Сольвент детергентный метод инактивации вирусов

Иммуноглобулины человека – группа иммунобиологических препаратов крови, потребность в которой неуклонно растет во всем мире. Препараты иммуноглобулинов человека представляют собой выделенную промышленным способом иммунологически активную белковую фракцию плазмы крови здоровых доноров, несущую антительную активность различной специфичности. Несмотря на то, что препараты иммуноглобулинов содержат преимущественно иммуноглобулины класса G – антитела против различных возбудителей бактериальных и вирусных инфекций и/или их токсинов, спектр их применения не ограничивается традиционной заместительной и иммуномодулирующей терапией при первичных гуморальных иммунодефицитах, а также проведением специфической профилактики и лечения бактериальных и вирусных инфекций. Уже сейчас в применении препаратов иммуноглобулинов человека неврологические показания составляют 42 %, первичные иммунодефициты – 33 %, гематоонкология – 18 % мирового потребления [31]. Приблизительно в 33 % случаев препараты иммуноглобулинов человека применяются не по показаниям (off-label) при более чем 50 заболеваниях, например, при лечении дерматомиозитов/полимиозитов, хронического идиопатического и комплексного регионального болевого синдрома, тяжелой диабетической полинейропатии, глиобластомы, нейробластомы, аутоиммунной вегетативной ганглиопатии, педиатрических аутоиммунных нейропсихиатрических нарушений, ассоциированных со стрептококковой инфекцией, и других [13].

На Российском фармацевтическом рынке зарегистрировано 115 наименований препаратов крови человека отечественного и зарубежного производства [1].

Из них 46 % наименований, представлены препаратами иммуноглобулинов человека нормальными, специфическими и специального назначения для внутривенного и внутримышечного введения. Современный прогресс препаратов иммуноглобулинов человека обусловлен не только улучшением их эффективности и расширением показаний к их применению в клинической практике, но и достижениями, связанными с обеспечением их качества и безопасности. Вопрос безопасности препаратов иммуноглобулинов человека, прежде всего, рассматривается в аспекте обеспечения вирусной безопасности, так как для их производства используется биологический материал, потенциально содержащий возбудители гемотрансмиссивных инфекций. Не все возбудители гемотрансмиссивных инфекций, которые могут присутствовать в донорской крови, могут передаваться при применении препаратов иммуноглобулинов человека. Основными вирусными контаминантами, ассоциированными с препаратами иммуноглобулинов человека, являются вирус иммунодефицита человека 1 и 2 типов, вирусы гепатита В, С, А, парвовирус В19 [12].

Отбор доноров осуществляется в соответствии с Международной программой качества плазмы (IQPP) [21]. В соответствии с этой программой потенциальный донор должен получить статус квалифицированного, обязывающий его пройти два отдельных медицинских обследования и лабораторный контроль на отсутствие антител к основным гемотрансмиссивным инфекциям (вирусу иммунодефицита человека, вирусу гепатитов В и С). Если донор не появляется в учреждении по заготовке плазмы в течение 6 месяцев, то он теряет статус квалифицированного донора. Плазма от первичного донора не может быть использована для получения препаратов крови даже при отрицательном результате лабораторных исследований. Информация о донорах вносится в национальный регистр с целью недопущения к сдаче плазмы крови донора, не прошедшего квалификацию. Для снижения возможного риска передачи болезни Крейцфельда-Якоба (CJD) и вариантной болезни Крейцфельда-Якоба (vCJD) введены критерии исключения для доноров, гарантирующие безопасность: отсранение лиц, у которых были диагностированы CJD и vCJD, доноров, которые перенесли трансплантацию твердой мозговой оболочки или роговицы, или получали гипофизарный гормон роста, доноров, у которых есть один или несколько родственников с болезнью Крейцфельда-Якоба. Доноры, постоянно пребывающие в Соединенном Королевстве и подвергающиеся риску развития вариантной болезни Крейцфельда-Якоба, а также доноры, которые суммарно провели в Соединенном Королевстве с 1980 по 1996 гг. три месяца или более (для доноров США) или двенадцать месяцев или более, отстраняются от донорства бессрочно [18].

Для производства препаратов иммуноглобулинов человека используют плазму человека для фракционирования [41], полученную из крови не менее чем от 1000 здоровых доноров. Качество и безопасность плазмы для фракционирования является фундаментом производства современных препаратов иммуноглобулинов человека. Передача плазмы для фракционирования в производство включает тестирование индивидуальных донаций, мини-пулов и производственного пула на маркеры вирусных инфекций [3, 22]. Тестирование индивидуальных донаций осуществляют иммуноферментным методом на содержание поверхностного антигена вируса гепатита В, антител к вирусу иммунодефицита человека 1 и 2 типов, и антител к вирусу гепатита С. Национальные органы контроля могут принять решение о необходимости выполнения дополнительного теста на содержание аланинаминотрансферазы. Тестирование индивидуальных донаций в Российской Федерации на предприятиях по фракционированию проводится по такой же схеме, с обязательным определением отсутствия содержания антител к возбудителю сифилиса. Тестирование мини-пулов проводят и иммуноферментным методом и методом ПЦР. Обязательным является определение отсутствия содержания антител к вирусу иммунодефицита человека 1 и 2 типов, поверхностного антигена вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С иммуноферментным методом. Далее с использованием ПЦР технологии исследуют мини-пулы на отсутствие содержания маркеров РНК-содержащих вирусов: иммунодефицита человека 1 и 2 типов, вируса гепатита С и ДНК-содержащего парвовируса В19. Выявление РНК вируса гепатита А и ДНК вируса гепатита В методом ПЦР проводится на усмотрение производителя. В Российской Федерации определение ДНК парвовируса В19 и РНК вируса гепатита А не предусмотрено. Для формирования производственного пула допускаются только мини-пулы плазмы, содержащие не более 104 МЕ/мл ДНК парвовируса В19 и отрицательные в отношении маркеров вирусных инфекций [22]. Тестирование производственного пула осуществляют иммуноферментным методом на содержание поверхностного антигена вируса гепатита В, антител к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и к вирусу гепатита С и методом ПЦР на содержание маркеров РНК-содержащих вирусов: иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), гепатита С и ДНК-содержащих парвовируса В19 и вируса гепатита В. Тестирование методом ПЦР на содержание РНК вируса гепатита А и ДНК парвовируса В19 в Российской Федерации является необязательным [3].

Современные технологии фракционирования белков плазмы крови человека сочетают очистку протеинов с инактивацией и удалением вирусов. Преципитация с помощью этанола – наиболее широко используемый метод фракционирования плазмы. Помимо того, что этанол выступает в качестве преципитанта, он также обладает дезинфицирующими свойствами, которые, однако, наиболее выражены при положительных температурах. Вирусы как большие структуры имеют тенденцию преципитировать в начале процесса фракционирования, когда концентрация этанола относительно низкая. В результате этой стадии преципитации происходит распределение вирусов между фазами, что, однако, не исключает возможность вирусной контаминации на стадиях получения готового продукта. Метод этанольного фракционирования доказал свою эффективность в обеспечении вирусной безопасности препаратов иммуноглобулинов [17]. Однако его необходимо дополнять более эффективными методами и инактивации и удаления вирусов. Поиск и совершенствование методов инактивации и удаления вирусов основывался на использовании как физических факторов, так и химических реагентов. Внедрение в производство таких методов, как пастеризация, энзимный протеолиз при низких значениях рН, обработка ß-пропиолактоном в сочетании с ультрафиолетовым облучением, значительно повысило вирусную безопасность препаратов иммуноглобулинов. В то же время, эти методы имели ряд технологических недостатков, оказывали влияние на качество и эффективность конечного продукта и требовали доработки. Поэтому дальнейшее совершенствование технологии производства препаратов иммуноглобулина было направлено на повышение вирусной безопасности препаратов при сохранении иммунобиологических свойств и соответственно высокой терапевтической эффективности. На сегодняшний день при производстве современных препаратов иммуноглобулинов человека используют такие методы инактивации и элиминации вирусов, как сольвент-детергентный метод, метод обработки октановой (каприловой) кислотой и ацетатом кальция, метод инкубирования при низких значениях рН, пастеризация и метод нанофильтрации [5].

Требования по безопасности ужесточаются в связи с необходимостью во многих случаях приготовления концентратов вирусных антигенов. Следует отметить, что инактивация должна быть не только эффективной, но и максимально щадящей (селективной). Иными словами, сопутствующие изменения в структуре вирусных частиц и их компонентов должны быть минимальными. Однако механизм инактивирующих воздействий во многих отношениях недостаточно выяснен и их использование зачастую носит эмпирический характер.

Так как вирионы в центре агрегатов, образованных клеточными и сывороточными компонентами, могут быть защищены от инактивации, разрушение и удаление агрегатов различными методами очистки вирусной суспензии является важным этапом перед инактивацией. При изготовлении цельновирионных не-реплицирующихся вакцин используют химические и физические методы инактивации вирусов.

Из химических соединений наиболее часто используют два главных типа инактиваторов: ретикулирующие (разрыхляющие) агенты и алкилирующие агенты.
К ретикулирующим агентам относятся альдегиды, в том числе формальдегид, глютаральдегид и глицидальдегид, из которых наиболее часто используют формальдегид. К алкирующим агентам относятся бетапропиолактон, этиленимин и другие азиридины.

Механизм действия инактивирующих агентов, вероятно, заключается в следующем: 1) взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами, они делают невозможной их репликацию; 2) вызывают ретикуляцию белков.

Механизм действия инактивирующих агентов лучше изучен применительно к белкам, чем к нуклеиновым кислотам, хотя в целом остается не полностью выясненным. Инактивация вирусов, кажется, основывается на двойном действии ретикуляции белков, взаимодействующих с клеточными рецепторами, и блокаде репликации нуклеиновых кислот. Необходимая концентрация инактивирующих агентов зависит, главным образом, от относительной концентрации белков и нуклеиновых кислот в инактивируемой среде. Температура и гомогенность инактивируемого субстрата также играют ключевую роль в кинетике инактивации вируса.

Возможность обратимости изменений реактивных групп (аминогруппа лизина, фенольные ядра тирозина) необходимо учитывать, особенно в случае использования формальдегида.
Полнота инактивации вируса должна определяться сразу после изготовления вакцины.

Наиболее общепринятыми инактивирующими агентами являются формальдегид, бета-пропиолактон и этиленимин. Одним из преимуществ бета-пропиолактона, используемого для изготовления вакцины против бешенства, и этиленимина, применяемого в изготовлении вакцины против ящура, является то, что они полностью гидролизуются в течение нескольких часов с образованием нетоксичных продуктов.

Формальдегид инактивирует вирусы благодаря высокой реакционной способности в отношении белков и нуклеиновых кислот. Он вступает в соединение не только с вирусными частицами, но и с многочисленными компонентами среды, в которую его добавляют.

Механизм инактивации вирусов формальдегидом сложен и характеризуется двумя типами реакций. Взаимодействие формальдегида с нуклеиновой кислотой и белками вируса протекает, соответственно, по типу реакции первого и второго порядка. Наиболее существенна для инактивации первая, которая, однако, в значительной мере зависит от второй.

Взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами и белками, формальдегид реагирует в основном с аминогруппами. Присоединение формальдегида к аминогруппам пуринов и пиримидинов уничтожает матричную и информационную активность нуклеиновых кислот.

Формальдегид с большей скоростью взаимодействует с аминогруппами аминокислот и белков с образованием метилольных производных, чем с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот. Сложилось представление, что с белками и нуклеиновыми кислотами вирусов формальдегид реагирует в две стадии. Вначале, в результате взаимодействия формальдегида с амино- или иминогруппами, быстро образуются весьма нестабильные метилольные производные, а затем, в результате вторичных реакций — бисметиленовые производные.

Продукты взаимодействия формальдегида с аминокислотами способны вступать в реакцию с нуклеиновыми кислотами значительно быстрее, чем сам формальдегид.

Во второй стадии происходит медленное взаимодействие первичных продуктов реакции с другими группами белков, в результате чего образуются ковалентно связанные димеры полипептидов. При этом уплотняется белковая оболочка и уменьшается ее проницаемость. Вследствие этого снижается скорость инактивации вируса. Под влиянием формальдегида в вирионах клещевого энцефалита образовывались гликопротеиновые димеры и комплекс РНК с белками нуклеокапсида. Последний отличался высокой стабильностью и разрушался только РНКазой. Предполагается, что образование этого комплекса — основной механизм инактивации вируса. Гликопротеин, экстрагированный из инактивированного вируса, обладал нормальной антигенной и иммуногенной активностью.

Следует отметить, что реакция формальдегида с аминогруппами обратима, то есть при удалении избытка реагента или разбавлении раствора активность нуклеиновой кислоты может быть восстановлена. Процесс взаимодействия вируса с формальдегидом зависит от таких факторов, как концентрация реагента, температура, рН среды.

При оптимальных условиях инактивации взаимодействие формальдегида с белками многих вирусов не оказывает значительного влияния на их антигенные свойства. Однако ряд вирусов теряет значительную часть антигенной активности при инактивации формалином. Это особенно касается оболочечных вирусов и, прежде всего, вирусов кори и респираторно-синцитиального (PC) вируса. Например, инактивирован-ная формалином вакцина против PC-вируса вызывала образование антител к белку F, которые не подавляли его инфекционную и симпластообразующую активность. Более того, вакцинация приводила к осложнению течения болезни при последующем ее возникновении. Вероятно, под действием формалина изменяются эпитопы гликопротеина, ответственные за индукцию вируснейтрализующих антител.

Это касается, прежде всего, поверхностного F белка, ответственного за протективный иммунитет. Однако многие из вирусов, которые относительно хорошо переносят инактивацию формалином, оказываются весьма чувствительными к изменениям ее условий. Повышение концентрации формальдегида в десять и более раз по сравнению с оптимальной (0,1%-ной) приводило к морфологическим изменениям поверхностного антигена вируса гепатита В и снижению его активности, а увеличение продолжительности обработки очищенного полиовируса сопровождалось значительным повреждением капсида некоторых вирионов. С целью смягчения повреждающего действия формальдегида на антигенность и иммуногенность вирусов стали применять стабилизирующие вещества. Установлено, например, что добавление арилдона (5,4 М) не влияет на инактивацию аттенуированных и вирулентных штаммов полиовируса формалином (1:4000, 37°С) и, в то же время, способствует сохранению иммуногенности за счет стабилизации D-антигена.

СОЛЬВЕНТ-ДЕТЕРГЕНТНЫЙ МЕТОД ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСОВ В ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

В обзоре литературы охарактеризованы различные варианты сольвент-детергентной (СД) обработки препаратов иммуноглобулинов, включающие использование три-N-бутилфосфата в комбинации с одним из детергентов, например натрия холатом, твином-80 (полисорбат), тритоном Х-100 или Х-45 (октоксинол). Описаны технологические приемы проведения процедуры и способы очистки от примесей. Обоснованы допустимые остаточные количества используемых реагентов в готовых лекарственных формах. Представлены этапы валидации процесса СД-обработки и методы определения вирусной редукции. Продемонстрировано, что безопасность СД-обработанных препаратов обеспечивается, с одной стороны, за счет инактивации покрытых оболочкой вирусов, с другой — за счет сохранения биологических свойств препаратов и активности специфических антител.

Ключевые слова: препараты иммуноглобулинов, сольвент-детергентная обработка, хроматографическая очистка, редукция вирусов

1. Анастасиев В. В. Иммуноглобулин для внутривенного введения. Нижний Новгород: НГМА; 2000: 25—53.

2. Bresee J. S., Mast E. E., Coleman P. J. et al. Hepatitis C virus infection associated administration of intravenous immune globulin. A cohort study. JAMA. 1996; 276 (19): 1563—1567.

3. Голосова Т. В., Никитин И. К. Гемотрансмиссивные инфекции. М.: Мед. информ. агентство; 2003: 48—99.

4. Левин И., Русанов В. М. Служба крови и препараты плазмы. Международный аналитический обзор. М.: Медпрактика; 2007: 183—192.

5. Gould L. H., Fikrig E. West Nile virus: a growing concern? J. Clin. Invest. 2004; 113(8): 1102—1107.

6. Alonso W., Trukawinski S., Savage M. et al. Viral inactivation of intramuscular immune serum globulins. Biologicals 2000; 28 (1): 5—15.

7. Carbone J. Adverse reactions and pathogen safety of intravenous immunoglobulin. Curr. Drug Safety 2007; 2: 9—18.

8. Tanaka K., Sawatani E., Shigueoka E. et al. A chromatographic method for the production of a human immunoglobulin G solution for intravenous use. Braz. J. Med. Biol. Res. 1998; 31(11): 1375—1381.

9. Русанов В. М., Левин И. Лечебные препараты крови. М.: Медпрактика-М; 2004: 83—90.

10. Dichtelmuller H. O., Bierst L., Fabbrizzi F. et al. Robustness of solvent/detergent treatment of plasma derivatives: a data collection from Plasma Protein Therapeutics Association member companies. Transfusion 2009; 49(9): 1931—1943.

12. Финдлей Дж., Эванза У. (ред.). Биологические мембраны. Методы. Пер. с англ. М.: Мир; 1990: 196—208.

15. Horowitz B., Prince A. M., Horowitz M. S. Viral safety of solvent-detergent treated blood products. Dev. Biol. Stand. 1993; 81: 147—161.

17. Edwards C., Piet M., Chin S., Horowitz B. Tri (n-Butyl) Phosphate/Detergent treatment of licensed therapeutic and experimental blood derivatives. Vox Sang. 1987; 52(1—2): 53—59.

18. Chand C. E., Eo H. G., Lee Y. et al. Human intravenous immunoglobulin preparation and virus inactivation by pastepization and solvent detergent treatment. Prep. Biochem. Biotechnol. 2000; 30(3): 177—197.

19. Uemura Y., Yang Y., Heldebrant C. et al. Inactivation and elimination viruses during preparation of human intravenous immunoglobulin. Vox Sang. 1994; 67(3): 246—254.

21. Guerrier L., Flayex I., Boschetti E. et al. Specific sorbent to remove solvent-detergent mixtures from virus-inactivated biological fluids. J. Chromatogr. 1995; 664: 119—125.

22. Trescec A., Simić M., Branovic K. et al. Removal of detergent and solvent from solvent-detergent-treated immunoglobulins. J. Chromatogr. 1999; 852(6): 87—91.

24. Европейская фармакопея. Плазма человека (пулированная и обработанная для инактивации вирусов). В кн.: Оприщенко С. А., Захаров В. В. Русанов В. М. Международные регулирующие документы и стандарты службы крови и производства препаратов плазмы. М.: Медпрактика-М; 2008: 418—422.

25. Klein H. G., Dodd R. Y. Current status of solvent/detergent frozen plasma. Transfusion 1998; 38(1): 102—107.

27. Stamoulis K., Sofroniadou K. Virus inactivation of plasma and its derivatives. Haema 2002; 5(3): 213—221.

29. Ebeling F., Baer M., Hormila P. et al. Tolerability and kinetics of a solvent-detergent-treated intravenous immunoglobulin preparation in hypogammaglobulinaemia patients. Vox Sang. 1995; 69(2): 91—94.

30. Mould G. P., Sutton J. A., Matejtschuk P. et al. Solvent-detergent treatment does not alter the tolerance or uptake of human normal immunoglobulin for intramuscular injection. Vox Sang. 2001; 80(3): 151—158.

31. Segura A., Leon G., Su C. Y. et al. Assessment of the impact of solvent-detergent treatment on the quality and potency of a whole IgG equine antivenom. Biologicals 2009; 37(5): 306— 312.

32. Жибурт Е. Б. Пути повышения качества отечественных препаратов крови. Ремедиум 2005; 4: 42—44.

33. Лютов А. Г., Мостовская Е. В., Денисов А. К. и др. О безопасности и клинической эффективности габриглобина — отечественного иммуноглобулина для внутривенного введения. Лекарственные средства в педиатр. 2008; 87(3): 73— 78.

35. Mojgan P., Rassoul D., Kamran M. et al. Solvent-detergent treatment of IgM-enriched immunoglobulin. DARU 2003; 11(2): 3—8.

38. Poelser G., Berting A., Kindermann J. et al. A new liquid intravenous immunoglobulin with three dedicated virus reduction steps: virus and prion reduction capacity. Vox Sang. 2008; 94 (3): 184—192.

Номер работы: 359625

Без учета скидки. Вы получаете файл формата pdf

Вы получаете первые страницы диссертации в формате txt

Просмотр 1 страницы = 3 руб

Оглавление диссертации:

Согласно рекомендациям экспертов Всемирной организации здравоохранения для приготовления иммуноглобулинов из плазмы крови человека можно использовать физические и химические методы разделения белков, если эти методы позволяют получать безопасные и эффективные препараты [Комитет экспертов ВОЗ, 1988]. Поэтому методы, применяемые для выделения иммуноглобулинов, должны, кроме обеспечения качества и чистоты продукта, удалять и инактивировать вирусы. В большинстве стран в качестве одного из основн

Дополнительные технологические приемы инактивации вирусов Дополнительные методы, применяемые для повышения вирусной безопасности препаратов крови, обычно классифицируют по их основному принципу:

1) способности инактивировать (разрушать) вирусные частицы;

2) способности элиминировать (удалять) их. По характеристике используемых для инактивации агентов все методы можно разделить следующим образом:

1) физические (тепловая обработка, гаммаили ультрафиолетовое (УФ) облучение, ги

. В качестве исходного материала был использован IgG, полученный спиртовым методом по варианту Б на Нижегородском предприятии по производству бактерийных препаратов. Процесс производства многостадийный. Первая стадия предусматривала очистку плазмы от фибриногена. Основную массу его осаждали при концентрации этанола 8%, при рН 6,8

7.2, температуре - 3°С. При этом наряду с фибриногеном в осадок попадали часть факторов свертывания крови, и нерастворимые на холоду глобулины и компоненты ком

. В колбу вместимостью 300 мл помещали 76,0+0,1 г алюмоаммонийных квасцов и заливали 150,0+1,0 мл дистиллированной воды. В другой колбе вместимостью 1000 мл растворяли 22,0+0,1 г сернокислого аммония в 600 мл дистиллированной воды и добавляли 100,0+0,1 мл 10%) раствора аммиака. Обе колбы помещали в водяную баню при 63+1 °С и постоянно помешивали. Растворенные алюмоаммонийные квасцы выливали в колбу с сернокислым аммонием и аммиаком и перемешивали в течение 10 минут. После этого смесь вылива

1.1. Появление опалесценции и мутность растворов IgG оценивали по оптической плотности иммуноглобулина при длине волны 540±5 нм (максимум поглощения для мутных растворов) в кювете использованием фотоэлектрокалориметра КФК- 2 [29].

2.2.2. Определение изменений функциональной активности.

2Л.Оценку изменений в области Fc-фрагментов проводили определения антикомплементарной активности активности. иммуноглобулина Для методом измерения антикомплементарной фиксированное количество тестируемого материала (0,2 мл 5% раствора препарата, т.е. 10 мг иммуноглобулина) инкубировали с определенным количеством комплемента морской свинки (20 гемолитических единиц СН50) и затем определяли количество несвязавшегося комплемента. Антикомплементарную активность выражали как расход СН50 на 1 мг

Оценка изменений в области Fab-фрагментов содерэюания антител в иммуноглобулине. Содержание противокоревых антител проводили в реакции пассивной гемагглютинации с коммерческим диагностикумом предприятия по по показателю производству бактерийных препаратов С.

-Петербургского НИИЭМ им. Пастера в соответствии с инструкцией по применению. Определение антиальфастафилолизина проводили в реакции нейтрализации по утвержденной методике [Методические указания, 1988]. Антитела к вирусу гепатита В

3. Оценка эффективности инактивации и элиминации вирусов. Раздел работы по оценке эффективности элиминации вирусов методом ПЦР был выполнен на базе Института эпидемиологии и микробиологии. Выражаем глубокую благодарность заведующему лабораторией генетики и геносистематики микроорганизмов к.б.н. Мазепе В.Н. за оказанную помощь и консультации. Раздел работы по оценке эффективности инактивации вирусов на культуре клеток был выполнен на базе Института вирусологии им.Д.И.Ивановского. Выражаем глуб

3.2. Метод определения инфекционности вируссодерэ/сащего материала в единицах TCID/50/мл (TCID/50 - от англ. tissue culture infections dose - доза, инфекционная для 50% зараженных клеток) [Мейхи Б.,1988]. В модельных опытах использовали вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1), вирус гепатита А (ВГА), вирус Синдбис. Вируссодержащую жидкость получали на культуре клеток. Для пассирования вируса иммунодефицита (ВИЧ-1) использовали перевиваемую клеточную линию Тлимфоцитов человека (CEM-SS). Вирус г

мм) с нанесенной жидкой фазой 5% SE-30. Проведение анализа. В две пробирки для центрифугирования вносили по 2,5 г безводного сульфата натрия. Затем туда же добавляли по 3 см анализируемой пробы (у2

5.2. Статистичекую обработку результатов проводили с помощью персонального компьютера с использованием программы Microsoft Excell (раздел описательная статистика) с учетом рекомендаций для биомедицинских исследований. Анализ данных проводили при уровне надежности 95%, Оценку достоверности изменений оценивали методом парных сравнений с использованием критерия Стьюдента [Лакин Г.Ф., 1990].

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Обеспечение качества и вирусной безопасности иммуноглобулинов, особенно форм для внутривенного введения, всегда было актуальной проблемой. Несмотря на достаточно высокий уровень требований к сыворотке и плазме, а также использование нами для получения препарата метода спиртового фракционирования по Кону, внедрение дополнительных стадий инактивации вирусов на заключительных этапах производства в настоящее время стало объективной необходимостью

2.3.1. Изучение влияния тепловой обработки на физико-химические и биологические свойства иммуноглобулинов. На первом этапе исследований основной нашей задачей было провести оценку изменений при физико-химических тепловой и биологических препарата. свойств было необходимо иммуноглобулина обработке Преимущество теплового метода инактивации заключается в том, что он проверен временем и позволяет инактивировать вирусы с липидной оболочкой и без нее [Uemura Y. etal., 1994;NowakT. etal., 1993].

1.1. Прогрев препаратов в отсутствие стабилизаторов Температурные условия и время прогрева раствора иммуноглобулина были определены опытом производства вирусологически безопасного альбумина, т. е. прогрев производили при 60°С течение 10 часов. В предварительных опытах было установлено, что иммуноглобулин при температуре выше 60°С, независимо от условий прогрева, формирует агрегаты IgG. Поэтому пробы прогревали при температуре 58-60°С. Прогрев в этом режиме, как показали наши исследования,

1.2. Прогрев раствора иммуноглобулина в присутствии стабилизаторов. В настоящем разделе работы предпринята попытка стабилизации концентрированных растворов иммуноглобулинов в процессе тепловой инактивации вирусов. В поисках условий сохранения молекулярной были использованы следующие структуры и биологической активности вещества: аминокислоты глицин, изолейцин; многоатомный спирт - сорбит; сахара - мальтоза, лактоза сахароза глюкоза. Выбор этих веществ обусловлен тем, что большинство

Для оценки влияния тепловой обработки на вирусы мы использовали два методических подхода:

1) изучение влияния тепловой обработки на геном вирусов с использованием метода ПЦР;

2) исследование их жизнеспособности на культуре клеток. При изучении геном вирусов влияния тепловой обработки иммуноглобулинов на в образцы растворов иммуноглобулина перед прогревом вносили материал, содержащий вирусы гепатитов В и С в высоких концентрациях. Затем опытные пробы прогревали при соответствующ

В данном разделе работы проведено изучение физико-химических и биологических свойств иммуноглобулинов при использовании для инактивации вирусов различных вариантов сольвент-детергентного метода и при обработке раствора препарата неспецифическими адсорбентами.

2.1. Сольееит-детергентный метод Сольвент-детергентный метод инактивации вирусов основан на разрушении вирусной оболочки растворителями и детергентами. В качестве растворителя традиционно используют безопасный и нелетучий три-Nбутилфосфат или трибутилфосфат (ТБФ), а выбор детергента зависит от поставленной задачи. Детергенты не должны обладать денатурирующим действием на белки, быть недорогими, доступными и легко извлекаемыми из растворов. Детергенты обычно подразделяют на два основных типа:

2.2. Изменение содерэ1сания нуклеиновых кислот после сольвент-детергентной обработки Для оценки изменения содержания нуклеиновых кислот образцы растворов иммуноглобулинов, предварительно тестированные методом ПЦР, контаминировали перед обработкой сыворотками крови, содержащими геномы вирусных гепатитов В и С в высоких концентрациях. После этого опытные пробы обрабатывали химическими реагентами при соответствующих режимах. После обработки тестировали контрольные и опытные образцы. Пол

2.3. Обработка иммуноглобулинов неорганическими адсорбентами Существует ряд неорганических веществ, которые используют при очистке белков и других макромолекул, - в основном это оксиды, нерастворимые гидроксиды, фосфаты. Это неспецифические адсорбенты. Особое место занимает гель гидроокиси алюминия, который используют обычно для адсорбции в жидких средах. Полагают, что сорбция избирательный характер за счет носит равномерного размещения связывающих центров на поверхности геля [Остерман Л.

2.4. Оценка эффективности элиминации вирусов адсорбентами Для оценки эффективности элиминации вирусов гелем гидроокиси алюминия готовили ряд растворов иммуноглобулина с 5%-ным содержанием белка. Опытные образцы растворов иммуноглобулинов контаминировали сыворотками крови, содержащими геномы вирусных гепатитов В и С. После этого во все образцы вносили гель гидроокиси алюминия из расчета 20, 50 и 150 мл на литр, перемешивали в течение 1 часа, затем центрифугировали в течение 10 мин при 2000 об