, неспособность CMPK1 фосфорилировать модифицированные цитозиновые нуклеозиды представляет собой препятствие, предотвращающее их включение во вновь синтезируемую ДНК.

В следующей серии экспериментов была изучена реакция различных культивируемых раковых клеток на присутствие в культуральной среде модифицированных производных цитозина. Была проверена токсичность гидроксиметилдезоксицитидина (5hmdC) для 19 линий клеток. Рост 17 из них не подавлялся или подавлялся незначительно, но клетки двух линий оказались чрезвычайно чувствительными как к 5hmdC, так и к формилдезоксицитидину (5fdC); рис. 4. Сравнение профилей экспрессии генов этих двух линий с профилями устойчивых клеток выявили достоверные различия для 1380 генов. Но из генов, участвующих в транспорте нуклеозидов или в реутилизации цитидина, среди них нашелся лишь усиленно экспрессирующийся ген цитидиндезаминазы (CDA), которая превращает дезоксицитидин (dC) в дезоксиуридин (dU). Чтобы подтвердить связь уровня экспрессии CDA и токсичности 5hmdC, в чувствительных клетках блокировали экспрессию CDA с помощью shРНК. И действительно, при этом клетки становились значительно более устойчивыми к 5hmdC.

Рис. 4. Чувствительность различных культивируемых раковых клеток к 5hmdC. По горизонтальной оси — названия клеток, по вертикальной оси — отношение количеств живых клеток, выращенных в присутствии 5hmdC и в присутствии dC. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

In vitro CDA оказалась способной дезаминировать метилдезоксицитидин (5mdC), гидроксиметилдезоксицитидин (5hmdC), формилдезоксицитидин (5fdC), но не карбоксидезоксицитидин (5cadC). В результате дезаминирования дезоксицитидина (dC) и метилдезоксицитидина (5mdC) образуются дезоксиуридин (dU) и дезокситимидин (dT) — нормальные предшественники тимидинтрифосфата. Но в результате дезаминирования 5hmdC и 5fdC образуются нестандартные нуклеозиды гидроксиметилдезоксиуридин (5hmdU) и формилдезоксиуридин (5fdU). Поэтому далее было изучено, может ли 5hmdC в клетках с повышенной активностью CDA преодолеть блок, превратившись в 5hmdU, и связана ли специфическая токсичность для клеток 5hmdC с включением в ДНК 5hmdU.

Прежде всего, была проверена способность работать с 5hmdU и с 5fdU теперь уже ферментов реутилизации дезоксиуридина (dU) и дезокситимидина (dT) — тимидинкиназы, присоединяющей первый фосфат к тимидину, и тимидилаткиназы, присоединяющей к нему второй фосфат. И оказалось, что в отличие от цитидинмонофосфаткиназы СМРК1, неспособной использовать как субстраты соответствующие монофосфаты гидроксиметилдезоксицитидина (5hmdC) и формилдезоксицитидина (5fdC), тимидилаткиназа присоединяла второй фосфат и к гидроксиметилдезоксиуридину (5hmdU), и к формилдезоксиуридину (5fdU). В то же время, мощная гидролаза, разрушающая дезоксиуридинтрифосфат и таким образом не позволяющая ему включиться в ДНК, с трифосфатами 5hmdU и 5fdU не работала. И наконец, в ДНК клеток линии MDA-MB-231, обладавших очень активной цитидиндезаминазой (CDA), после культивирования с 5hmdC или 5fdC обнаруживались гидроксиметилурацил (5hmUra) или формилурацил (5fUra) соответственно, но не гидроксиметилцитозин (5hmCyt) или формилцитозин (5fdCyt). Таким образом, CDA может дезаминировать 5hmdC или 5fdC, превращая их в 5hmdU или в 5fdU, которые затем фосфорилируются и включаются в ДНК, вызывая ее фрагментацию и гибель клетки.

Рис. 5. Соотношение количества обычных клеток Н1299 и Н1299 CDA_dsRed (с искусственно повышенной экспрессией CDA) выраставших в присутствии dC, 5hmdC или 5fdC из их первоначальной смеси в равных количествах. Уменьшенная концентрация 5fdC в культуральной среде показывает его более высокую токсичность. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Известно, что усиленная экспрессия CDA при ряде раков связана с устойчивостью к противораковым препаратам — аналогам цитидина. Она превращает их в безвредные для клетки соединения, что делает применение этих лекарств малоэффективным или бесполезным. В данном исследовании результат оказался противоположным: из-за усиления активности CDA нетоксичные в норме 5hmdC и 5fdC становятся для клеток летальными. Поэтому авторы предположили, что 5hmdC и 5fdC можно применить для селективного подавления раковых клеток. Они смешали равные количества культивируемых клеток рака легких Н1299, экспрессирующих нормальный уровень CDA и Н1299, в которых с помощью генно-инженерных манипуляций уровень CDA был резко повышен. При дальнейшем культивировании в присутствии 5hmdC или 5fdC наблюдалось резко выраженное селективное подавление роста последних (рис. 5).

Рис. 6. Схема и результаты эксперимента по трансплантации мышам клеток Н1299 и Н1299 CDA_dsRed (с искусственно повышенной экспрессией CDA). Слева — схема эксперимента, справа — объемы выраставших опухолей. По горизонтальным осям — время введения нуклеозидов и время регистрации объема опухолей (в днях). PBS — фосфатный буферный раствор (контроль). Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Таким образом, открыт и описан механизм, посредством которого предотвращается включение в ДНК модифицированных производных цитозина. Но самым замечательным результатом обсуждаемой работы представляется то, что авторы показали принципиальную возможность обратить известный механизм устойчивости к противораковым препаратам, связанный с усиленной экспрессией CDA при ряде злокачественных опухолей, в механизм, открывающий перспективы для лечения рака, его типов, которым свойственна усиленная экспрессия CDA. Таковыми являются раки поджелудочной железы, ротовой полости и ряд других. Это может быть особенно важно для лечения рака поджелудочной железы, который в ближайшем будущем станет вторым по частоте встречаемости после рака легких онкологическим заболеванием. Разумеется, прежде чем эта стратегия найдет клиническое применение, предстоит еще выяснить много обстоятельств, связанных с возможной токсичностью или мутагенностью модифицированных нуклеозидов, и возможных механизмов устойчивости к такого рода терапии.

Источники:
1) Melania Zauri et al. CDA directs metabolism of epigenetic nucleosides revealing a therapeutic window in cancer // Nature. 2015. V. 524. P. 114–118.
2) Sharanya Sivanand, Kathrin E. Wellen. Molecular biology: Salvaging the genome // Nature. 2015. V. 524. P. 40–41. (Популярный синопсис к обсуждаемой статье.)