Диагностика катаральной лихорадки овец

Катаральная лихорадка овец (febris catarrhalis ovium) — инфекционная болезнь, проявляющаяся лихорадочным состоянием, воспалительно-некротическими поражениями пищеварительного тракта, языка и дегенеративными изменениями скелетных мышц.

Этиология.Возбудитель — РНК-геномный вирус — относится к семейству Reoviridae, роду Orbivirus. Диаметр частиц очищенного культурального вируса составляет 50-65 нм. Вирион имеет однослойный капсид, состоящий из 32 капсомеров. Вирусные частицы содержат 80 % белка и 20 % рибонуклеиновой кислоты. Последняя двухспиральная, фрагментированная (состоит из 10 фрагментов), не обладает инфекционностью и не чувствительна к РНК-азе.

Эпизоотологические данные.К катаральной лихорадке наиболее восприимчивы овцы, особенно молодые. Чувствительность их к вирусу зависит от породы. Мериносы и их помеси более чувствительны, каракульские и курдючные овцы малочувствительны. В стационарных очагах болезни чаще поражаются овцы привозных пород; местные более устойчивы. В лабораторных условиях удается заразить новорожденных мышей и хомячков, которым вводят вирус в мозг. К заболеванию восприимчивы крупный рогатый скот и козы, но у них болезнь протекает без клинических симптомов. Однако они могут выполнять роль резервуара вируса в межэпизоотический период. Для болезни характерна сезонность. Она проявляется в начале лета, обычно при высокой влажности, и исчезает с наступлением холодов; зимой не регистрируется. Самая высокая заболеваемость овец отмечается в жаркие дождливые месяцы. Болезнь регистрируется в болотистой местности, в районах, где выпадает много осадков. Обычно овцы заражаются во время пребывания на пастбищах ночью.

Неполноценное кормление, большая скученность в помещении, хронические инфекции, гельминтозы, солнечное облучение отягощают течение болезни.

Течение и симптомы.Инкубационный период болезни – 7-10 дней, при экспериментальном заражении – 2-18 дней.

У овец различают острое, подострое, хроническое течения и абортивную форму болезни.

Острое течение характеризуется внезапным или постепенным повышением температуры тела до 40,5-42°С. Через 1-2 дня после этого появляются гиперемия слизистых оболочек ротовой и носовой полостей, слюнотечение, истечения из носовой полости серозного или гнойного экссудата, засыхающего впоследствии корочкой. Развиваются отеки в области ушей, губ, иногда языка, межчелюстной области, распространяющиеся на шею и грудь. Губы становятся болезненными, нижняя губа сильно отвисает. На слизистой оболочке ротовой полости, имеются кровоизлияния, кровоточащие эрозии, язвы; вследствие некроза ткани исходит ихорозный запах изо рта. Опухший и воспаленный язык приобретает багровый или грязно-синий цвет и высовывается из ротовой полости. По этому признаку болезнь раньше называли синим языком. Нередко у больных животных искривляется шея выпадает шерсть, в тяжелых случаях появляется кровавый понос. Отсутствие аппетита, специфические мышечные поражения приводят к резкому истощению, слабости, глубокой астении.

При подостром и хроническом течениях болезни все симптомы развиваются медленно и выражены слабее. Характерно истощение животных, сухость и выпадение шерсти, поражение конечностей, сопровождающееся хромотой. Иногда отмечают спадение рогового башмака и бронхопневмонию, вызванные вторичной инфекцией. Длительность болезни при подостром течении 30-40 дней, при хроническом – до года. Выздоравливают животные медленно. Иногда после кажущегося выздоровления наступает смерть. Абортивная форма проявляется незначительным повышением температуры тела, быстро проходящей гиперемией слизистых оболочек ротовой полости. Другие симптомы болезни не развиваются. Такое течение болезни наблюдают у овец более устойчивых пород, У крупного рогатого скота и коз после вакцинации.

Диагноз.Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных клинических признаков, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований.

Выделение вируса (из крови, селезенки, лимфоузлов) проводят в культуре клеток почек ягнят или хомячков, в куриных эмбрионах, которых заражают внутривенно, а также на мышах при интрацеребральной инъекции.

Биопробу ставят на двух овцах, предварительно проверенных серологически на отсутствие комплементсвязывающих антител к вирусу катаральной лихорадки; им вводят внутривенно по 10 мл крови больного животного, суспензию, приготовленную из органов павших овец, или выделенный на культуре клеток или в куриных эмбрионах вирус, Характерным для катаральной лихорадки овец считается повышение температуры до 41 °С и выше на шестой — восьмой день после заражения с последующим развитием клинических признаков болезни. Во всех случаях выделение вируса подтверждают серологическими методами (РДП, ИФА, МФА, РСК, РН, РНГА).

Дифференциальный диагноз.Необходимо исключить ящур, контагиозный пустулезный дерматит (эктима), оспу, везикулярный стоматит, злокачественную катаральную лихорадку, некробактериоз

Лечениене разработано

Профилактика и меры борьбы.Переболевшие овцы приобретают пожизненный иммунитет к тому типу вируса, который вызвал болезнь. Возможна реинфекция другим типом вируса в течение того же сезона или на следующий год. Для профилактики применяют культуральную вакцину, в результате введения которой животное иммунно в течение года.

Ягнята, родившиеся от иммунных овец, обладают пассивным колостральным иммунитетом продолжительностью до трех месяцев.

Инфекционная катаральная лихорадка в Республике Беларусь не регистрируется. Основное внимание должно быть обращено на строгий контроль за ввозом животных.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Цель занятия.Овладеть методами диагностики катаральной лихорадки овец; познакомиться с особенностями течения этой болезни и организацией оздоровительных и профилактических мероприятий.

Материалы и оборудование:слайды, инструкция.

Место проведения занятия:аудитория кафедры эпизоотологии.

У беременных животных могут быть аборты и рождение уродливого потомства.

Возбудитель- РНК-геномный вирус - относится к семейству Reoviridae, роду Orbivirus. Серогруппа блютанга включает 24 серотипа

Диаметр частиц очищенного культурального вируса составляет 50-65 нм. Вирион имеет однослойный капсид, состоящий из 32 капсомеров. Вирусные частицы содержат 80 % белка и 20 % рибонуклеиновой кислоты. Последняя двухспиральная, фрагментированная (состоит из 10 фрагментов), не обладает инфекционностью.

В лабораторных условиях удается заразить новорожденных мышей и хомячков, которым вводят вирус в мозг. К заболеванию восприимчивы крупный рогатый скот и козы, но у них болезнь протекает без клинических симптомов. Однако они могут выполнять роль резервуара вируса в межэпизоотический период. Для болезни характерна сезонность. Она проявляется в начале лета, обычно при высокой влажности, и исчезает с наступлением холодов; зимой не регистрируется. Самая высокая заболеваемость овец отмечается в жаркие дождливые месяцы. Болезнь регистрируется в болотистой местности, в районах, где выпадает много осадков. Обычно овцы заражаются во время пребывания на пастбищах ночью. Переносчиками вируса являются мокрецы, овечья кровососка. Резервуаром вируса в природе считаются дикие животные и грызуны. Заражение трансмиссивным способом.

Течение и симптомы. Инкубационный период болезни – 7-10 дней, при экспериментальном заражении – 2-18 дней.

У овец различают острое, подострое, хроническое течения и абортивную форму болезни.

Диагноз. Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных клинических признаков, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований.

Лечение не разработано.

Иммунитет и специфическая профилактика. Переболевшие овцы приобретают пожизненный иммунитет к тому типу вируса, который вызвал болезнь. Возможна реинфекция другим типом вируса в течение того же сезона или на следующий год. Для профилактики применяют культуральную вакцину, в результате введения которой животное иммунно в течение года.

Профилактика и меры борьбы. Ввод жвачных в страну из энзоотически неблагополучных зон допускается в зимние месяцы и только после предварительного 30-дневного карантинирования. В это время у них исследуют кровь на реакцию связывания компонентов (далее - РСК).

После ввода животных их ставят на дальнейший 30-дневный карантин в стойла, где нет насекомых. Овец исследуют на РСК (реакция связывания комплементов), а их кровью прививают восприимчивых овец, мышат - сосунов и 8-дневных куриных эмбрионов. Биопробу повторяют еженедельно в течение 4 недель на лабораторных животных, на здоровых овцах вводя сборные пробы крови (не более чем от 5 животных) каждый раз 2 овцам. Если "Синий язык" установлен, то неблагополучную группу отправляют назад или убывают. Особое внимание уделяют борьбе с насекомыми в самолетах, на судах и других транспортных средствах, которые прибыли из неблагополучных стран.

В энзоотически неблагополучных государствах проводят ежегодно профилактическую вакцинацию.

Для профилактики болезни рекомендуется также скашивать траву в низинах, переводить животных на возвышенные участки или содержать ночью в помещениях, свободных от комаров, применять отпугивающие насекомых средства. В сезон болезни запрещают стрижку овец. При возникновении болезни больных овец метят, изолируют, лечат или убивают, остальных вакцинируют.

Содержание статьи

Историческая справка

Заболевание известно с конца позапрошлого столетия. Впервые болезнь была зарегистрирована и описана у мелкого рогатого скота в странах Южной Африки. Возбудитель был открыт в 1905 году. В 30-х годах прошлого века была доказана связь блютанга и сходного заболевания у крупного рогатого скота. Практически до середины ХХ века недуг считался исключительно проблемой стран материка, на котором был впервые обнаружен.

В последнее время, в основном в связи с импортом животных и продуктов овцеводства, получила широкое распространение. Регистрируется во многих странах, в Российской Федерации относится к карантинным болезням.

Сведения о вспышках заболевания периодически поступают с территории Франции, Германии, Нидерландов, Бельгии и других стран Европы.

При поступлении сведений об эпизоотии импорт животных и соответствующих животноводческих продуктов с территории неблагополучных стран ограничивают.

Частое бессимптомное течение заболевания дает ученым основания предположить более широкое распространение блютанга, чем принято считать. Проводимые исследования по выявлению специфических антител у животных во многих странах подтверждают эту догадку. В частности серологические доказательства циркуляции возбудителя болезни получены в Канаде, Мексике, Бразилии, Иране и ряде других, ранее считавшихся благополучными в отношении катаральной лихорадки овец, государствах.

Возбудитель и эпизоотологические данные

Причиной болезни овец является мелкий РНК-содержащий микроорганизм, относящийся к роду орбивирусов семейства реовирусов. Характерной для них является гексогональная форма и наличие рыхлой, нестойкой наружной оболочки. Накопление болезнетворного агента происходит в крови, внутренних органах зараженного животного. Отмечена передача вируса трансплацентарным путем.

Лабораторно вирус реплицируется в куриных зародышах, некоторых культурах клеток. Возможно искусственное заражение мышей и хомяков. К естественному заражению восприимчивы овцы, козы, меньше – КРС. Из диких животных болезнь отмечается у:

Основным путем передачи вируса считается трансмиссивный. Переносчиками вируса являются мелкие кровососущие семейства мокрецов, относящихся к компонентам гнуса. Именно этот факт определяет природно-очаговый характер заболевания, а также наличие необходимых условий для возникновения вспышки. К ним относят высокую температуру окружающей среды и повышенную влажность. Именно при наличии данных условий происходит массовый лет насекомых и заражение восприимчивых животных.

В холодное время года при отсутствии естественных переносчиков заболевание не возникает.

Вместе с тем в 1965 году была доказана возможность заражения овец большими дозами вируса алиментарным путем. Однако такие случаи если и возникают естественным путем, то носят единичный характер, не принимают форму эпизоотии.

К вирусу катаральной лихорадки восприимчивы овцы всех возрастов и пород вне зависимости от пола. Доказанным фактом является повышенная заражаемость мериносных пород и большая восприимчивость молодняка. У взрослых животных болезнь зачастую принимает атипичные формы, не вызывающие подозрения в развитии именно данного недуга.

У КРС болезнь протекает легко, чаще всего скрытно. Согласно данным ветеринаров США клинически заболевание проявляется менее чем у 5% зараженных коров. Скрытное течение болезни у крупного рогатого скота приводит к возникновению очага болезни, быстрому ее распростанению среди овец, находящихся в пределах данной местности. Кроме крупных жвачных естественным резервуаром возбудителя являются дикие животные. Отсутствие клиники и длительное (порядка 3 лет) существование возбудителя в их крови помогает микроорганизму пережить межэпизоотический интервал.

Симптоматика

Период инкубации при естественном заражении длится порядка недели. При искусственном заражении составляет 2-18 дней. После окончания периода инкубации проявляются клинические признаки недуга. В зависимости от количества вирусов, попавших в кровь овцы, состояния ее иммунитета, заболевание способно развиться в одной из возможных форм:

Острая форма является наиболее показательной в плане проявления клинических признаков. Прежде всего, отмечается резкое повышение температуры до значений 41-42°С (при норме 38,5-40°С у взрослых животных). В течение 1-2 суток развивается катаральное воспаление слизистых ротовой и носовой полости, характеризующееся гиперемией слизистых, слюнотечением, истечениями из носа, затрудненным дыханием, сопровождающимся сопением и фырканьем.

Вслед за этим развиваются отеки губ, языка, области ушей. В ротовой полости на губах возникают кровоизлияния и изъязвления. Присоединение секундарной микрофлоры приводит к развитию гнойного воспаления, заметному неприятному запаху из ротовой полости животного. Губы отвисают, отекший язык багрово-синюшного цвета высовывается изо рта.

Отмечаются расстройства пищеварительного тракта, резкое исхудание, иногда выпадение шерсти.

Смерть наступает на фоне общей слабости и истощения.

Подострая и хроническая формы развиваются сходным образом, при меньшей выраженности симптомов, более медленном их развитии. Абортивная форма характеризуется бессимптомным течением, удовлетворительным общим состоянием и зачастую заканчивается самоизлечением.

Выздоровевшие некоторое время остаются вирусоносителями, в дальнейшем возбудитель элиминируется из крови, развивается стойкий иммунитет к тому типу возбудителя, которым животное было заражено.

Лечение и профилактика

Специфическое лечение при блютанге не разработано. Больных овец отправляют на убой. В случае высокой продуктивной либо племенной ценности и целесообразности сохранения животных с клиническими признаками располагают в отдельном помещении, улучшают условия содержания и кормления. Применяют симптоматическую терапию, направленную на улучшение общего состояния. Выпас больных животных запрещают, поскольку ультрафиолетовое облучение провоцирует усугубление патологического процесса. Определенной терапевтической активностью при блютанге обладают препараты, имеющие в своем составе соединения мышьяка.

Основой борьбы с недугом является строгое соблюдение карантинных мер при ввозе животных. Вновь прибывших карантинируют в течение 30 суток. Запрещается ввоз поголовья и отдельных особей из неблагополучных регионов.

При возникновении вспышки запрещается выпас в вечернее время (в период массового лета гнуса).

Проводятся мероприятия по осушению заболоченных местностей в непосредственной близости от выпасов, а также борьба с насекомыми с помощью инсектицидов и защите мелкого рогатого скота с применением репеллентов.

Восприимчивое поголовье подвергают активной иммунизации с применением живых и инактивированных вакцин против блютанга. Вакцинацию производят один раз в год перед выгоном на пастбище. Ягнята до трехмесячного возраста, полученные от переболевших и иммунизированных матерей, имеют колостральный иммунитет.

КАТАРАЛЬНАЯ ЛИХОРАДКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ОВЕЦ И КОЗ

1.7. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КАТАРАЛЬНОЙ ЛИХОРАДКИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ОВЕЦ И КОЗ

УТВЕРЖДЕНЫ 11 июня 1986 г., N 432-5

1. Общие положения

1.1. Лабораторные методы исследования на катаральную лихорадку крупного рогатого скота, овец и коз включают в себя следующие:

- патогистологическое исследование;

- выделение вируса на культуре клеток и куриных эмбрионах с последующей идентификацией в реакции иммунофлуоресценции (ИФ);

- выявление группоспецифических антител в сыворотках крови больных или переболевших животных в РДСК, РДП;

- постановку биологической пробы на овцах (в сомнительных случаях).

Выделение и идентификацию вируса, исследования сывороток крови животных ветеринарные лаборатории проводят группоспецифическими методами. Окончательное титрование вируса по 23 серологическим вариантам в реакции нейтрализации проводят во Всесоюзном научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВиМ).

1.2. В лабораторию для исследования на катаральную лихорадку направляют:

- кусочки селезенки и лимфатические узлы от павших или убитых животных в свежем виде или консервированные 30%-ным раствором глицерина, приготовленным на фосфатно-буферном растворе (рН 7,2. 7,4);

- пробы крови от больных животных, взятые в период температурной реакции во флаконы в количестве 10 мл, пробы стабилизируют равным объемом антикоагулянта - раствором Эдингтона следующего состава: щавелевокислый калий - 5 г, карболовая кислота - 5 г, глицерин - 500 мл, дистиллированная вода - 500 мл;

- кусочки скелетных мышц, сердца, языка, губ, стенок книжки и рубца, фиксированные 10%-ным раствором формалина для патологогистологического исследования, а также нефиксированные кусочки лимфатических узлов, селезенки, легких, печени и почек с надпочечниками;

- сыворотку крови для серологических исследований от больных или переболевших животных в количестве 2. 3 мл.

Патологический материал для вирусологических исследований отбирают не позднее, чем через два часа после гибели животных, в стерильные флаконы или пробирки и доставляют в лабораторию в термосе со льдом.

Сыворотку крови для серологических исследований можно сохранять при температуре -20°С и ниже. Консервирование сывороток химическими реактивами не допускается.

2. Патологогистологическое исследование

2.1. Для гистологического исследования готовят парафиновые срезы из фиксированных 10%-ным раствором формалина кусочков скелетных мышц, сердца, языка, губ, стенок книжки и рубца и окрашивают гематоксилин-эозином.

Для выявления внутриклеточных цитоплазматических включений берут кусочки лимфатических узлов, селезенки, легких и почек с надпочечниками, фиксируют их в жидкости Карнуа (спирт этиловый - 60 мл, хлороформ - 30 мл, ледяная уксусная кислота - 10 мл) и заливают в парафин. Срезы окрашивают метиловым зеленым - пиронином или ШИК-реакцией.

При исследовании гистологических препаратов необходимо иметь в виду, что в случае заболевания животных катаральной лихорадкой обнаруживают резко выраженные поражения микроциркуляторного русла в скелетных мышцах и мышечных волокнах сердца, языка, губ - колбовидное набухание, гомогенизацию, губчатый распад, лизис и некроз; в межмышечной соединительной ткани - сильный отек, кровоизлияния и лимфоидно-гистиоцитарный инфильтрат; в стенках книжки и рубца - некроз покровного эпителия и основы слизистой оболочки, а также отек, диффузные кровоизлияния и лимфоидный инфильтрат в соединительной ткани подслизистого слоя.

При окраске специальными методами срезы просматривают под микроскопом с иммерсионной системой, причем в цитоплазме ретикулярных клеток и макрофагов лимфатических узлов и селезенки, в клетках легких, печени, почках и надпочечников могут быть найдены цитоплазматические включения округлой или овальной формы красного цвета (метод Браше), пурпурного или лилово-красного (ШИК-реакция). Часто обнаруживают значительное уменьшение количества лимфоцитов в селезенке и лимфатических узлах (опустошение).

2.2. По обнаруженным характерным патологогистологическим изменениям и тельцам-включениям ставят предварительный диагноз на катаральную лихорадку овец.

3. Вирусологическое исследование

3.1. Подготовка материала к исследованию

3.1.1. Для проведения исследований из патологического материала (селезенки, лимфатических узлов) готовят 10%-ную суспензию на фосфатном буферном растворе (рН 7,4. 7,6) или на питательной среде с 0,5% гидролизата лактальбумина, к которой добавляют 1000 ЕД пенициллина и 500 мкг стрептомицина на 1 мл. Патологический материал, консервированный глицерином, предварительно отмывают в фосфатном буферном растворе (рН 7,4. 7,6).

Приготовленную суспензию центрифугируют 30 мин при 2000. 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в стерильную пробирку, помещают в холодильник и выдерживают при 2. 4°С в течение 3. 4 ч. Затем делают высевы на питательные среды (МПБ, МПА) для исключения бактериального загрязнения.

Через сутки, при отсутствии роста микрофлоры на питательных средах, надосадочную жидкость используют для заражения клеточных культур и куриных эмбрионов.

3.1.2. Пробы крови с антикоагулянтом центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. Осадок эритроцитов трижды промывают стерильным физиологическим раствором (рН 7,2. 7,4), затем готовят 20%-ную суспензию эритроцитов на фосфатном буферном растворе (рН 7,4. 7,6) для заражения культур клеток и куриных эмбрионов.

3.2. Выделение вируса на культуре клеток

3.2.1. Выделяют вирус на первично-трипсинизированной культуре клеток почки ягнят (ПЯ) или перевиваемой линии клеток ВНК-21.

3.2.2. В матрасы на 100 мл (не менее 5) с культурой клеток ПЯ или ВНК-21 после удаления ростовой среды вносят 2. 3 мл суспензии исследуемого материала и равномерно распределяют ее по монослою клеток.

Матрасы помещают в термостат на 1 ч при 37°С, после чего вносят поддерживающую среду в количестве 10. 15 мл (для культуры клеток ВНК-21 - среду Игла с двойной концентрацией аминокислот; для ПЯ - 0,5%-ный раствор гидролизата лактальбумина без сыворотки).

Контролем служат матрасы с незараженной культурой клеток, в которых ростовая среда заменена поддерживающей.

3.2.3. Матрасы, зараженные исследуемым материалом, и контрольные помещают в термостат при 37°С. Для учета цитопатического действия вируса (ЦПД) проводят ежедневно микроскопическое исследование клеточных культур в течение 7 дней.

3.2.4. Цитопатическое действие вируса в культуре клеток ВНК-21 можно обнаружить через 36. 40 ч по наличию округлых клеток, с последующим разрушением всего монослоя. ЦПД вируса в культуре клеток ПЯ проявляется на 6. 7-й день зернистостью, округлением клеток, образованием тяжей, отслоением клеток от стекла.

В контрольных незараженных культурах цитопатические изменения должны отсутствовать.

3.2.5. При выявлении в культурах ЦПД отбирают из матрасов культуральную жидкость в объеме 0,4 мл для заражения монослоя клеток аналогичной культуры, выращенных на стеклянных пластинках (стеклышках), в пробирках или пенициллиновых флаконах. После выдерживания зараженных культур в термостате при 37°С в течение 72 ч стеклышки извлекают, высушивают на воздухе, фиксируют 10 мин в охлажденном при температуре -20°С ацетоне и используют для идентификации вируса в иммунофлуоресценции.

3.2.6. При отсутствии цитопатического действия вируса (ЦПД) проводят два последовательных пассажа в аналогичной клеточной культуре.

3.3. Выделение вируса на куриных эмбрионах

3.3.1. Для выделения вируса на куриных эмбрионах (КЭ) суспензию исследуемого материала (см. п.3.1) вводят 8. 9-дневным КЭ в желточный мешок в дозе 0,2. 0,3 мл или 13. 14-дневным КЭ внутривенно в дозе 0,1. 0,2 мл. Каждым материалом заражают не менее 5 эмбрионов.

3.3.2. Зараженные куриные эмбрионы помещают в термостат при 33,5°С и выдерживают в течение 5 дней. В этот период эмбрионы овоскопируют два раза в сутки. Куриные эмбрионы, погибшие в течение первых 24 ч, уничтожают (неспецифическая гибель), остальные эмбрионы после гибели и все оставшиеся живыми на 5-е сутки после заражения охлаждают в холодильнике 2. 4 ч при 2. 4°С, затем их вскрывают и исследуют зародыш на наличие макроскопических изменений. Характерными для возбудителя катаральной лихорадки является вишнево-красная окраска погибших куриных эмбрионов с многочисленными кровоизлияниями на голове и туловище.

3.3.3. Для идентификации выделенного вируса готовят 10%-ную суспензию из эмбрионов (без головы) и заражают клеточные культуры (см. п.3.2.5).

3.3.4. При сохранении жизнеспособности эмбрионов или отсутствии характерных изменений у погибших проводят два последовательных пассажа на КЭ, используя 10%-ную суспензию (см. п.3.3.3).

3.4. Идентификация вируса

3.4.1. Для идентификации вируса пользуются прямым и непрямым методом иммунофлуоресценции.

3.4.2. При прямом методе на стеклянные пластинки (стеклышки) с зараженной культурой клеток наносят специфическую флуоресцирующую сыворотку в рабочем разведении. Препараты помещают во влажную камеру на 30 мин при 37°С, затем их промывают в двух сменах фосфатного буферного раствора по 10 мин.

В качестве контроля окрашивают стеклышки с незараженной культурой клеток.

3.4.3. При непрямом методе на стеклышки с зараженной культурой клеток наносят специфическую (немеченую) сыворотку катаральной лихорадки в рабочем разведении. Для контроля на часть препаратов наносят нормальную сыворотку овцы.

Препараты помещают во влажную камеру и выдерживают в термостате 30 мин при 37°С, затем дважды их промывают физиологическим раствором (рН 7,2. 7,4) по 10 мин и после подсушивания наносят антивидовую флуоресцирующую сыворотку в рабочем разведении. Окрашивают их во влажной камере 30 мин при 37°С. После промывания препаратов в двух сменах фосфатного буферного раствора (рН 7,2. 7,4) их подсушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе.

3.4.4. При положительном результате в препаратах обнаруживают ярко светящиеся зелено-желтым цветом гранулы, конгломераты в цитоплазме и перинуклеарной зоне или такой же интенсивности диффузное свечение всей или большей части цитоплазмы.

В контрольных препаратах аналогичное свечение должно отсутствовать.

3.4.5. Метод иммунофлуоресценции является группоспецифическим и им может быть идентифицирован любой возбудитель из 23 серологических антигенных вариантов.

Для окончательного установления типа возбудителя применяют реакцию нейтрализации (во ВНИИВВиМ).

4. Биологическое исследование

4.1. Для постановки биологической пробы используют овец породы "прекос" 6. 8-месячного возраста из хозяйства, благополучного по инфекционным болезням.

Перед заражением исследуют сыворотку крови овец на наличие антител к вирусу катаральной лихорадки в РДСК и РДП.

4.2. Биопробу ставят на двух овцах, которым вводят суспензию исследуемого материала внутривенно в дозе 10 мл.

4.3. Результаты биологического исследования считают положительными в случае повышения температуры (до 41. 42°С) у овец на 5. 7-й день после заражения; появления гиперемии слизистых оболочек рта и носа, отека губ, языка; эрозии в уголках губ, на деснах, языке; угнетения; поражения конечностей; цианоза слизистых оболочек и языка у отдельных овец, выпадения шерсти.

4.4. При отсутствии характерных клинических симптомов заболевания катаральной лихорадкой от зараженных овец берут пробу крови в период температурной реакции (или на 5. 7-е сутки после заражения) для выделения вируса на культуре клеток (см. п.3.2) и через 2. 3 недели после заражения исследуют сыворотки крови в РДСК, РДП для обнаружения специфических антител.

5. Серологическая диагностика

5.1. Реакция длительного связывания комплемента (РДСК) и реакция диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП) - групповые специфические методы, применяемые для обнаружения антител к вирусу катаральной лихорадки в сыворотке крови овец, коз и крупного рогатого скота, переболевших данной болезнью (ретроспективная диагностика).

У крупного рогатого скота серологическая реакция на вирус может быть слабой, поэтому при постановке РДСК антиген берут в меньшем разведении.

5.2. Реакция длительного связывания комплемента

5.2.1. Компоненты реакции:

- сыворотки испытуемые и контрольные (специфическая и контрольная);

- антигены - специфический и нормальный;

- эритроциты барана - 2%-ная взвесь;

- гемолитическая сыворотка (гемолизин) биофабричного производства;

- комплемент - биофабричного производства или свежая сыворотка морской свинки;

- 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия на дистиллированной воде, рН 7,2. 7,4.

5.2.2. Подготовка компонентов реакции

Испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором в отношении 1:8, контрольные - до рабочего разведения, указанного на этикетке. Разведенные сыворотки мелкого рогатого скота инактивируют 30 мин при 60°С, крупного рогатого скота - при 58°С.

Проросшие и гемолизированные сыворотки для исследования непригодны.

Специфический и нормальный антигены разводят физиологическим раствором до объема, указанного на этикетке. При исследовании сывороток крупного рогатого скота рабочее разведение антигенов в два раза ниже указанного на этикетке.

Эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500. 3000 об/мин в течение 10 мин до полной прозрачности надосадочной жидкости и готовят 2%-ную взвесь из осадка.

Гемолизин используют в четырехкратном титре. Так, при титре гемолизина 1:3000 его рабочее разведение 1:750.

Для приготовления гемолитической системы гемолизин в рабочем разведении смешивают с равным объемом 2%-ной взвеси эритроцитов и выдерживают 20. 30 мин при комнатной температуре.

Комплемент титруют в гемолитической системе перед каждой постановкой реакции. Для этого берут 10 пробирок. В первую вносят 5,4 мл, а в остальные по 1 мл физиологического раствора. Затем в первую пробирку добавляют 0,6 мл разведенного до первоначального объема комплемента, хорошо перемешивают и переносят 5 мл во вторую пробирку, из второй - 5 мл в третью и т.д. Получают ряд последовательных разведений комплемента от 1:10 до 1:51,5. Для определения титра комплемента из каждого его разведения переносят по 0,1 мл в соответствующую пробирку основного ряда.

Схема приготовления разведений и титрования комплемента дана в таблице 12*.
________________

* Нумерация рисунков и таблиц сквозная по всему тексту Сборника. - Примечание изготовителя базы данных.

Титром комплемента считают наибольшее его разведение, дающее полный гемолиз эритроцитов. Рабочее разведение соответствует разведению комплемента в четвертой пробирке влево от последней пробирки с полным гемолизом. В приведенном примере титр комплемента - 1:29,8; рабочее разведение для главного опыта - 1:14,4.

Расчет количества чистого комплемента, необходимого дли постановки главного опыта, делают по формуле

где А - доза комплемента для главного опыта; В - количество пробирок главного опыта; С - рабочее разведение комплемента.

Схема разведения и титрования комплемента

Читайте также: