Выявление днк возбудителей бактериальных инфекций не может свидетельствовать об их жизнеспособности

За звучной аббревиатурой ПЦР скрывается сложная и не слишком понятная для рядового пациента расшифровка — полимеразная цепная реакция. Что же такое ПЦР-диагностика, на чем она основана и почему в последнее время ее стали считать самой перспективной технологией в постановке диагнозов, касающихся инфекционных и вирусных заболеваний? Мы расскажем о преимуществах ПЦР-метода, его особенностях и этапах проведения.

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

• Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
• Высокая специфичность метода . Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
• Высокая чувствительность . При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
• Универсальность . Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
• Скорость получения результатов . Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
• Диагностика латентных инфекций . ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

• Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма . При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
• Возможность возникновения перекрестной реакции . Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
• Изменчивость микроорганизмов . Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

1. Забор биоматериала . Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
   • Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
   • Моча . Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
   • Мокрота . Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
   • Кровь, сыворотка, плазма . С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
   • Биологические жидкости . К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
   • Биоптаты , т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм 3 .
2. Хранение и транспортировка биоматериала . Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
3. Выделение ДНК из образца . Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
4. Проведение ПЦР . Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные , включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные , не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
5. Регистрация результатов . Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
6. Интерпретация результатов исследования . Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Цена ПЦР-диагностики зависит от того, на какую конкретно инфекцию пациент планирует проверяться, от вида анализируемого материала, методики тестирования — качественной или количественной. Цена за определение одной инфекции составляет от 200 до 800 рублей в разных клиниках. Кроме того, к стоимости анализа добавится и плата за забор биоматериала — около 400 рублей. Средняя стоимость ПЦР-диагностики разных видов приведена в таблице 1.

Таблица 1 . Примерные цены на анализы ПЦР в Москве

Название анализа	Цена, руб.
Определение ДНК хламидия	750
Определение ДНК микоплазмы хоминис	540
Определение микоплазмы гениталиум	350
Определение ДНК уреаплазмы	350
Гонококк, определение ДНК	350
Определение ДНК герпеса (разные типы)	350–600
Определение ДНК кандиды	570
Вирус краснухи, определение РНК	800
Дифференцированное определение ДНК ВПЧ (разные типы)	350–1900 [1]

[youtube.player]

Возможность ПЦР-диагностики инфекций мочевыводящих путей, вызванных бактериальными возбудителями.

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) продолжают оставаться одними из самых распространенных бактериальных инфекций человека. Наиболее частыми возбудителями являются Escherichia coli, реже встречаются другие представители семейства Enterobacteriaceae, бактерии родов Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Acinetobacter. Роль грамположительной флоры увеличивается при развитии хронических заболеваний или госпитальных инфекций. Более чем у 20% больных наблюдается ассоциация микробов, при этом грамотрицательные бактерии чаще сочетаются с грамположительными (например: E. сoli и E. faecalis).

ИМП у женщин встречаются гораздо чаще, чем у мужчин, что обусловлено анатомическим строением мочевыделительной системы. В год в среднем 8–15% взрослых женщин страдают от ИМП, тогда как встречаемость ИМП у мужчин той же возрастной группы примерно 1% в год. Серьезную проблему представляет ОИМП (осложненные инфекции мочевыводящих путей), к которым относятся заболевания, характеризуемые наличием функциональных или анатомических патологий в организме. Пациенты, страдающие ОИМП, более остальных склонны к быстрому развитию инфекционного процесса, который, в свою очередь, требует принятия быстрого решения о назначении адекватной терапии.

Диагноз ИМП ставится на основании клинических симптомов и результатов лабораторной диагностики. В качестве методов диагностики ИМП в клинических лабораториях используют проточные цитометры, микроскопию с окрашиванием по Граму, микробиологические методы исследования мочи. Посев мочи на наличие бактерий остается референсным методом исследования, давая представление о качественном и количественном составе микрофлоры, а также чувствительности выделенного микроорганизма к антибиотикам. Однако, данный метод является достаточно длительным и трудоемким, помимо того существует ряд возбудителей (анаэробная флора, L-формы микроорганизмов), культивирование которых представляет особенную сложность и часто не доступно для клинических лабораторий.

С диагнозом ИМП в микробиологическую лабораторию для рутинной обработки поступает большое количество анализов, требующих разработки и применения быстрых и чувствительных методов обнаружения бактерий в моче. В первую очередь это относится к таким группам пациентов, как беременные, пациенты с бессимптомной бактериурией, дети. Для сокращения времени выдачи результатов актуальной задачей является разработка нового скринингового метода, который позволит быстро выявить отрицательные образцы мочи и даст представление о видовом составе патогенов в исследуемом материале. В этой связи наиболее перспективным выглядит метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет быстро и точно проводить идентификацию бактерий путем анализа генетического материала микроорганизмов.

Целью данной работы была оценка возможности нового скринингового метода идентификации патогенов в моче путем количественной ПЦР в режиме реального времени и сравнение полученных результатов с микробиологическими методами исследования.

Материалы и методы

Микробиологические исследования. Образцы мочи поступали в микробиологическую лабораторию для посева на микрофлору. Посев производили на неселективную среду Уриселект 4 (Bio-Rad, США) для изолирования и подсчета микроорганизмов из мочевого тракта; прямой идентификации E. coli (розовые колонии), Enterococcus spp (синие колонии), Proteus mirabilis (коричневые колонии); предварительной идентификации KES-группы (Klebsiella, Enterobacter, Serratia). Также посев производили на 5% кровяной агар для выделения бактерий рода Streptococcus и определения гемолитических свойств микроорганизмов.

Культивировали при 37 °С в течение 24 часов при аэробных условиях. Выросшие бактерии, количество которых на чашке превышало 10*4 КОЕ/мл, считались возбудителями инфекции. При наличии роста проводили идентификацию выросших микроорганизмов методом MALDI ToF масс-спектрометрии с применением анализатора Autoflex III Smartbeam (Bruker Daltonics, Германия)и программного пакета MALDI Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics, Германия).

Количественная ПЦР в режиме реального времени. Для определения концентрации микробной ДНК в исследуемом образце использовали плазмидные конструкции с клонированной последовательностью целевого продукта ДНК соответствующего возбудителя, растворенные в ТЕ-буфере (10mM Tris-HCl, pH 8,0; 1mM EDTA). Количество копий (геном-эквивалентов) плазмидной ДНК в стоковом растворе соответствовали концентрации 10*10 копий/мл. Затем путем 10-кратных разведений были приготовлены растворы с концентрацией ДНК 10*8—10*2 копий/мл, которые использовали для построения калибровочных кривых. Постановку ПЦР и интерпретацию полученных данных проводили на приборе iCycler IQ5 (BioRad, США) по следующей программе: 94 °С – 1,5 минуты, затем 40 циклов: 95 °С – 10 секунд (денатурация), 64 °С – 11 секунд (отжиг праймеров), 72 °С – 20 секунд (элонгация). Детекция продуктов прибором осуществляется автоматически в каждом цикле амплификации. На основе этих данных управляющая программа строит кривые накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных для образцов каналу. Для расчета количества геном-эквивалентов соответствующих микроорганизмов в клинических образцах параллельно проводили реакцию амплификации с калибровочными образцами в концентрации от 10*8 до 10*2 копий/мл гена 16S rRNA.

Перерасчет количества геном-эквивалента в анализируемых образцах проводили с учетом копийности гена 16S rRNA для каждого детектируемого микроорганизма: Enterococcus sp, Streptococcus sp , Pseudomonas aeruginosae – 4 копии гена, Staphylococcus aureus – 5 копий, E. coli, Proteus sp, Serratia sp – 7 копий и Enterobacter sp – 8 копий гена. Все образцы, цикл выхода которых был ниже 35, считались отрицательными. По завершении всех действий программа автоматически рассчитывает точки пересечения кривых накопления флуоресцентного сигнала каждого образца с пороговой линией, строит калибровочную кривую и рассчитывает концентрацию ДНК в исследуемых образцах.

Результаты

Согласно результатам микробиологических посевов в 95 образцах мочи (95/200, 47,5%) роста микроорганизмов не наблюдалось, в 70 образцах (70/200, 35%) обнаружен один бактериальный возбудитель. В 35 образцах мочи (35/200, 17,5%) выявлены полимикробные инфекции, из них в 7 образцах (7/35, 20%) обнаружено более двух патогенов. В случаях мономикробной инфекции наиболее часто выявлялись Escherichia coli (27/70, 38,6%), Enterococcus faecalis (20/70, 28,6%) и Enterococcus faecium (8/70, 11,4%). В 4,3% (3/70) единственным выявленным возбудителем были коагулазонегативные стафилококки, в 2,9% (2/70) — Streptococcus spp. Бактерии KES-группы (Klebsiella, Enterobacter, Serratia) в моноинфицированных образцах обнаруживались в 10% случаев (7/70). В оставшихся образцах 4,3% выделенных возбудителей пришлось на долю Candida spp (2/70, 2,9%) и Pseudomonas mosselii (1/70, 1,4%). Среди образцов с полимикробными инфекциями в случаях выявления двух возбудителей доминировало сочетание E. сoli и E. faecalis (11/35, 31,4%). В 6 случаях обнаруживались сочетания бактерий E. coli/K. pneumonia (4/35, 11,4%), и E . faecаlis /Streptococcus spp. (2/35, 5,7%). При выявлении трех и более возбудителей сочетание E. coli / E. faecalis /Staphylococcus spp. было наиболее часто встречаемым (3/7, 42,9%).

Результаты ПЦР. Методом количественной ПЦР в режиме реального времени в 123 образцах (123/200, 61,5%) возбудителей не обнаружено. Из 77 положительных образцов (77/200, 38,5%) один бактериальный возбудитель выявлен в 48 образцах мочи (48/77, 62,3%), два возбудителя — в 16 образцах (16/77, 20,8%), три и более — в 13 образцах (13/77, 16,9%). Среди мономикробных образцов мочи согласно результатам ПЦР бактерии E. coli детектированы в 28 образцах (28/48, 58,3%), в 10 образцах (10/48, 21,8%) обнаружены бактерии рода Enterococcus, в 8 — бактерии группы KES (8/48, 16,7%), в 1 — Staphylococcus aureus (1/48, 2,1%), в 1 – Pseudomonas aeruginosa (1/48, 2,1%). При полимикробных инфекциях методом ПЦР сочетания E. coli и бактерий рода Enterococcus выявлены в 6 образцах (6/16, 37,5%). Сочетания E. coli и бактерий родов Enterobacter/Klebsiella, а также Enterobacter spp/Klebsiella spp и Enterococcus spp обнаруживались с одинаковой частотой – 3/16, 18,75%. При выявлении трех возбудителей одновременно доминирующим сочетанием было E. coli/Enterococcus spp/(Enterobacter spp/Klebsiella spp) – 7/13, 53,8%.

Обсуждение результатов

В последнее время появляется все больше информации об успешном применении метода ПЦР в качестве быстрой диагностики заболеваний, причиной которых являются бактериальные возбудители. В представленном исследовании рассмотрена возможность применения количественной ПЦР в режиме реального времени для быстрого обнаружения патогенов в моче пациентов с ИМП и бактериурией. Сравнение нового скринингового и традиционного культурального методов исследования мочи показало как сравнительное преимущество, так и ограничения в применимости обоих методов.

Основным недостатком стандартного бактериологического метода диагностики является длительность его исполнения, иногда превышающая 48 часов. В связи с долгосрочностью анализов зачастую пациентам назначается эмпирическая, часто неадекватная антибактериальная терапия либо до получения результатов идентификации патогена в моче, либо вообще без проведения каких-либо процедур, направленных на выявление возбудителя, а также установления его лекарственной чувствительности. Подобная терапия может увеличивать риск развития осложнений. Например, проведенные ранее исследования доказали, что каждый час задержки адекватной противобактериальной терапии пациентов с септическим шоком снижает уровень выживаемости на 8 %. Особенно критично данное положение у пациентов пожилого возраста, детей и лиц с иммунодефицитом.

В сравнении с культуральным методом получение результатов идентификации патогенов методом ПЦР занимает 4–5 часов, что может способствовать раннему назначению этиотропного лечения.

Важным критерием для постановки правильного диагноза является точность идентификации и подсчет количества микроорганизмов в клиническом материале. При подозрении на ИМП и бактериурию нередко в моче обнаруживается полиинфекция. Культуральный метод с применением селективных сред при полимикробной инфекции не лишен погрешностей в связи с невозможностью подбора оптимальных условий культивирования всех возбудителей инфекции, а проведение дополнительных биохимических тестов для определения видовой принадлежности бактерии является процессом трудоемким, дорогостоящим и долговременным.

Enterobacteriaceae. При дальнейшем исследовании культура была идентифицирована как Escherichia coli в первом случае и Klebsiella pneumoniae во втором методом масс-спектрометрии.

Традиционно, клинически значимым количеством патогенов в моче является 10*4 КОЕ/мл. В последние годы согласно рекомендациям Американского Сообщества Микробиологов (ASM, American Society for Microbiology) и European urinalysis guideline количество патогенов в моче ≥103 КОЕ/мл может интерпретироваться как причина возникновения ИМП или бактериурии, особенно если в моче присутствуют грамотрицательные бактерии (E. coli, Enterobacter spp, P. mirabilis, P. aeruginosa, Serratia marcescens, K. pneumoniae и др.). Мы также проверили значимость полученных данных, принимая во внимание содержание клеток в моче от 10*3 КОЕ/мл и выше.

Более значимые изменения в результатах наблюдались при исследовании полимикробных образцов с учетом снижения порога до 10*3. Частота обнаружения ДНК E. coli в смешанных образцах возросла с 21 до 29, тогда как результаты микробиологических посевов мочи не изменились. Значительно увеличилось количество детектированных бактерий рода Enterococcus (с 22 до 34 методом ПЦР), Enterobacter spp и Klebsiella spp (с 16 до 25 методом ПЦР) в полимикробных пробах. Также почти в 2 раза возросла частота обнаружения бактерий рода Serratia (с 3 до 7).

В 29 образцах при отсутствии роста микроорганизмов на питательных средах методом ПЦР-диагностики дополнительно было выявлено 42 патогена в количестве 10*3 – 10*4 геном-эквивалентов/мл. Из них 13 были мономикробные образцы и 16 - полимикробные. Среди моноинфицированных проб чаще всего выявляли представителей семейства Enterobacteriaceae (3 E. coli, 6 бактерий KES-группы), энтерококки детектировали в 3 случаях, стрептококки — в 2 случаях, P. aeruginosa – 1, и S. aureus – 1. При анализе 16 полимикробных образцов мочи дополнительно методом ПЦР выявлены бактерии семейства Enterobacteriaceae (E. coli – в 4 случаях, бактерии группы KES – в 9), Enterococcus spp – в 6 случаях, P. aeruginosa — в 3, S. aureus – в 2, Proteus spp — в 1 и стрептококки – в 1. Согласно данным, представленным в ASM

Опираясь на количественные данные, мы сопоставили количество КОЕ/мл, полученные при культуральном методе идентификации, и количество геном-эквивалентов/мл каждого микроорганизма, полученных при пересчете данных после ПЦР. В 11 случаях количество геном-эквивалентов E. coli в мл превышало количество КОЕ, выросших на чашках, на 1,5–2 порядка, других патогенов семейства Enterobacteriaceae — в 9 пробах, энтерококки — в 8 образцах мочи, Proteus spp — в 2, S. aureus и P. aeruginosa – в 1. Мы полагаем, что подобные результаты могут быть получены вследствие начала приема антибактериальных препаратов, назначенных до сдачи мочи на анализ и получения результатов выделения патогенов в моче. При наличии инфекции прием антибактериальных препаратов приводит к уменьшению количества заселяющих мочевыводящий тракт микроорганизмов, вследствие чего титр жизнеспособных клеток в моче при микробиологическом посеве будет ниже. Так как при выделении ДНК все бактериальные клетки подвергаются лизису, количество геном-эквивалентов рассчитывается, исходя из тотального количества ДНК в пробе, что не отражает жизнеспособности бактерий. Принимая во внимание, что моча является достаточно агрессивной средой, не пригодной для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов, количество мертвых клеток в моче могло увеличится также вследствие несоблюдения правил хранения и транспортировки проб мочи с момента взятия материала до момента проведения анализа. Полагая, что бактерии могли погибнуть в моче вследствие длительной транспортировки или при неправильном хранении пробы, можно ожидать, что первоначальный титр жизнеспособных клеток в моче был выше, что дает основания рассматривать результаты ПЦР как истинные, а результаты посевов как ложноотрицательные или заниженные. Особенно актуальным остается этот вопрос при выявлении грамотрицательной флоры. В 12 образцах при наличии роста микроорганизмов на питательных средах методом ПЦР искомых патогенов обнаружено не было. В 8 случаях преобладала грамположительная флора: в 1 полимикробной пробе мочи, поступившей от беременной, были детектированы 2 патогена в количестве 10*4 КОЕ/ мл: E. faecalis и Streptococcus agalactiae, у 6 пациентов обнаружен энтерококк в титре от 10*4 до 10*5, в 2 пробах детектированы S. agalactiae 10*5 КОЕ/ мл.

[youtube.player]

В первую очередь давайте договоримся о терминах, то есть о том, что мы с вами будем понимать под тем или иным определением. Итак, что такое инфекция?

Мы, люди, живем в большом мире, который принято называть макромиром. Наши возможные попутчики по жизни - микроорганизмы освоили для себя микромир. Результат нашей с ними встречи и носит название инфекционного заболевания. Микробы, бактерии, вирусы, грибы, простейшие и прочие атакуют человеческий организм, что вызывает его естественное сопротивление, которое мы наблюдаем в виде разнообразных жалоб, воспалений, плохих анализов.

У каждого инфекционного заболевания есть конкретный возбудитель. К настоящему времени медицинской науке известны следующие пути передачи возбудителей инфекционных болезней:

- с кровью (при проведении инъекции, при переливании крови, через нестерильные маникюрные и стоматологические инструменты);
- трансмиссивный (через укус кровососущего насекомого);
- воздушно-капельный (через воздух при дыхании, чихании и даже простом разговоре);
- фекально-оральный (при несоблюдении правил личной бытовой гигиены через грязные руки);
- водный (с зараженной инфекционным агентом водой при купании, глотании);
- пищевой (термически необработанное зараженное мясо, рыба, молоко);
- половой (в том числе оральный и анальный секс);
- контактный (при непосредственном контакте больного человека или носителя с временно здоровым, например при рукопожатии);
- бытовой (опосредованно через предметы обихода, например при пользовании тарелкой, кружкой, полотенцем больного человека).

Два последних пути передачи часто объединяют в один - контактно-бытовой.

Заболевания, вызванные чужеродными микроорганизмами, принято называть либо по основному пути передачи, либо по латинскому названию возбудителя.

В настоящее время к венерическим заболеваниям относят более десятка инфекций. К заболеваниям, обозначаемым аббревиатурами ЗППП, ИППП, принято относить те, которые передаются преимущественно половым путем (ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты В, С, D, Е, хламидиоз, трихомониаз, генитальный герпес, папилломавирусная инфекция), но иногда ими можно заразиться бытовым путем, воздушно-капельным или контактным. Возбудители перечисленных инфекций могут быть переданы ребенку от матери, в бассейне или в бане при пользовании общей лавкой, при переливании крови.

Некоторые инфекционные заболевания передаются половым путем, но чаще попадают в половые пути из собственных соседних органов. К ним относят кольпит, эндометрит, бартолинит, простатит и некоторые другие воспалительные заболевания органов малого таза как у женщин, так и у мужчин, возникающие при контакте с кишечной палочкой, энтерококками (кишечная и простатическая флора), стафилококками (через руки), стрептококками (при наличии хронического тонзиллита).

Необходимо развеять некоторое заблуждение, бытующее относительно бактериального вагиноза (дисбактериоз, гарднереллез). Эта разновидность дисбактериоза не является инфекцией, как некоторые считают. Дисбактериоз не заразен, а значит, не передается партнеру никакими путями. Он вызывает жалобы, поэтому подлежит лечению. Но лечение дисбактериоза не имеет никакого отношения к принципам построения терапии ЗППП. При дисбактериозе лечится тот человек, у которого есть жалобы, не привлекая к лечению партнера.

Итак, вы пришли к врачу-гинекологу с жалобами на выделения. После предварительного осмотра он должен назначить вам анализы, которые помогут определить конкретного виновника выделений, и, исходя из этого, определить схему терапии. Какие анализы вам предстоит сдать?

Бактериоскопия, или, в обиходе, мазок на флору.

Материал, взятый шпателем, равномерно распределяют по чистому предметному стеклу широким мазком. Неправильным является нанесение материала толстым слоем, каплей, небольшим мазком. Материал из разных участков помещается на стекле отдельно, с обратной стороны стекла отмечается место взятия мазка: U -мочеиспускательный канал, C - шейка матки, V - влагалище. После этого стекло высушивается на воздухе и отправляется в лабораторию.

При микроскопии полученного мазка могут быть обнаружены клетки эпителия, выстилающего внутреннюю поверхность влагалища и шейку матки. В норме они должны присутствовать. Их количество меняется в зависимости от фазы менструального цикла, применяемых гормональных препаратов. Чем больше в момент взятия мазка в организме женских половых гормонов, тем больше эпителия. Их отсутствие говорит об атрофии эпителия, недостатке эстрогенов, избытке мужских половых гормонов.

Обнаружение лейкоцитов - нормальное явление. При воспалении во влагалище их количество увеличивается пропорционально остроте воспалительного процесса и количеству возбудителей. В норме количество лейкоцитов в первую фазу менструального цикла составляет до 10 в поле зрения, во вторую - 10-15 в поле зрения. Под полем зрения понимается участок стекла, видимый под микроскопом. Повышенное содержание лейкоцитов достаточно для лабораторного подтверждения самого факта инфекции, но недостаточно для определения ее возбудителя.

Палочковая флора, или морфотип лактобактерий, - это микроорганизмы, которые должны жить в кислой среде влагалища, в норме, кроме них, в мазке ничего не должно быть. Микроорганизмы, обнаруженные в мазке, помогают лечащему врачу подобрать адекватный антибактериальный препарат.

Подчас можно столкнуться с таким результатом бактериоскопии, в котором нет ничего другого, кроме лейкоцитов. Это значит, что материал для микроскопии взят неправильно. Лейкоциты способен обнаружить самый неквалифицированный лаборант. Классифицировать остальное много сложнее. В случае вирусной, микоплазменной, хламидийной инфекции применяются другие, более изощренные методы исследования. Возбудители перечисленных болезней элементарно не видны в микроскоп.

Бактериоскопия мазка при обычной окраске метиленовой синью выполняется в течение 15 минут.

Бактериологическое исследование, или бактериологический посев, - культуральный метод. Данный анализ гораздо чувствительнее и специфичнее обычного мазка, он имеет преимущества перед ДНК-диагностикой. Дело в том, что важно не обнаружение микроба, а доказательство того, что именно он является возбудителем инфекции, а это не одно и то же.

Бактериальный посев - выращивание бактерий на питательных средах. Данный метод более чувствительный, чем микроскопия мазка. Он способен обнаружить возбудителя там, где простая микроскопия бессильна. Анализ берут из канала шейки матки специальным стерильным тампоном. При вас вскрывают одноразовую пробирку с тампоном, которая заклеена заводским способом, и, ни к чему не прикасаясь, вводят тампон в канал шейки матки. Одно движение, и тампон осторожно возвращают в пробирку, наглухо ее закрывая. Самое главное при взятии материала для бактериального посева - это стерильность процедуры, исключающая попадание микроорганизмов из воздуха, с кожи и прочих объектов в забираемый материал.

В обычном посеве невозможно определить присутствие хламидий в силу технологических особенностей анализа. Для диагностирования хламидий применяют отдельные анализы.

Единственным недостатком метода является длительность его выполнения. Придется подождать результатов несколько дней.

ДНК-диагностика. Материал берут из канала шейки матки, иногда - из наружного отверстия мочеиспускательного канала специальной стерильной одноразовой щеточкой. Перед взятием материала обязательно удаляют слизь и выделения ватным тампоном, невыполнение этого правила часто ведет к ложным результатам. Большинство исследуемых микроорганизмов - внутриклеточные паразиты, поэтому для их обнаружения необходим соскоб клеток, а не выделения, которые мешают добраться до эпителия. Затем материал со щеточки помещают в контейнер с физиологическим раствором, взятым из холодильника.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это обнаружение во взятом материале ДНК возбудителя инфекции. Метод замечательно зарекомендовал себя при диагностике возбудителей хламидиоза, генитального герпеса. Но для определения эффективных способов лечения тех же заболеваний этот метод неприемлем. Признаком неэффективности лечения могут служить только жизнеспособные микроорганизмы, а их можно обнаружить только с помощью бактериального посева. Также нежелательно полагаться на результаты ПЦР для диагностики гарднереллеза. Эти бактерии и в норме содержатся во влагалище. Их не должно быть в мазке. В данном случае бактериоскопия - достаточный метод для диагностики гарднереллеза и контроля лечения. Положительный результат ПЦР на уреаплазму (биовары) и микоплазму также не является критерием диагностики и лечения этих инфекций.

Самая частая причина ложных результатов ПЦР - несоблюдение правил забора материала и стерильности, которую пациент не может проконтролировать. Стерильность может быть нарушена и в лаборатории. Поэтому, несмотря на то что ПЦР - самый чувствительный и специфичный метод диагностики, у него есть свои недостатки. Результаты должны быть интерпретированы лечащим врачом с учетом всех возможностей. Диагноз ставится не только по результатам лабораторных анализов, но и с учетом жалоб и симптомов у пациента. Поэтому не полагайтесь на одни только анализы. Любой диагностический метод является вспомогательным.

Определение антител в крови методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Этот дополнительный метод диагностики позволяет отличить острое заболевание от обострения хронической инфекции. Особенно часто этот метод используется у беременных после обнаружения возбудителя методом ПЦР для определения вероятности заражения ребенка.

Суть метода в следующем. При попадании возбудителя в кровь в ней образуются антитела - вещества, которые фиксируют его и стараются вывести из организма. При первичной инфекции вырабатываются антитела одного класса - иммуноглобулины М, обнаружение которых свидетельствует о том, что организм болен. Позднее начинают вырабатываться другие антитела - иммуноглобулины класса G. Они сохраняются и после излечения, для некоторых инфекций (например, краснуха) -навсегда. Нахождение в крови иммуноглобулинов G свидетельствует о том, что организм раньше встречался с инфекцией и выработал против нее иммунитет, что очень хорошо. Одновременное присутствие этих двух классов иммуноглобулинов говорит врачу об обострении хронической инфекции и требует лечения. При нахождении только иммуноглобулинов G и подозрении на инфекцию (признаки внутриутробной инфекции плода) через две недели делают повторный анализ с определением титра (количества) антител. Возрастание титра в 4 раза говорит об активации инфекции и требует лечения.

[youtube.player]