Получение дифтерийного яда выработка стойкого
Иммунитет – это невосприимчивость организма к возбудителям заболеваний.
Лейкоциты (белые клетки крови) обеспечивают иммунитет: защищают организм от микроорганизмов и чужеродных частиц.
Фагоциты – это лейкоциты, пожирающие чужеродные частицы. Явление фагоцитоза было открыто И.И.Мечниковым.
Антитела – это белки, выделяемые лейкоцитами (В-лимфоцитами).
- Антитела совпадают по форме с чужеродными частицами, присоединяются к ним, тем самым облегчают фагоцитам их уничтожение.
- На то, чтобы выработать достаточное количество антител против нового (незнакомого) возбудителя, В-лимфоцитам требуется 3-5 дней.
- Наличие в крови человека антител к определенному вирусу (например, к ВИЧ) говорит о том, что человек заражен.
СПИД (синдром приобретенного иммунного дефицита) вызывается вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ паразитирует на лейкоцитах (лимфоцитах), это приводит к разрушению иммунной системы.
Естественный пассивный (врожденный)
- У человека с рождения имеются готовые антитела против многих болезней. Например, человек не болеет собачьей чумкой
- Ребенок получает готовые антитела с материнским молоком. Вывод: дети, находящиеся на грудном вскармливании, меньше болеют.
Естественный активный – по окончании болезни в организме остаются клетки памяти, запоминающие строение антител. При повторном попадании того же самого возбудителя выделение антител начинается не через 3-5 дней, а сразу, и человек не заболевает
Искусственный активный появляется после прививки – введения вакцины, т.е. препарата убитых или ослабленных возбудителей болезни. Организм проводит полноценную иммунную реакцию, остаются клетки памяти.
Искусственный пассивный – появляется после введения сыворотки – препарата готовых антител. Сыворотка вводится во время болезни, чтобы спасти человека. Клетки памяти при этом не образуются.
Выберите один, наиболее правильный вариант. Введение в кровь сыворотки, содержащей антитела против возбудителей определенного заболевания, приводит к формированию иммунитета
1) активного искусственного
2) пассивного искусственного
3) естественного врожденного
4) естественного приобретенного
Выберите один, наиболее правильный вариант. Какой русский ученый открыл процесс фагоцитоза
1) И.П. Павлов
2) И.И. Мечников
3) И.М. Сеченов
4) А.А. Ухтомский
Выберите один, наиболее правильный вариант. Вакцина содержит
1) яды, выделяемые возбудителями
2) ослабленных возбудителей
3) готовые антитела
4) убитых возбудителей
Выберите один, наиболее правильный вариант. Пассивный искусственный иммунитет возникает у человека, если ему в кровь вводят
1) ослабленных возбудителей болезни
2) готовые антитела
3) фагоциты и лимфоциты
4) вещества, вырабатываемые возбудителями
Выберите один, наиболее правильный вариант. Человеку, заболевшему дифтерией необходимо ввести
1) вакцину
2) сыворотку
3) антигены
4) физиологический раствор
Выберите один, наиболее правильный вариант. Противостолбнячная сыворотка содержит
1) ослабленных возбудителей болезни
2) антибиотики
3) антитела
4) бактерий, питающихся бактериями столбняка
Выберите один, наиболее правильный вариант. Активный искусственный иммунитет
1) человек получает при рождении
2) возникает после перенесенной болезни
3) образуется после предупредительной прививки
4) образуется после введения сыворотки
Установите соответствие между защитным свойством организма человека и видом иммунитета: 1) активный, 2) пассивный, 3) врожденный. Запишите цифры 1, 2 и 3 в правильном порядке.
А) наличие антител в плазме крови, полученных по наследству
Б) получение антител с лечебной сывороткой
В) образование антител в крови в результате вакцинации
Г) наличие в крови сходных белков – антител у всех особей одного вида
Установите последовательность этапов приготовления противодифтерийной сыворотки. Запишите соответствующую последовательность цифр.
1) получение дифтерийного яда
2) выработка стойкого иммунитета у лошади
3) приготовление противодифтерийной сыворотки из очищенной крови
4) очищение крови лошади – удаление из нее клеток крови, фибриногена и белков
5) многократное введение лошади дифтерийного яда через определенные промежутки времени с увеличением дозы
6) забор крови у лошади
Выберите три верных ответа из шести и запишите цифры, под которыми они указаны. Лечебные сыворотки характеризуются тем, что
1) используются для профилактики инфекционных заболеваний
2) содержат готовые антитела
3) содержит ослабленных или убитых возбудителей заболеваний
4) в организме антитела сохраняются недолго
5) используются для лечения инфекционных заболеваний
6) после введения вызывают заболевания в легкой форме
1. Установите соответствие между видом иммунитета 1) естественный, 2) искусственный - и способом его появления. Запишите цифры 1 и 2 в правильном порядке.
А) передается по наследству, врождённый
Б) возникает под действием вакцины
В) приобретается при введении в организм лечебной сыворотки
Г) формируется после перенесенного заболевания
Д) передается с материнским молоком
2. Установите соответствие между особенностями и видами иммунитета: 1) естественный, 2) искусственный. Запишите цифры 1 и 2 в порядке, соответствующем буквам.
А) невосприимчивость человека к чумке, поражающей собак
Б) невосприимчивость к кори после прививки
В) возникает после введения сыворотки
Г) вырабатывается после введения препаратов, содержащих антитела
Д) наследование невосприимчивости к инфекциям
Установите соответствие между характеристикой и видом лечебного препарата: 1) вакцина, 2) лечебная сыворотка. Запишите цифры 1 и 2 в порядке, соответствующем буквам.
А) содержит убитые или ослабленные вирусы или бактерии
Б) содержит готовые антитела
В) может вызвать заболевание в лёгкой форме
Г) вводится, как правило, заболевшему человеку или при подозрении на заражение
Д) участвует в формировании пассивного искусственного иммунитета
Е) образует активный искусственный иммунитет
Выберите три верных ответа из шести и запишите цифры, под которыми они указаны. Что характерно для естественного иммунитета человека?
1) передаётся по наследству
2) вырабатывается после перенесения инфекционного заболевания
3) вырабатывается после введения токсинов в организм
4) вырабатывается после введения ослабленных микроорганизмов
5) обеспечивается переходом антител из крови матери в кровь плода
6) формируется после введения человеку сыворотки
ВНИМАНИЕ! САЙТ ЛЕКЦИИ.ОРГ проводит недельный опрос. ПРИМИТЕ УЧАСТИЕ. ВСЕГО 1 МИНУТА.
Оргкомитет региональной предметной олимпиады школьников
МЕДИЦИНА
Задания заочного этапа олимпиады
Совместите цифру с буквой
Распределите характеристики соответственно органоидам клетки (поставьте буквы, соответствующие характеристикам органоида, напротив названия органоида):
| Органоиды | Характеристики |
| 1. Плазматическая мембрана 2. Ядро 3. Митохондрии 4. Пластиды 5. Рибосомы 6. ЭПС 7. Клеточный центр 8. Комплекс Гольджи 9. Лизосомы 10. Цитоскелет 11. Жгутики и реснички | А) Транспорт веществ по клетке, пространственное разделение реакций в клетке Б) Синтез белка В) Фотосинтез Г) Движение органоидов по клетке Д) Хранение наследственной информации Е) Немембранные Ж) Синтез жиров и улеводов З) Содержит ДНК И) Одномембранные К) Обеспечение клетки энергией Л) Самопереваривание клетки и внутриклеточное пищеварение М) Движение клетки Н) Двухмембранные О) Связь клетки с внешней средой П) Управление цитоскелетом и делением ядра Р) Есть только у растений С) Есть только у животных |
Ответ:______________________________________________________________
Сопоставьте буквы, соответствующие частям зародыша, напротив каждого органа или системы. Определите происхождение систем и органов.
| Системы органов: | Части зародыша: |
| 1. Кожа: - эпителий - дерма (соединительная ткань) | А) эктодерма Б) мезодерма В) энтодерма Г) первичные половые клетки А) эктодерма Б) мезодерма В) энтодерма Г) первичные половые клетки |
| 2. Скелет: - череп - позвоночник - ребра - кости конечностей | |
| 3. Мышцы | |
| 4. Пищеварительная система | |
| 5. Дыхательная система | |
| 6. Выделительная система | |
| 7. Нервная система | |
| 8. Органы чувств: - рецепторы - вспомогательный аппарат | |
| 9. Половая система: - гаметы - железы и половые пути |
Ответ:____________________________________________________________
3. Какая мутация принесет наибольший, а какая наименьший вред? У четырех разных эмбрионов в начале одного гена произошли разные мутации:
| Нормальная – РНК АУГГГАУЦГ | Мутагенная м – РНК: 1. АУГГАУЦГ 2. АУГГГАЦЦГ 3. АУГГГАУУГ 4. АУГГГАУЦЦ |
Для выполнения задания воспользуйтесь таблицей генетического кода:
Ответ:
4. Совместите букву с цифрой.Укажите количество хромосом и количество ДНК на разных стадиях формирования яйцеклетки
1. Овогонии а. 1n1c
2. Овоцит 1-го порядка б. 2n2c
3. Овоцит 2-го порядка в. 2n4c
4. Овотида г. 1n2c
Отметьте, верное утверждение
1. Антикодон т-РНК УУЦ соответствует триплету ДНК ААТ.
2. Один нуклеотид кодирует одну аминокислоту.
3. Один кодон кодирует одну аминокислоту.
4. Один ген эукариот кодирует один белок.
5. Один ген прокариот кодирует один белок.
6. Информация из ядра к рибосоме доставляется молекулами т-РНК.
7. Промотор – это участок гена, отвечающий за присоединение РНК – полимеразы к гену.
8. Рибосомы образуются в ядре.
9. Стадия клеточного цикла, во время которой удваивается ДНК, называется профазой.
10. У человека трисомия по 21-й паре хромосом вызывает синдром Дауна.
Ответ: __________________________________________________________
6. Установите последовательность этапов приготовления противодифтерийной сыворотки:
А. введение лошади дифтерийного яда
Б. получение дифтерийного яда
В. выработка стойкого иммунитета у лошади
Г. приготовление противодифтерийной сыворотки из очищенной крови
Д. очищение крови лошади – удаление из нее клеток крови, фибриногена и белков
Е. многократное введение лошади дифтерийного яда через определенные промежутки времени с увеличением дозы
Ж. забор крови у лошади
Ответ: ___________________________________________________
7. Опишите рисунок.На рисунке изображена структурно-функциональная единица почки - нефрон.
А) Какие компоненты данной структуры отмечены цифрами 1-7?
Б) Процесс образования и выделения мочи протекает в две фазы: фильтрации и реабсорбции. Опишите основные события, происходящие при этих процессах. Чем отличается первичная моча от вторичной? _____________________
В) Вставьте пропущенные слова:
Регуляция деятельности почек осуществляется (1)_______________ механизмами.
Сужение сосудов почек и усиление реабсорбции натрия происходит под влиянием ___________________ (2) отдела вегетативной нервной системы.
Напротив, ___________________ (3) нервы расширяют просвет сосудов почек, активируют реабсорбцию глюкозы и секрецию органических кислот. В гуморальной регуляции участвует ряд гормонов.
Гормон задней доли гипофиза ________________(4) усиливает реабсорбцию воды в почечных канальцах и т.о. уменьшает диурез.
Под влиянием гормона коры надпочечников ________________(5) увеличиваются реабсорбция ионов Na и секреция K и H в канальцах. Выведение почками неорганического фосфора и кальция регулируется ________________(6) и ________________(7).
Общие сведения. Противодифтерийная сыворотка применяется для лечения дифтерии. Антитоксический эффект отмечается только в первые 2 – 3 дня от начала заболевания. Раннее введение сыворотки быстро устраняет интоксикацию, прекращает развитие местного воспалительного процесса, предотвращает осложнения. Каждое введение сывороточного препарата должно быть зарегистрировано в карте стационарного больного ( учетная форма № 033/у) с обязательным указанием дозы, способа и времени введения, серии, срока годности, названия института, изготовившего препарат. Сыворотка выпускается в ампулах по 1000 АЕ и 2000 АЕ. К ней прилагается разведенная сыворотка (1:100). Ампулы с разведенной сывороткой маркируются красным цветом, с неразведенной – синим или черным.
Для предупреждения аллергической реакции немедленного типа (анафилактический шок, отек Квинке и др.) сыворотку вводят по методу Безредко с определением индивидуальной чувствительности е чужеродному белку лошадиной сыворотки. Для этого проводятся внутрикожная и внутривенная пробы.
В начале внутрикожно вводят разведенную 1:100 сыворотку, через 20 минут при отсутствии на нее реакции внутримышечно остальную дозу. При положительной пробе сыворотку назначают только по жизненным показаниям под наблюдением врача с особыми предосторожностями, с предварительным введением глюкокортикоидных гормонов и антигистаминных средств. В случае появления анафилактического шока введение сыворотки прекращают и проводят комплексную противошоковую терапию. В дальнейшем сыворотку водят под наркозом. При локализованных формах сыворотку назначают внутримышечно, при токсических – внутривенно.
Разовые дозы составляют 10000 - 120000 АЕ в зависимости от формы дифтерии. Курсовые дозы сыворотки в 2 – 2,5 раза выше разовых, но не более 450000 АЕ при токсических формах заболевания. Максимальный объем препарата, вводимого в одно место, не должен превышать 20 мл.
1. комплект ампул с противодифтерийной сывороткой, штатив для ампул, пилка;
2. шприцы однократного применения объемом 1мл – 2 шт., 5мл – 1 шт., иглы для набора лекарственных средств внутрикожных, подкожных, внутримышечных инъекций;
3. стерильный материал (ватные шарики, марлевые треугольники, пеленки ) в биксах;
4. стерильный лоток; 74
5. лоток для использованного материала и оснащения;
6. цапки в крафт-пакете;
7. пинцет в дезинфицирующем растворе;
8. спирт этиловый 70% или другой антисептический раствор для обеззараживания кожи;
9. емкость с теплой водой для подогрева сыворотки, водный термометр;
10. перчатки, маска;
11. водонепроницаемый фартук;
12. пеленальный стол с матрацем;
13. инструментальный столик;
14. емкость с дезинфицирующим раствором для обеззараживания поверхностей, использованного медицинского инструмента и освещения;
Подготовительный этап выполнения манипуляции.
1. Вымыть и просушить руки.
2. Надеть фартук, маску, перчатки.
3. Обработать дезинфицирующим раствором лотки, инструментальный столик, фартук, бикс. Вымыть и просушить руки.
4. Поставить на инструментальный столик необходимое оснащение.
5. Проверить наличие сыворотки с истекшим сроком годности, с отсутствием этикетки, поврежденные ампулы, с мутным содержимым, осадком, посторонними включениями.
6. Накрыть стерильный лоток.
Выполнить 1 пробу.
7. Обработать ампулу с разведенной сывороткой шариком, смоченным в спирте, надпилить, повторно обработать спиртом, вскрыть, поставить в штатив.
8. Распечатать упаковку со шприцем 1мл и иглой для набора лекарственных средств
9. Набрать в шприц 0,2 мл разведенной сыворотки.
10.Надеть на шприц иглу для внутрикожного введения, выпустить воздух и избыток сыворотки.
11.Положить шприц в лоток. Обработать руки спиртом.
Основной этап выполнения манипуляции.
12.Обработать кожу внутренней поверхности предплечья двумя шариками со спиртом (широко, затем узко) двукратно.
13.Ввести внутрикожно 0,1 мл разведенной сыворотки. При введении образуется папула белого цвета. В течение 20 минут необходимо наблюдать за общей и местной реакциями: проба отрицательная, если диаметр отека и (или) гиперемии кожи менее 10 мм. Проба положительная, если отек и (или) гиперемия кожи 10мм и более.
Вскрытая ампула сыворотки в разведении 1:100 хранению не подлежит.
Если проба отрицательная, выполнить II пробу.
75
Подготовительный этап выполнения манипуляции.
1. Вымыть и просушить руки.
2. Обработать ампулу с неразведенной сывороткой шариком, смоченным в спирте, надпилить, повторно обработать спиртом, вскрыть, поставить в штатив.
3. Собрать шприц объемом 1мл, закрепить иглу для набора лекарственных средств.
4. Набрать в шприц объемом 0,2мл неразведенной сыворотки, иглу оставить в ампуле и накрыть ее марлевым треугольником. Вскрытую ампулу с неразведенной сывороткой хранят при температуре 20 +/ - 2 град.С не более 1 часа.
5. Закрепить иглу для подкожного введения, выпустить воздух и избыток сыворотки. Положить шприц в лоток. Обработать руки спиртом.
Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и может быть использовано для диагностики дифтерии. Сущностью изобретения является получение диагностикума путем выращивания дифтерийных микробов на плотной питательной среде, приготовления из них суспензии густотой 1000 ОЕ/мл, прогревания ее при 56. 58 o С в течение 40 мин, обработки формалином и мертиолятом, отмывания 0,15М раствором хлорида натрия, дезинтеграции, выделения из нее посредством диализа через мембрану с порами 40-60 нм дифтерийного диализатного антигена (ДДА), разведения его до концентрации 250-400 мкг/мл по белку и соединения его в объеме 1 мл с 3 мл 50%-ных формалинизированных эритроцитов барана, отмытых 0,15М раствором хлорида натрия, 5 мл 20%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. массой 6000 кД и 4 каплями формалина. После этого полученную взвесь выдерживают 2 ч при 22. 24 o С и 1 сутки при 4. 8 o С. Техническим результатом является сокращение сроков получения диагностикума и повышение его эффективности. 3 табл.
Изобретение относится к области медицины, а точнее - к микробиологии, и может быть использовано для диагностики дифтерии.
В настоящее время актуальность дифтерийной инфекции сохраняется несмотря на широко проводимую специфическую профилактику (В.В. Краснов, И.В. Орлов. Особенности дифтерии у детей на современном этапе //Современные проблемы педиатрии. Материалы YIII съезда педиатров России, - Москва, 24-26 февраля 1998, -с.150-151; С.С. Маркина, А.А. Монисов. Дифтерия в России в 1990-1994 годах// Проблемы эпидемиологии, микробиологии и клиники капельных и кишечных инфекций. - М., 1996,-с.18-20). Регистрируются случаи заболевания дифтерией и среди привитых, имеющих защитные уровни противодифтерийных антитоксических антител, а также перенесших дифтерию (А.Г. Рахманова, В.К. Пригожина. Смертельные исходы дифтерии у взрослых, привитых против дифтерии// Клиническая медицина, - 1996.- N9.- с.67-69). Дифтерийная инфекция характеризуется большим разнообразием клинических форм. Различают дифтерию ротоглотки, носа, гортани, трахеи, бронхов, глаз, кожи. а также возможно формирование носительства токсигенных C.diphtheriae (М.Х. Турьянов, Н.М. Беляев, А.Д. Царегородцев и др. Дифтерия. - М.,- 1996.-254 с.). Ведущую роль в возникновении дифтерии играет дифтерийный токсин, который является политропным ядом, поражающим клетки нервной системы, почек, миокарда, надпочечников, легких (Ж.И. Возианова, А. К. Дуда, Е.Н. Амисова. Диагностические критерии дифтерийного миокардита// Врачебное дело.-1999,- N4,-с.22-27; В.А. Капустян, В.В. Болдырев, Е. Ф. Седак. Осложнения дифтерии// Терапевтический архив.-1993,-том 65. -N3, -с. 75-77). Однако важную роль в патогенезе дифтерии играют и бактериальные антигены, входящие в состав клеточных стенок C.diphtheriae и обусловливающие прикрепление возбудителя на эпителиальных клетках организма человека (Л.А. Фаворова, Н.Ф. Астафьева, М.П. Корженкова и др. Дифтерия. - М.,- 1998. - 208 с.) В связи с этим в организме человека при дифтерийной инфекции идет выработка как антитоксических, так и антибактериальных антител, определение уровня которых может быть использовано с целью диагностики дифтерии. Определение противодифтерийных антител осуществляют с помощью эритроцитарных дифтерийных антигенных диагностикумов.
Проведенными исследованиями по патентной и научно-медицинской литературе выявлены различные методы приготовления дифтерийных диагностикумов.
Н.М. Булатова (Н.М. Булатова. К методике получения антимикробных антигенов коринебактерий дифтерии и изучение их антигенных и иммуногенных свойств в эксперименте// Вопросы эпидемиологии и прикладной иммунологии. - часть 1.- Казань,-1975.- с.63-69) предложила способ получения дифтерийного антигенного диагностикума на основе антигена коринебактерий дифтерии, выделенного путем экстракции хлороформом и дезоксихолатом натрия. Однако полученный диагностикум обладал сниженной антигенной активностью, так как для его приготовления авторы использовали химические вещества (хлороформ и дезоксихолат натрия), которые обладали повреждающим действием на белковые антигены коринебактерий дифтерии.
Н. Н. Басова с соавт. (Н. Н. Басова, О.И. Ивченко, Г.И. Коростылева. Способ определения состояния иммунитета при дифтерийной инфекции//а.с.N 1534401, МПК G 01 N/33/53) предложили способ определения состояния иммунитета для диагностики дифтерии с помощью дифтерийного антигенного эритроцитарного диагностикума. Однако данный диагностикум мог быть использован только при обследовании больных, которым не вводили с целью лечения противодифтерийную сыворотку (ПДС).
Наиболее близким техническим решением, принятым в качестве прототипа, является опубликованный в ЖМЭИ, 1967, 1, с. 133-134 в статье М.И. Леви, Г.А. Фоменко, Ф. Е. Крацова "Стойкий эритроцитарный диагностикум для обнаружения столбнячного и дифтерийного анатоксинов и антител к ним" способ получения диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного (анотоксинного) (регистрационный номер 97/306/1, Государственный реестр лекарственных средств, МЗ России, Москва, 1998, с.194) на основе антигена (дифтерийного анатоксина), который получают по методу, описанному в сборнике "Вакцины и сыворотки", Москва, вып.21, 1974, с. 113-114.
Этот способ предусматривает культивирование дифтерийных микробов (С.diphtheriae, биовар gravis) в реакторе с питательной средой при 34. 35 o С в течение 36-40 ч. После завершения культивирования микробную взвесь сливают в стерильные емкости-сборники и подают на суперцентрифугу ОГО-100 для отделения токсина от микробной массы. После центрифуги токсин поступает в стерильный герметически закрытый сборник, откуда под давлением подается на 3-7 рамные фильтры Сальникова со стерилизующими пластинами. После стерилизации токсин поступает в реакторы-детоксикаторы для перевода его в анатоксин. При повторном помешивании туда добавляют 0,65% формалина, инкубируют при 39. 40 o С в течение 5 суток. Затем частично обезвреженный токсин очищают, стерилизуют, добавляют 0,15% формалина и инкубируют при 39. 40 o С в течение 15 суток. Полученный таким образом дифтерийный анатоксин (ДА) используют для приготовления дифтерийного диагностикума. Для этого смесь равных объемов 2,5% взвеси формализированных эритроцитов барана и раствора танина (1:20000) оставляют при комнатной температуре на 15-30 мин, после чего эритроциты 2-3 раза отмывают физиологическим раствором. Затем к 2,5% взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов добавляют очищенный анатоксин и фосфатный буфер, с тем, чтобы в смеси установилась рН 6,4 и определенная концентрация дифтерийного анатоксина (10-20 Lf в 1 мл). Смесь дифтерийных компонентов выдерживают в термостате при 37 o С 2 ч при периодическом встряхивании. За 1-1,5 ч до окончания сенсибилизации добавляют 1%-ный раствор формалина. После сенсибилизации эритроциты трижды отмывают на холоду 5-6 объемами физиологического раствора (по 5 мин) при 2000 об./мин, ресуспендируют до 2,5% взвеси в 0,4%-ном растворе нормальной кроличьей сыворотки, прогретой в течение 30 мин при 56 o С, и добавляют формалин до 1%-ной его концентрации. Полученный таким образом продукт используют в качестве эритроцитарного дифтерийного антигенного (анатоксинного) диагностикума.
Существенным недостатком данного способа является длительный срок получения целевого продукта (порядка 522 ч) и его недостаточная эффективность. Это связано с тем, что больным с подозрением на дифтерию при поступлении в стационар вводят противодифтерийную антитоксическую сыворотку (ПДС), содержащую антитела к ДА. При исследовании крови с помощью данного диагностикума у больных выявляют как собственные антитела к ДА, так и антитела к ДА, входящие в состав ПДС, тогда как для диагностики дифтерии необходимо определять только собственные противодефтерийные атитела.
Целью настоящего изобретения является сокращение сроков получения диагностикума и повышение его эффективности.
Эта цель достигается путем выращивания дифтерийных микробов на плотной питательной среде, приготовления из них суспензии густотой 1000 ОЕ/мл, прогревания ее при 56. 58 o С в течение 40 мин, обработки формалином и мертиолятом, отмывания 0.15М раствором хлорида натрия, дезинтеграции, выделения из нее посредством диализа через мембрану с порами 40-60 нм дифтерийного диализатного антигена (ДДА), разведения его до концентрации 250-400 мкг/мл по белку и соединения его в объеме 1 мл с 3 мл 50%-ных ФЭБ, отмытых 0.15М раствором хлорида натрия, с 5 мл 20%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. массой 6000 кД и 4 каплями формалина. После этого полученную взвесь выдерживают 2 ч при 22. 24 o С и 1 сутки при 4. 8 o С.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.
Микробные штаммы С. diphtheriae, биовар gravis, серотип 2, полученные из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А.Тарасовича, предварительно выращивают на плотной питательной среде с добавлением 20. 25% сыворотки крупного рогатого скота в течение 24 ч, суспендируют в стерильном 0,5M растворе хлорида натрия, доводя густоту микробной взвеси до 1000 ОЕ/мл, контролируя ее с помощью стандартного образца мутности (Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича), прогревают при 56. 58 o С в течение 40 мин, добавляют формалин до концентрации 0,5% и мертиолят до концентрации 0,001% и выдерживают в термостате при 37 o С в течение 24 ч. После этого взвесь отмывают 0,15М раствором хлорида натрия при 3000 об/мин с помощью центрифуги лабораторной клинической ОПН-3 в течение 20 мин. Полученный осадок ресуспендируют в исходном объеме хлорида натрия и дезинтегрируют воздействием низкочастотного ультразвука в течение 15 мин с помощью низкочастотной ультразвуковой установки ДБУ-1. Полученный дезинтеграт диализуют через мембрану с размерами пор 40-60 нм (диализ проводят против 0,15М раствора хлорида натрия, содержащего 0,001% мертиолята, в шуттель-аппарате при 3. . . 5 0 С в течение 6 дней) и выделяют дифтерийный диализатный антиген (ДДА).
ДДА разводят 0,15М раствором хлорида натрия до концентрации по белку (Лоури) - 250-400 мкг/мл. Затем 1 мл полученного раствора ДДА соединяют с 3 мл отмытых в 0,15М растворе хлорида натрия коммерческих 50%-ных формалинизированных эритроцитов барана (ФЭБ), с 5 мл 20%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. массой 6000 кД и 4 каплями формалина. Взвесь выдерживают 2 ч при 22. 24 0 С и 1 сутки при 4. 8 o С в холодильнике.
Весь процесс приготовления диагностикума занимает порядка 219 ч.
Эффективность полученного дифтерийного антигенного диагностикума была проверена с использованием стандартных сывороток (Таблица 1).
Исходя из данных, приведенных в таблице, видно, что дифтерийный антигенный диагностикум обладал высокой активностью при исследовании агглютинирующих дифтерийных сывороток. Специфичность диагностикума подтвердили отрицательные результаты исследования стандартных недифтерийных сывроток (столбнячной, коклюшной, эшерихиозной, сальмонелпезной), а также отрицательный результат исследования стандартной дифтерийной антитоксической сыворотки, свидетельствующий о том, что данный диагностикум не выявляет антител к дифтерийному анатоксину, входящих в состав ПДС.
Применение полученного антигенного диагностикума. приготовленного согласно предлагаемому способу, и сопоставительный анализ его активности по сравнению с прототипом поясняется примерами из клинической практики VI инфекционного отделения БСМП N 1 г. Ростова-на-Дону.
Пример 1. У 50 больных с диагнозом "дифтерия" забрали кровь на 1-2 день заболевания (после введения ПДС) и 7-10 день заболевания (после введения ПДС) и исследовали ее с дифтерийным антигенным диагностикумом на основе ДА и с дифтерийным антигенным диагностикумом на основе ДДА с целью подтверждения диагноза. (Таблица 2).
Результаты исследования крови больных дифтерией (50 чел.) с диагностикумом на основе ДДА в 88% случаев совпали с диагнозом "дифтерия", что было подтверждено нарастанием уровня антител у них в динамике заболевания. При исследовании крови этих же больных (50 чел.) с диагностикумом на основе ДА диагноз "дифтерия" не был подтвержден ни в одном случае, так как нарастания уровней антител ни у кого из обследуемых обнаружено не было. Это можно объяснить тем, что после введения ПДС уровень антител к ДА у обследуемых не изменяется в течение заболевания и диагностикум на основе ДА не позволяет проводить подтверждение диагноза "дифтерия".
У 20 больных с подозрением на дифтерию забрали кровь на 1-2 день заболевания (до введения ПДС) и на 7-10 день заболевания (после введения ПДС) и исследовали ее с дифтерийным антигенным диагностикумом на основе ДА и с дифтерийным антигенным диагностикумом на основе ДДА с целью подтверждения диагноза "дифтерия". (Таблица 3).
Результаты исследования крови больных (20 чел.) с диагностикумом на основе ДДА в 90% случаев совпали с окончательным диагнозом, тогда как при использовании диагностикума на основе ДА процент совпадений с окончательным диагнозом составил 70%. Это связано с тем, что у всех больных после введения ПДС, независимо от наличия у них дифтерии, выявляли нарастание уровней антител к ДА, а уровень антител к ДДА не зависел от введения ПДС и возрастал только у больных дифтерией.
Таким образом, предлагаемый способ получения дифтерийного антигенного диагностикума имеет следующие преимущества перед прототипом: позволяет сократить сроки приготовления диагностикума с 523 до 219 ч и повысить эффективность диагностикума, с помощью которого практически в 90% случаев независимо от введения ПДС возможно подтверждать диагноз "дифтерия" исключительно посредством определения собственных противодифтерийных антител, не входящих в состав ПДС.
Способ получения дифтерийного антигенного диагностикума путем выращивания дифтерийных микробов, соединения формалинизированных эритроцитов барана и дифтерийного антигена, отличающийся тем, что дифтерийные микробы выращивают на плотной питательной среде (питательный агар с добавлением 20. . . 25% сыворотки крупного рогатого скота), готовят из них суспензию густотой 1000 ОЕ/мл, прогревают при 56. . . 58 o С в течение 40 мин, добавляют формалин до концентрации 0,5% и мертиолят до концентрации 0,001%, выдерживают в термостате при 37 o С 24 ч, отмывают 0,15 М раствором хлорида натрия, дезинтегрируют, выделяют дифтерийный диализатный антиген путем диализа через мембрану с порами 40-60 нм, разводят антиген до концентрации 250-400 мкг/мл по белку и соединяют его в объеме 1 мл с 3 мл 50%-ных формалинизированных эритроцитов барана, отмытых 0,15 М раствором хлорида натрия, с 5 мл 20%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 кД и 4 каплями формалина и выдерживают 2 ч при 22. . . 24 o и 1 сутки при 4. . . 8 o С.
Читайте также: