Золотым стандартом диагностики хламидийной инфекции является

Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким является метод диагностики хламидий путем изоляции возбудителя на культуре клеток, обработанных различными антиметаболитами (“золотой стандарт”). Для этой цели обычно используют чувствительную культуру клеток, обработанную циклогексимидом. Чувствительность культурального метода по сравнению с ПЦР составляет 70-80%, но в то же время он превосходит молекулярно-биологические методы диагностики по специфичности. В литературе описаны случаи выявления хламидии трахоматис методом ПЦР при отрицательных результатах культурального теста и наоборот.

Показания:

• Беременность с отягощенным акушерским анамнезом.
• Оценка эффективности проведенного антибактериального лечения.
• Выявление чувствительности и резистентности к антибактериальным препаратам.
• Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных или лиц со вторичными иммунодефицитными состояниями (онкологические больные после проведенных курсов лучевой и химиотерапии, трансплантации костного мозга; лица, получающие иммунодепрессанты; больные вирусным гепатитом и туберкулезом).
• Бесплодие неясного генеза.
• Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта.

Культуральный посев является референс-методом при оценке эффективности антибактериального лечения. При исследовании биопроб методом ПЦР после курса химиотерапии в некоторых случаях можно получить “ложноположительные с клинической точки зрения” результаты. Это связано с тем, что невозможно однозначно оценить жизнеспособность и патогенность микробной клетки на основании выявления фрагмента ее генома, используя только данные молекулярно-биологических методов . В этом случае при исследовании клинического материала с помощью культурального посева микробные клетки, потерявшие эти важные с клинической точки зрения свойства, не дадут роста в клеточной культуре.

Методика:

Для транспортировки и хранения клинического материала используют специальную питательную среду (транспортная среда). Она разливается в пенициллиновые флаконы по 1 мл и хранится при температуре + 4 0 C (в общей камере бытового холодильника) в течение 2-х месяцев. Состав транспортной среды: среда МЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотика гентамицина концентрации 50 мкг/мл .

Клинический материал после перенесения в транспортную среду хранится в общей камере холодильника при температуре + 4 0 С и, в течение двух суток должен быть доставлен в лабораторию.

Процедура посева

1. Обработка однодневной клеточной культуры McCoy 1% раствором ДЕАЕ декстраном в течение 30 минут.
2. Заражение обработанных клеток материалом, полученным от больных.
3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течение 45 минут.
4. Отмывка клеток питательной средой.
5. Добавление к клеткам ростовой среды, cодержащей циклогексимид.
6. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36 0 C.
7. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой иммунофлюоресценции или ПЦР.

Реальный срок получения результатов этим методом — семь дней.

Определение чувствительности:

В настоящее время в литературе растет число сообщений о случаях резистентности хламидий к антибактериальным препаратам (эритромицину, тетрациклину, доксициклину, фторхинолонам). Ценность культурального метода состоит в том, что он является пока единственным методом, позволяющим выбрать антибактериальный препарат для лечения хламидийной инфекции и оценить эффективность антибактериальной терапии.

Схема метода выявления устойчивости Chlamydia trachomatis к антибактериальным препаратам

• Хламидийным изолятом, выделенным от больного при посеве заражают чувствительные клетки.
• К зараженным клеткам добавляют ростовую среду, содержащую антибиотик.
• Зараженные клетки инкубируют 5 дней при температуре + 36 0 C.

Чувствительность хламидий к антибиотику определяется по подавлению инфекции в зараженных клетках. Процедура длительная, занимает по времени две недели.

УВЕДОМЛЕНИЕ

Данная работа написана врачами-профессионалами для врачей-профессионалов.
Она не предназначена для широкой аудитории и не является руководством
для диагностики и тем более лечения каких-либо заболеваний без участия врача.

[youtube.player]

Хламидиоз часто протекает скрыто, без явной клинической симптоматики. Вот почему так важна своевременная и точная диагностика хламидиоза. Какие методы обследования справятся с этой задачей лучше всего?

Методы диагностики хламидиоза

Методы диагностики хламидиоза у мужчин и женщин делятся на 2 направления:

1. Для непосредственного выявления хламидий.
2. Для обнаружения тех изменений, которые они вызывают.

В первом случае применяются 4 основных метода:

Во втором случае, т.е. для диагностики тех изменений, которые вызывают хламидии, используются следующие методы:

1. Кольпоскопическое обследование шейки матки у женщин. Оно предполагает осмотр цервикального канала и шеечной поверхности под увеличением кольпоскопа.
2. Уретроскопия – эндоскопическая визуализация слизистой мочеиспускательного канала, который достаточно часто поражается на фоне хламидиоза.
3. Рентгенологическое обследование легких, вовлекаемых в патологический процесс, если заражение произошло пневмофильными возбудителями хламидиоза. В этом случае также может применяться и бронхоскопия – эндоскопическое обследование бронхиального дерева.

Лабораторная диагностика хламидиоза

Лабораторная диагностика хламидиоза у мужчин и женщин проявляет различную чувствительность и специфичность. Поэтому надо не растеряться и понять, какой метод обследования выбрать для себя. Как же сделать правильный выбор? Разбираемся в вопросе поэтапно.

Для начала следует определиться с такими понятиями, как специфичность и чувствительность метода.

• Специфичность — это доля тех людей, у которых результаты диагностики отрицательны, по отношению ко всем небольным пациентам. Этот критерий отражает, насколько метод оказывается ценным в отношении здоровых людей. Чем выше специфичность, тем больше вероятность того, что здоровый человек не будет принят за больного.
• Чувствительность — это доля тех людей, у которых результаты диагностики положительны по отношению ко всем больным пациентам. Этот показатель отражает процент выявления случаев заболевания. Чем он выше, тем больше шансов, что будет выявлен действительно больной человек.

Лучшими являются культуральные методы, потому что их чувствительность составляет 70-80% в сравнении с ПЦР. Это означает, что такая диагностика выявляет 70-80% больных хламидиозом пациентов, а только в 20-30% случаев они ускользают из поля зрения клинициста, т.к. тест оказывается отрицательным. Несмотря на высокую эффективность такой диагностики, она является очень трудоемкой, т.к. необходимо произвести забор материала в стерильных условиях, поместить его на специальные среды и дождаться роста колоний, при этом обеспечив достаточные для этого процесса условия.

Чаще всего такая диагностика хламидиоза у мужчин и женщин используется в 3 случаях:

• Научно-экспериментальные цели для получения данных, необходимых в клинической практике (инновационная диагностика хламидиоза и лечение, а также выявление особенностей клинической симптоматики в зависимости от вида возбудителя).
• Определение информативности других методов диагностики.
• Оценка чувствительности хламидий к антибиотикам, особенно при упорном и длительном течении хламидиоза.

Такая диагностика хламидиоза включает в себя следующие методы:

• иммуноферментный анализ;
• реакция иммуноблотинга;
• реакция геммаглютинации.

Однако наибольшее распространение для обнаружения хламидиоза у мужчин и женщин получил первый метод – иммуноферментное исследование. Он давно применяется в клинической практике и имеет массу положительных отзывов от врачей. Этот метод предполагает выявление в крови или соскобе противохламидийных антител – иммуноглобулинов различных классов.

Важно учитывать, что хламидии не являются мощным антигенным стимулятором иммунной системы, поэтому образование антител происходит не очень активно и в малых количествах. В связи с этим, чтобы диагностика хламидиоза у мужчин и женщин была особенно информативна, рекомендуется производить забор крови в определенные временные промежутки. Оптимальнее это делать в период яркой клинической симптоматики, особенно связанно с системными проявлениями (поражение глаз, суставов, сердца и т.д.).

У пациентов возникает вопрос, как провести диагностику хламидиоза, если поблизости нет современной лаборатории. Методы иммуноферментного анализа как нельзя лучше решают эту задачу, т.к. материал можно определенное время хранить в специальных условиях. Для этого сыворотку необходимо пропустить через центрифугу, чтобы плазма отделилась от форменных элементов. В таком виде при температуре 4-8 °С можно сохранять в течение 5 дней, а в температурном режиме - 20°С она сохраняется до 1 месяца.

Чтобы результаты обследования были наиболее достоверными, врачи советуют проводить исследование в динамике через некоторое время, например, после лечения. Это поможет выявить, как изменяется титр антител – снижается, остается на прежнем уровне или повышается. После терапии оптимальным вариантом является его снижение. Если же имеется возрастание титра в 4 раза и более, то это обычно указывает на обострение патологического процесса.

Однако метод иммуноферментного анализа может выполняться не только с кровью. В качестве материала некоторые фирмы производители тест-систем предполагают использование отделяемого или соскобов со слизистой оболочки мочеполового тракта (наружные отделы) или прямой кишки, или глаз.

Этим способом выявить наличие противохламидийных антител удается в 60-70% случаев.

Методы ПЦР для выявления хламидиоза у мужчин и женщин в настоящее время очень широко используются. Этот способ предполагает создание многочисленных копий нуклеиновых кислот хламидий (ДНК или РНК) и выявление их с помощью стандартных методов (чаще всего используется все тот же иммуноферментный анализ).

Главное преимущество ПЦР в выявлении хламидиоза — это высокая чувствительность и специфичность такой диагностики, которая практически сопоставима с культуральным методом, но при этом не требует таких колоссальных затрат. Однако у метода есть и свои недостатки, которые в большей степени касаются материальной стороны. Так, ПЦР требует:

• дорогостоящего оборудования;
• специально укомплектованной лаборатории;
• должной подготовки медицинского персонала для выполнения анализов.

Еще один минус ПЦР — это обсеменение материала сопутствующей микрофлорой (кроме хламидий), что негативно сказывается на результатах обследования. Поэтому ПЦР не лишена ложноположительных результатов.

Этот метод основан на иммунофлюоресцентной микроскопии взятых мазков. Под воздействием люминесцентного свечения хламидии выглядят как желтые и желто-зеленые тельца на фоне цитоплазмы, которая в этом свечении визуализируется как желто-коричневая. Этот метод позволяет также выявлять даже растворимые хламидийные антигены, поэтому используется как скрининговый, т.е. предназначенный для массового обследования.

Большинство зарубежных фирм выпускает специальные экспресс-тесты для диагностики хламидиоза. Они содержат моноклональные антитела, которые связываются с антигенами хламидий и обеспечивают специфическое свечение.

Однако для того, чтобы диагностика хламидиоза была проведена данным методом, требуется наличие люминесцентного микроскопа и обученного лаборанта. Это не единственные недостатки, которые присущи этому методу. Он имеет хороший уровень чувствительности и специфичности, однако этих показателей недостаточно для стабильного выявления малых количеств элементарных телец, располагающихся вне клеток организма человека. К тому же методы иммунофлюоресцентной микроскопии не могут использоваться для проверки отрицательных результатов обследования, полученных иным способом. Всё это заметно снижает диагностическую ценность иммунофлюоресценции.

Лабораторная диагностика хламидиоза у мужчин и женщин предполагает в обязательном порядке правильный забор материала. В противном случае велика доля ложноотрицательных результатов. Но что значит правильный забор?

• До взятия биологического материала у мужчин и женщин им запрещено мочиться за 1-1,5 часа до процедуры. Это позволит не смыть хламидии со слизистой, а значит, они попадут в получаемый образец материала. Однако если имеются обильные гнойные выделения, то материал берут сразу же после мочеиспускания.
• Для взятия соскоба использует специальные инструменты. Это могут быть ложки Фолькмана, стерильные тампоны, платиновая петля (чаще всего применяется у мужчин) или щеточка.
• Перед забором материала врач обязательно удаляет слизистую пробку, в которой патогенных возбудителей обычно очень мало, чтобы их идентифицировать (определить).
• Важно производить забор материала при подозрении на урогенитальную форму хламидиоза из наиболее уязвимых зон. Это одна у мужчин – уретра – и 2 зоны у женщин – слизистая шейки матки и мочеиспускательный канал.
• Помимо знания мест забора, надо еще и соблюсти требуемую глубину введения инструментов, чтобы получить материал, где больше всего будет хламидий в случае имеющегося инфицирования. У женщин — это 1,5 см для цервикального канала и 1-1,5 см для уретры. У мужчин – 2,5-4 см вглубь уретрального канала, при этом требуется предварительная обработка с помощью физиологического раствора головки пениса в месте введения инструментов.

Инструментальная диагностика хламидиоза у женщин и мужчин

Как же определить, насколько проявилось негативное влияние хламидий на организм человека? В этом помогут инструментальные методы диагностики. С их помощью можно определить, какой орган поражен, есть ли осложнения и т.д.

У мужчин для оценки степени прогрессирования урогенитального хламидиоза чаще всего врачами применяется:

• УЗ-сканирование органов малого таза – простаты, семенных пузырьков, яичка и т.д.
• Уретроскопия – осмотр слизистой мочеиспускательного канала с применением эндоскопической техники.
• Экскреторная урография – для исключения поражения почек (хламидийного пиелонефрита).

Женщинам показаны следующие методы обследования, определяющие урогенитальную форму хламидийной инфекции:

• Кольпоскопия.
• УЗ-сканирование матки и ее придатков для выявления хронического воспалительного процесса.
• Рентгенография почек.

Для исключения хламидийной пневмонии, бронхита или фарингита проводится рентгенологическое обследование. Осмотр глазного яблока с помощью микроскопа позволяет выявить конъюнктивит и предположить его природу.

При подозрении на синдром Рейтера проводится рентгенологическое обследование суставов. Оно оценивает состояние хряща и околосуставных тканей, которые часто вовлекаются в патологический процесс при хламидиозе.

Заключение

Современная диагностика хламидиоза у мужчин и женщин предполагает в первую очередь проведение лабораторных исследований, среди которых особенно информативными являются ПЦР и серологические методы. Параллельно проводятся и инструментальные методы, направленные на выявление тех патологических изменений в организме, которые вызвали хламидии.

[youtube.player]

Хламидийная инфекция вызывается Chlamydia trachomatis – грамотрицательной бактерией, принадлежащей семейству Chlamydiaceae. Вид Chlamydia trachomatis включает различные серовары, которые вызывают отдельные нозологические формы заболеваний. Сероваровы A, B, C вызывают трахому, L1, L2, L3 – венерическую лимфогранулему. Наибольшее распространение в странах Европы, Южной и Северной Америки и в России получили серовары D–K, которые передаются при половых контактах и вызывают урогенитальную хламидийную инфекцию (УХИ). Возможна перинатальная передача с развитием у новорожденных конъюнктивита или пневмонии. C.trachomatis имеет уникальный среди других возбудителей ИППП жизненный цикл. Инфицирование эпителиальных клеток происходит метаболически неактивными формами хламидий – элементарными тельцами (ЭТ). Внутри клеток ЭТ трансформирутся в ретикулярные тельца (РТ) – метаболически активные, делящиеся формы. Накопление внутри эпителиальных клеток новых генераций РТ и их параллельная трансформация обратно в ЭТ истощает ресурсы клеток хозяина, приводя их к гибели, высвобождению ЭТ и новому циклу инфицирования. Неосложненная хламидийная инфекция протекает у мужчин чаще всего в форме уретрита, у женщин – в форме слизисто-гнойного цервицита. Симптомы и проявления УХИ неспецифичны, для постановки диагноза УХИ необходимы лабораторные исследования для выявления возбудителя или его маркеров. Значительная часть случаев УХИ – от 40 до 60% протекает в бессимптомной или малосимптомной форме и проявляется уже на стадии осложнений. Основными осложнениями УХИ являются: эпидидимит, эндометрит, сальпингит, сальпингоофорит, внематочная беременность, трубное бесплодие, болезнь Рейтера.

Показания к назначению лабораторных исследований. У мужчин: наличие симптомов и клинических проявлений уретрита, эпидидимита или эпидидимоорхита; у лиц, практикующих аногенитальные контакты – проктита; при физикальном осмотре – наличие выделений из уретры.

У женщин: наличие симптомов воспалительного процесса в нижних отделах урогенитального тракта и органах малого таза, боли в низу живота, патологические выделения из влагалища; наличие слизистых или слизисто-гнойных выделений из цервикального канала, нарушение менструального цикла, болезненность при половых контактах; подготовка к хирургическому вмешательству на органах малого таза; подготовка к беременности, отягощенный акушерско-гинекологический анамнез, связанный с инфекционной патологией.

У лиц обоего пола без симптомов и признаков воспалительного процесса урогенитального тракта: наличие перечисленных выше симптомов и признаков или установленная УХИ у полового партнера; в возрастной группе до 25 лет – многочисленные половые партнеры или половые контакты с новым половым партнером без барьерной контрацепции.

Дифференциальная диагностика. Гонорея, урогенитальный трихомониаз, инфекция, вызванная M.genitalium.

Этиологическая диагностика включает визуальное обнаружение C.trachomatis, выделение культуры C.trachomatis, выявление АГ, ДНК и РНК C.trachomatis и АТ к микроорганизму.

Материал для исследований

• Мазки/соскобы со слизистых оболочек цервикального канала и уретры женщин – микроскопические исследования, культуральные исследования, выявление АГ, обнаружение ДНК, РНК;
• мазки/соскобы со слизистой влагалища, мазки (соскобы) со слизистой прямой кишки – выявление ДНК, РНК;
• мазки/соскобы с конъюнктивы глаз – культуральные исследования, выявление ДНК;
• моча (у мужчин) – выявление ДНК;
• сыворотка крови – выявление АТ.

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики. Для визуального выявления C.trachomatis возможно применение световой или люминесцентной микроскопии. При применении световой микроскопии используется фиксированный препарат биологического материала, окрашенный по Романовскому- Гимзе, в котором выявляют измененные клетки цилиндрического эпителия, содержащие ЭТ и РТ C.trachomatis, получившие название телец ГальберштедтераПровачека. Диагностическая чувствительность исследования не превышает 10%. Распространенным приемом выявления хламидий является определение АГ микроорганизма методом ПИФ. С помощью люминесцентной микроскопии в препарате, обработанном флуоресцентно-меченными АТ к хламидиям, по характерному свечению обнаруживаются ЭТ C.trachomatis. Микроскопические исследования, в первую очередь ПИФ, достаточно просты в исполнении и не требует дорогостоящего оборудования, однако весьма требовательны к качеству полученного биологического материала, технике нанесения препарата на стекло и специфичности используемых АТ. Материал для выполнения ПИФ должен содержать достаточное количество клеток цилиндрического эпителия, его получают из цервикального канала (по показаниям – из уретры) и у мужчин из передней уретры. Для интерпретации результата необходимо наличие в препарате не менее 5–10 клеток цилиндрического эпителия (отражает качество получения биоматериала) в поле зрения и не менее 10 флуоресцирующих ЭТ. Диагностическая чувствительность метода ПИФ варьирует в широких пределах – от 10 до 65%. Максимальная чувствительность и специфичность метода отмечена у пациентов с клиническими проявлениями инфекции и высокой бактериальной нагрузкой, минимальная – при бессимптомных или малосимптомных формах.

Для выявления АГ C.trachomatis за рубежом был разработан ряд тестов на основе ИФА. Диагностическая чувствительность выявления АГ C.trachomatis находится в пределах 55–78%. Указанные тесты получили широкое распространение в зарубежной лабораторной практике, однако в РФ не применяются.

Для выявления ДНК C.trachomatis в РФ используют преимущественно ПЦР с различными вариантами детекции продуктов реакции и метод выявления РНК C.trachomatis на основе НАСБА. Диагностическая чувствительность метода ПЦР для диагностики УХИ находится в пределах от 90 до 98%, специфичность достигает 96–98%. Диагностическая чувствительность метода НАСБА достигает 98%, диагностическая специфичность – до 100%.

Показания к применению различных лабораторных исследований. Микроскопическое исследование препаратов с окраской по Романовскому-Гимзе в настоящее время не используется и не рекомендуется для диагностики УХИ. В то же время, всем пациентам с симптомами и клиническими проявлениями урогенитальной инфекции показано микроскопическое исследование с окраской по Граму для установления лабораторных признаков воспаления (повышенное содержание ПМЯЛ).

Применение метода ПИФ целесообразно в качестве метода быстрой диагностики при наличии у пациентов выраженных проявлений инфекционно-воспалительного процесса в урогенитальном тракте при условии соблюдения всех требований получения биологического материала. Метод не подходит для скрининга, диагностики хронических форм хламидийной инфекции, контроля лечения и исследования образцов мочи и слизистой влагалища, прямой кишки, ротоглотки.

С учетом того, что для проведения культурального исследования необходима технология ведения эукариотических клеточных линий и соответствующие для этого лабораторные условия, то применение метода в рутинной лабораторной практике ограничено. Метод в первую очередь имеет большое значение в научных исследованиях, когда требуется выделить живой возбудитель для его дальнейшего изучения.

Определение АТ к C.trachomatis может быть использовано для эпидемиологических исследований, с целью интегральной оценки доли лиц в популяции, контактировавшей с C.trachomatis. В клинической практике определение АТ показано при ретроспективном анализе возможной хламидийной этиологии при бесплодии, длительных хронических воспалительных процессах урогенитального тракта. Однако и в этом случае положительные результаты обнаружения АТ должны рассматриваться в контексте других клинических, анамнестических и лабораторных данных.

В настоящее время выявление ДНК методом ПЦР считаются основой лабораторной диагностики УХИ. Исследование показано и для контроля результатов лечения. При использовании метода ПЦР с учетом скорости элиминации ДНК C.trachomatis контроль лечения необходимо проводить не ранее 3–4 недель. РНК возбудителя является более ранним маркером ответа на терапию, поэтому с помощью метода НАСБА можно оценивать эффективность лечения через 1–2 недели после окончания курса.

Особенности интерпретация результатов лабораторных исследований. Результаты, полученные методом ПИФ, рекомендуется подтверждать с помощью культурального или молекулярно-биологических методов.

Положительные результаты культурального исследования не требуют дополнительного подтверждения и означают наличие инфекции. Отрицательный результат означает как отсутствие возбудителя, так и может свидетельствовать о неоптимальных условиях для его культивирования.

При обнаружении ДНК C.trachomatis у пациентов с клинической симптоматикой урогенитальной инфекции или наличии факторов, способствующих инфицированию, дополнительного исследования не требуется, диагноз урогенитальной инфекции считается установленным. У пациентов, у которых обнаружена ДНК C.trachomatis, но отсутствуют субъективные и объективные признаки инфекционно- воспалительного заболевания и факторы риска, для подтверждения диагноза рекомендуется провести исследование для выявления РНК C.trachomatis методом НАСБА. Наличие ДНК и РНК патогена является объективным лабораторным признаком инфекции.

При оценке результатов выявления АТ следует учитывать, что их наличие или отсутствие не отражает наличие или отсутствие инфекции в данный момент времени.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Copyright ФБУН Центральный НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, 1998 - 2020

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

[youtube.player]

Хламидиоз
Методические рекомендации

Чл.-корр. РАМН, проф. Серов В. Н.,
чл.-корр. РАМН, проф. Краснопольский В. И.,
проф. Делекторский В. В.,
проф. Афанасьев С. С.,
д.м.н. Денисов Л. А.,
к.м.н. Яшкова Г. Н.,
к.м.н. Шаповаленко С. А.,
к.м.н. Козаченко М. А.,
к.б.н. Цветаева Т. Ю.,
к.м.н. Сорокин С. В.,
к.х.н. Аваков А. Э.,
к.м.н. Жуковский Я. Г.,
к.м.н. Пауков С. В.,
к.м.н. Рубальский О. В.,
Зулькарнеев Р. Ш .,
Хасьянов Э. А.

Содержание

• Предисловие
• Биологические свойства хламидий
• Клинические проявления хламидиоза
• Особенности хламидийной инфекции у детей, семейный хламидиоз
• Диагностика хламидиоза
• Техника взятия материала
• Диагностика хламидий на культуре клеток МсСоу
• Диагностика хламидий методом гибридизации ДНК
• Диагностика хламидий методом полимеразной цепной реакции
• Лечение хламидиоза и критерий излеченности при хламидиозе

В обследовании на хламидий прежде всего нуждаются женщины (беременные и небеременные):

• c наличием воспалительных заболеваний гениталий, особенно с поражением шейки матки: цервицит, "эрозия";
• c бесплодием в течение 2-3-х лет;
• беременные с отягощенным акушерским анамнезом (неразвивающаяся беременность, самопроизвольные выкидыши, преждевременные роды, рождение маловесных детей (средняя масса тела доношенных детей, рожденных женщинами с хламидиозом гениталий достоверно ниже, чем детей матерей без хламидиоза) и с осложненным течением настоящей беременности (угроза прерывания, многоводие, лихорадка неясной этиологии, гипертрофия плода).

Важно подчеркнуть, что исследование на хламидий у вышеуказанных женщин надо проводить независимо от картины влагалищного мазка и от наличия сопутствующей условно-патогенной микрофлоры в половых путях, так как доказано, что генитальный хламидиоз протекает преимущественно (почти у 80% больных) при нормальной картине влагалищного мазка (то есть при I и II его типах).

При проведении гинекологического осмотра характерно наличие "эрозии" шейки матки, эндоцервицита, кольпита, обильных слизисто-гнойных выделений из влагалища; кроме того, часто выявляется гиперемия наружного отверстия мочеиспускательного канала и, нередко, остроконечные кондиломы (Черепова В. И., 1988).

Расширенная кольпоскопия позволяет предположить хламидийную инфекцию у больных с псевдоэрозиями шейки матки при обнаружении: простой типичной эктопии с признаками цервицита, имеющей четкие ровные границы; простой эктопии с признаками цервицита нередко в сочетании с лейкоплакией или основой лейкоплакии, расположенных по периферии эктопии; сосудистой атипии в виде штопоровидных капилляров (Рудакова Е. Б., и соавт., 1995).

У больных с эндоуретральными остроконечными кондиломами хламидийной этиологии при объективном исследовании выявляется следующее: губки уретры отечны, на них расположены остроконечные кондиломы в виде петушиного гребешка (могут быть одиночными и множественными). При их глубинном расположении в диагностике помогает уретроскопия и специальные лабораторные исследования.

Диагноз хламидиоза ставится на основании анамнеза, оценки клинических признаков заболевания и лабораторных методов исследования. В связи с тем, что для генитального хламидиоза более характерно малосимптомное и латентное течение, основное значение имеет лабораторная диагностика этой инфекции.

Наиболее объективными методами диагностики хламидиоза являются культуральный метод (золотой стандарт), метод гибридизации ДНК, полимеразная цепная реакция, иммуноферментный анализ, методы прямой и непрямой иммунофлюоресценции с использованием отечественных (Хламислайд, Хламискан, Хламимоноскрин) и импортных ("МicroNrek", "Syva" USA, "Сlamytest" Orion Diagnostica, Finland и др.) тест систем иммунохромотографии ("Сlearview Chlamydia" Unipath Limited, England).

Серологические методы можно рассматривать как дополнительные при обосновании диагноза.

Очень важным для диагностики хламидиоза является правильный забор материала для последующего лабораторного исследования.

Техника взятия материала

Одним из самых ответственных этапов диагностики хламидиоза является забор материала. Именно этот этап должен проводиться лечебными учреждениями широкого профиля, в то время как дальнейшая обработка материала может осуществляться в специализированных лабораториях.

При исследовании на хламидий методом культуры клеток перед взятием материала больные не должны принимать в течение месяца антибиотики тетрациклинового ряда, при цитологической методике, в том числе и при использовании моноклональных флюоресцирующих антител, эти препараты не следует применять за две недели до исследования. Перед взятием материала больные не должны мочиться в течение 1-1,5 часов. При взятии материала на хламидий следует помнить, что оптимальным для персистенции и размножения С. trachomatis являются определенные участки цилиндрического эпителия мочеполовых путей (передняя уретра на глубине 2,5-4 см у мужчин и слизистая оболочка цервикального канала матки 1,5 см у женщин).

При взятии материала из шейки матки ключевым моментом являлось удаление слизистой пробки. От тщательности проведения этой подготовительной процедуры во многом зависит возможность правильного соскоба из цервикального канала. Слизистую пробку удаляют ватным тампоном и пинцетом, а затем берут материал специальной щеточкой cervex brush или voba-brush фирмы Rovers (Голландия), имеющей ряд преимуществ, так как для получения репрезентативного результата важно присутствие в нем клеток со всей поверхности шейки матки, цервикального канала, зоны трансформации и наружной части шейки матки.

Забор материала у девочек производится со слизистой оболочки преддверия влагалища, в отдельных случаях - из заднего свода влагалища, путем введения зонда через гименальные кольца (как при вагиноскопии).

Взятый соскобный материал (за исключением случая применения метода культуры клеток) помещают на предметное стекло, равномерно распределяют тонким слоем и высушивают на воздухе. Фиксация материала осуществляется безводным ацетоном, метанолом или этанолом посредством нанесения их на препарат в количестве 2-3 капель или путем погружения препарата в раствор фиксатора на 30 секунд. Хранить и транспортировать препараты рекомендуется при комнатной температуре. Обрабатывать следует в течение 7 дней.

Диагностика хламидии на культуре клеток МсСоу

Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким, является метод диагностики хламидийной инфекции посредством изоляции возбудителя на культуре клеток, обработанных различными антиметаболитами (Золотой стандарт). Для этой цели обычно используют культуру клеток МсСоу, обработанных циклогексемидом.

Приготовление питательных сред:

1. Ростовая среда: среда Игла без глютамина - 400 мл, 3% глютамин - 5 мл, эмбриональная сыворотка теленка 4% от общего объема, гентамицин - 40 мкг/мл.
2. Изолирующая среда (среда с антибиотиками для заражения клеток клиническим материалом): среда Игла без глютамина - 400 мл, 3% глютамин -5 мл, эмбриональная сыворотка теленка 8% от общего объема, гентамицин - 40 мкг/ мл, 10% глюкоза - 5 мл.
3. Транспортная среда (для забора и хранения клинического материала): фосфатный буфер с сахарозой (сахароза 48,46 г., К₂НР0₄ (б/в) - 2,088 г., КН₂Р0₄ (б/в) - 1,088 г. на 1 л дистиллированной воды, довести рН до 7,0). Разлить по аликвотам и автоклавировать при 115° C 15 мин.

Хранить при 4° C до применения 1-2 мес.

Перед использованием к буферному раствору добавляют инактивированную нагреванием сыворотку крупного рогатого скота - 4% от общего объема, стрептомицин - 50 мкг/мл, амфотерицин В - 25 мкг/мл среды.

В качестве транспортной среды можно также использовать ростовую среду, к 100 мл которой вносят 1 мл 5% глюкозы, и вышеуказанные антибиотики в соответствующей концентрации.

Транспортную среду стерильно разливают по 2 мл в пенициллиновые флаконы с бусинками и хранят при 20° C в течение месяца.

Инокуляция клинического материала:

Готовят раствор циклогексимида на изолирующей среде - 2 мкг/мл. В стерильные плоскодонные пробирки с помещенными в них покровными стеклами добавляют по 2 мл клеточной суспензии (1 х 10₅ клеток/мл) и ставят их на 16-24 часа в термостат при 37° C.

В пенициллиновые флаконы с транспортной средой, содержащей клинический материал, при интенсивном встряхивании добавляют 2 мл свежеприготовленной изолирующей среды. В это время из пробирок с монослоем удаляют ростовую среду, не разрушая монослоя. Затем распределить изолирующую среду из пенициллиновых флаконов с инфекционным материалом приблизительно по 2 мл в две плоскодонных пробирки с монослоем и центрифугировать их в течение часа при 3000 об/мин (2400 д) в центрифуге с горизонтальным ротором. Инкубировать в термостате при 37° C - 2 часа, затем удалить изолирующую среду и добавить по 2 мл новой порции изолирующей среды с циклогексимидом (2 мкг на мл). Материал инкубируется в термостате при 37° C 48-72 часа.

Удалить среду из пробирок, не нарушая монослоя, добавить 1-2 мл метанола, осторожно по стенке, фиксировать в течение 10 мин осторожно потряхивая пробирку для ресуспензирования белкового осадка. Промыть фосфатным буфером (рН 6,8). Приготовить краску по Романовскому-Гимза на фосфатном буфере 1:10 (1 часть краски и 9 частей фосфатного буфера). Прилить по 1 мл краски в каждую пробирку, через 30-60 мин удалить ее и дифференцировать препарат 30% метанолом на фосфатном буфере. Стекла высушить. Монтировать на предметное стекло покровные стекла монослоем вниз в канадском бальзаме.

Просматривать в темнопольном микроскопе на присутствие включений при увеличении в 400 или 600 раз. В темном поле включения хламидии дают желто-зеленую флюоресценцию. В сомнительных случаях рекомендуется исследовать в световом микроскопе под иммерсией с объективом х 90. ' Элементарные тельца хламидии имеют розовый, а ретикулярные - синий цвет.

Диагностика хламидии методом гибридизации ДНК

Для определения ДНК хламидии часто используют весьма информативный метод точечной гибридизации (дот-гибридизации) нуклеиновых кислот на твердой фазе с использованием ДНК-зонда, меченого биотином. Из исследуемых образцов выделяют суммарную ДНК. Образцы исследуемой ДНК и контрольные образцы денатурируют кипячением, фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и гибридизуют с предварительно денатурированным биотинированным ДНК-зондом. Не связавшийся зонд удаляют путем отмывки фильтра. На следующем этапе фильтр обрабатывают коньюгатом страптавидина с щелочной фосфатазой. На заключительном этапе вносят субстратный раствор. Окрашивание соответствующих точек свидетельствует о наличии тестируемой ДНК в исследуемом материале.

Рабочие растворы готовят согласно инструкции предприятия изготовителя тест-системы. Гинекологические мазки переводят в физиологический раствор и центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин., надосадочную жидкость сливают, а оставшуюся суспензию клеток хранят в замороженном виде до проведения анализа.

В чашку Петри с 10-15 мл дистиллированной воды помещают нитроцеллюлозный фильтр на 5-10 мин до полного смачивания. Мокрый фильтр переносят в другую чашку с 4 мл раствора 10 х SSC, выдерживают 10 минут и подсушивают на воздухе на фильтровальной бумаге.

100 мкл суспензии клеток анализируемого материала смешивают с равным объемом лизирующего раствора, тщательно перемешивают и выдерживают 3 часа при 37-40° C и 5 мин при 60° C. Затем добавляют 0,05 мл ацетата калия, перемешивают и выдерживают 30 мин при 0 - 4° C, после чего центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок перемешивают на воздухе и растворяют в 10 мкл раствора 10 x SSC. Подготовленные пробы, положительный и отрицательный контроли денатурируют на кипящей водяной бане в течение 10 мин, затем быстро переносят пробирки в баню лед-вода на 5 мин и наносят на подготовленный фильтр по 2 мкл в пятно. Фильтр высушивают на воздухе и запекают при 80° C в течение 2 часов.

Далее фильтр с пробами смачивают в дистиллированной воде, переносят в чашку Петри и заливают сверху 10 мл блокирующего раствора. Фильтр инкубируют 1 час при комнатной температуре на качалке, затем блокирующий раствор сливают и фильтр заливают 5 мл гибридизационного раствора. При этом необходимо тщательно закрыть чашку Петри для избежания испарения гибридизационного раствора. Гибридизацию проводят при 42° C в течение 12-15 ч в термостате.

Фильтр отмывают от несвязавшегося зонда путем трехкратной инкубации при комнатной температуре по 10 мин в промывочном растворе. Далее фильтр инкубируют 15 мин в водяной бане при температуре 60° C в промывочном растворе и один раз в течение 5 мин при комнатной температуре в растворе ТSТ. Для блокирования неспецифического связывания коньюгата фильтр заливают 10 мл раствора для блокирования и выдерживают 0,5 ч при комнатной температуре на шейкере. Далее фильтр ополаскивают раствором ТSТ и выдерживают в 6 мл рабочего раствора коньюгата в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем фильтр 3 раза по 10 мин промывают в растворе ТSТ и один раз в растворе для приготовления проявляющей смеси. Фильтр заливают 5 мл проявляющей смеси с субстратом и хромогеном и выдерживают в темноте при 20° C в течение нескольких часов до появления окраски. Фильтр промывают дистиллированной водой для остановки проявления и высушивают.

Результаты гибридизации оценивают визуально путем сравнения с интенсивностью окраски пятен контрольных проб. Положительными считаются образцы, имеющие окраску пятна, отчетливо отличающуюся вследствие большей интенсивности от фоновой окраски.

Диагностика хламидий методом полимеразной цепной реакции

В настоящее время полимеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее распространенной и объективной методикой диагностики хламидийной инфекции.

Клинический материал для ПЦР собирают в пробирки с буферным раствором. Хранят в морозильных камерах. Повторное замораживание - оттаивание не допускается.

Клинический материал в объеме 100 мкл смешивают с 100 мкл лизирующего буфера (1% твин-20, 1% МР-40, 60 мкг/мл протеиназы К, фосфатный буфер). Смесь инкубируют при 56° C в течение 2 часов, после чего инактивируют при 95° C в течение 10 мин. Термическая обработка необходима для инактивации протеиназы К и обеззараживания клинического образца. Инактивированные образцы центрифугируют при 10000 д 10 мин. Супернатант собирают и используют для проведения ПЦР.

Реагенты вносят в реакционную пробирку в следующей последовательности:

1. вода бмдистиллированная - до 30 мкл конечного объема смеси;
2. реакционный буфер 10х-2,5 мкл;
3. 650 мМ раствор МgCl₂ - 1,2 мкл;
4. смесь dNTP's - 2,5 мкл;
5. Taq полимераза - 1-1,5 ед.;
6. олигонуклеотидные праймеры -15 пмоль;
7. контрольный образец ДНК или клинический образец -1-2 мкл.

Для предохранения от испарения поверх реакционной смеси наслаивают, 30 мкл минерального масла. Пробирки помещают в амплификатор.

Проводят ПЦР в следующих температурных режимах:
96° C 4 мин, 55° C 10 мин - 1 цикл;
95° C 1 мин, 55° C 1 мин, 72° C 2 мин - 35 циклов;

После завершения ПЦР продукты амплификации фракционируют методом, электрофореза в 1,5% агарозном геле. Наличие специфического фрагмента ДНК определяют с помощью контрольной ДНК исследуемого возбудителя, амплифицированной одновременно с клиническими образцами.

Результат анализа считается положительным в следующем случае:

• размер ДНК-продукта в клиническом образце точно соответствует ДНК-продукту, положительной контрольной пробы;
• в пробе, содержащей клинический образец и внутренний стандарт, идентифицируют специфический ДНК-продукт внутреннего стандарта;
• в пробе, содержащей вместо клинического образца аликвоту воды (отрицательный контроль), ДНК-продукты не обнаруживают.

Результат анализа считается отрицательным в следующем случае:

• в пробе, содержащей клинический образец, специфических ДНК-продуктов не обнаруживают;
• результаты ПЦР в обеих контрольных пробах - как в предыдущем случае.

Анализ следует повторить в следующих случаях:

• в пробе, содержащей контрольную ДНК, специфический продукт не обнаруживают;
• в пробе с внутренним стандартом специфический продукт не обнаруживают;
• в отрицательном контроле обнаруживают специфический ДНК-продукт.

Описанные выше три методики лабораторной диагностики хламидиоза в настоящее время являются наиболее точными и информативными.

Мы не будем в настоящей работе описывать промышленные тест-системы, основанные на прямой и непрямой иммунофлюоресценции, ибо каждая из них содержит соответствующую инструкцию. Стоит лишь сказать, что все они имеют несколько меньшую точность, но существенно выигрывают в простоте постановки диагноза.

Исключить артефакты, возникающие при диагностике хламидиоза люминесцентными методами, позволяет дополнительный тест, предложенный профессором В. В. Делекторским. Тест основан на том, что элементарное тельце хламидий (инфекционная единица) представляет собой кристаллоид, что является следствием макромолекулярной упаковки ДНК. Перефокусировка люминесцентного микроскопа приводит к возникновению по периферии элементарного тельца четкого дифракционного кольца (кольца Френеля).

Другие микроорганизмы, а также ретикулярное тельце хламидий, дифракционное кольцо не образуют. Достоверность метода не требует находки 10 элементарных телец в микроскопе. Диагноз считается положительным, если в препарате обнаруживают 2-3 элементарных тельца, образующих при фокусировке дифракционные кольца. Наличие дифракционного кольца у исследуемых структур является дополнительным диагностическим тестом, позволяющим исключить ошибки.

Следует особенно отметить, что при наличии смешанного процесса, в частности гонорейно - хламидийного, диагностика хламидиоза иммунофлюоресцентными методами затруднена. Это связано с тем, что при гонорее за счет большого количества лейкоцитов слизистые покрыты слоем белка, следствием чего является большое количество ложноотрицательных результатов. Инкубационный период при гонорейной и хламидийной инфекции различен, поэтому при одновременном инфицировании этими двумя микроорганизмами, хламидии могут выявляться значительно позже.

[youtube.player]