Длительность существования мРНК антител. Влияние мРНК на синтез иммуноглобулинов
Добавил пользователь Алексей Ф. Обновлено: 06.11.2024
В результате беспрецедентной скорости в разработке новых вакцин, миру были представлены первые клинически одобренные мРНК-вакцины для борьбы с пандемией Covid-19 – одна из них произведена Pfizer и BioNTech, другая – компанией Moderna. Испытания показали эффективность этих вакцин на уровне не менее чем 94%.
1. Технология мРНК вакцин не так молода, как кажется
Классический механизм работы вакцин (например, против полиомиелита и гриппа) заключается в презентации иммунной системе инактивированных частиц вируса. Другие вакцины (например, против гепатита B) используют отдельно взятый белок, являющийся частью инфекционного агента, чтобы вызвать схожий иммунный ответ.
мРНК-вакцины работают по другому принципу, "обманывая" иммунную систему таким образом, что РНК (в основном матричная мРНК) кодирует белок, который продуцируется в клетке путем трансляции и представляется иммунной системе; он действует как антиген. Иммунная система учится избирательно бороться с клетками, экспрессирующими такие антигены, такими как клетки-хозяева, инфицированные вирусами, или опухолевые клетки.
Хотя вакцины от Pfizer/BioNTech и Moderna – первые препараты, одобренные в клинической практике, сама технология мРНК-вакцин существует относительно давно. Первые испытания в онкологии с использованием схожих технологий берут свое начало еще в 2011 году.
2. мРНК-вакцины не изменяют ДНК
Существуют абсолютно необоснованные опасения, что мРНК-вакцины способны изменять ДНК. На самом же деле мРНК не входит в ядро клетки, а после своего введения биодеградирует в течение нескольких дней. Именно поэтому для формирования полноценного иммунного ответа необходимо 2 инъекции препарата.
3. мРНК-вакцины имеют высокую специфичность
Вирус SARS-CoV-2 имеет достаточно сложную структуру и его различные части стимулируют иммунную систему на образование нейтрализующих антител, которые не всегда способны эффективно элиминировать инфекцию. мРНК-вакцины стимулируют иммунный ответ к спайк-белку вируса, являющегося только частью вирусной мембраны.
4. Разработчики и эксперты не "срезали углы" во время клинических испытаний
Испытания вакцин начались с доклинической фазы, проводимой на животных, а затем постепенно переходили на 1-ую, 2-ую и 3-ю фазы. Например, 3-я фаза вакцины от Pfizer/BioNTech включает более 40 000 человек, исследования эффективности и безопасности будут продлжаться следующие 2 года.
Основные проблемы, связанные с использованием вакцины, обычно возникают в первые 2 месяца. Тем не менее, не исключены редкие побочные эффекты на больших выборках в миллионы людей, поэтому за вакцинированными необходимо пристальное наблюдение, особенно с учетом инновационной природы технологии.
5. Вакцина запускает воспалительные реакции
Частично вакцина работает путем индуцирования локальных иммунных реакций, поэтому воспалительные признаки в месте инъекции и небольшой дискомфорт в первые дни – вполне нормальное явление.
Длительность существования мРНК антител. Влияние мРНК на синтез иммуноглобулинов
Время жизни мРНК в миеломных и нормальных лимфондных клетках определяют либо по кинетике включения метки в мРНК (Storb, 1973), либо по времени синтеза иммуноглобулинов после полного прекращения синтеза мРНК под действием специфических ингибиторов, чаще всего — актиномицина D. Полученные данные весьма противоречивы. Так, время жизни мРНК для миеломных иммуноглобулинов, по данным разных авторов, колеблется от 1—4 час (Namba, Hanaoka, 1969; Shutt, Krueger, 1972) до 12—14 час (Cowan, Milstein, 1974) и 89 час (Storb, 1973).
Время жизни Н- и L-мРНК в миеломных клетках, по-видимому, одинаково.
Определение времени жизни мРНК в нормальных тканях является еще более сложным делом, так как в силу гетерогенности системы в большинстве случаев неизвестно, к каким мРНК относятся полученные величины. Между результатами разных авторов здесь наблюдаются еще большие расхождения, чем в случае миеломных мРНК. По-видимому, наиболее достоверными следует считать данные, полученные при исследовании действия актиномицина D на синтез РНК непосредственно в антителопродуцирующих клетках мышиной селезенки (Neyer, Bus-sard, 1972).
В этих опытах было подсчитано, что время жизни тотальных мРНК селезенки равно примерно 2 час, а время жизни мРНК, кодирующих синтез гемолизинов,— не менее 4 час. По некоторым другим данным, время жизни мРНК в клетках лимфоузлов иммунизированного кролика и лимфоцитах человека равно 3—8 час (Ambrose, 1969; Lerner е. а., 1972). В то же время на основании ауторадиографических исследований антителопродуцирующих клеток был сделан вывод об относительной независимости синтеза белков от синтеза РНК и о стабильности мРНК, кодирующей синтез антител в течение времени, необходимого для превращения плазмобласта в зрелую плазматическую клетку, т. е. в течение 24 час, а максимум — в течение месяца (Mitchell, Nossal, 1963; Miller, 1964).
Можно думать, что выделение индивидуальных мРНК позволит внести ясность и в эти вопросы.
Влияние мРНК на синтез иммуноглобулинов
Возникает вопрос, если под действием мРНК в различных системах, в том числе совершенно посторонних, таких, как ооциты лягушки, ретикулоциты кролика, клетки Кребса, удается индуцировать синтез полипептидных цепей иммуноглобулинов, то, может быть, аналогичный процесс идет и в лимфоидной ткани. Действительно, «наведение» синтеза антител и мембранных иммуноглобулинов в нормальных клетках под действием иммунной РНК описано рядом авторов, хотя имеются и данные противоположного характера (Roelants, Goodman, 1969).
Тщательная проверка иммуногенных препаратов РНК выявила в них следы антигена (Askonas, Rhodes, 1965; Gottlieb, 1968); кроме того, было показано, что так называемая иммунная РНК существует и в нормальных клетках и имеет молекулярный вес значительно меньший, чем необходимо иммуноглобулиновой мРНК. Однако в свете последних идей о механизме внедрения микронуклеотидных последовательностей в V-геиы (Wu, Kabat, 1970), вероятно, можно предположить что эта низкомолекулярная РНК, легко соединяющаяся с антигеном и резко усиливающая его нммуногеиность, и есть «гипервариабельная» мРНК.
Следует отметить, что это предположение можно проверить экспериментально, выделив разные иммунные РНК и проанализировав в них последовательности нуклеотидов. Хотя большинству исследователей эти предположения кажутся маловероятными, исключить передачу мРНК от клетки к клетке, по-видимому, нельзя.
Предполагалась также и индукция образования антител с помощью ДНК (Pelc е. а., 1972). Косвенно в пользу передачи информации с помощью коротких отрезков ДНК свидетельствуют недавно появившиеся данные об экскретнруемой лимфоидными клетками ДНК.
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
Трансляция мРНК. Особенности трансляции мРНК при синтезе антител
Биологическая активность выделенных препаратов мРНК оценивается по их способности синтезировать в бесклеточных системах соответствующие полипептидные цепи. Определяя величину синтеза специфических пептидов по отношению ко всем вновь синтезированным, можно определить также чистоту препарата мРНК. Необходимым условием при этом является использование для мечения белка не какой-нибудь одной аминокислоты, но смеси по меньшей мере из 10 радиоактивных аминокислот и анализ продуктов синтеза методами с высокой разрешающей способностью (например, двумерное картирование пептидов).
Для трансляции мРНК используют бесклеточные системы трех типов: из асцитной гепатомы Кребса (Swan е. а., 1972; Schechter, 1973). ретикулоцитов кролика (Stavnezer, Huang, 1971; Mach e. a., 1973; Cowan е. а., 1976) и проростков пшеницы (Schechter, Burstein, 1976; Storb, Marvin, 1976). Наиболее удобной, по-видимому, является последняя система. Выход меченого предшественника в ней составляет 0,1 пмолей, или 2,6 нг на 0,007 А2во единиц внесенной мРНК (Schechter, Burstein, 1976).
Поскольку на данном этапе задачей описываемых исследований является изучение потенциальной трансляционной способности мРНК, а растительные и животные бесклеточные системы в принципе ведут себя в этом отношении одинаково (Schechter, Burstein, 1976), то степень пригодности и преимуществ той или иной системы, очевидно, определяется следующими тремя параметрами: величиной эндогенного белкового синтеза (чем ниже, тем лучше), доступностью и простотой требуемых ингредиентов и количеством мРНК, которую надо внести в систему для получения достоверного синтеза исследуемого белка.
Аналогом бесклеточной системы иногда служат также ооциты лягушки. Было показано (Smith е. а., 1973), что введение в ооциты мРНК, кодирующей цепи иммуноглобулинов., приводит к синтезу этих цепей. Этот метод, однако, более сложен и требует значительных количеств мРНК.
Большинство опытов по трансляции проведено с мРНК, которые кодируют синтез L-цепей (L-мРНК), так как их выделение значительно проще, чем выделение мРНК, кодирующих синтез Н-цепей (Н-мРНК). Изучение продуктов трансляции мРНК, кодирующих L-цепи миеломных иммуноглобулинов, привело к неожиданному результату. Оказалось, что в бесклеточных системах мРНК кодируют синтез полипептидов (предшественников), больших по размерам, чем зрелые L-цепи. Впервые образование более тяжелого продукта под действием 13S мРНК из клеток плазмоцитомы МОРС 41 описали Сван и соавторы (Swan е. а., 1972), под действием 10—14S мРНК из клеток плазмоцитомы МОРС 21 — Мильштейн и соавторы (Milstein е. а., 1972). Молекулярный вес образующегося продукта был больше молекулярного веса соответствующих L-цепей (на 1500), из чего было сделано заключение о наличии в нем 15 дополнительных аминокислотных остатков.
Поскольку при добавлении к бесклеточной системе 355-формилметионин-тРНК в качестве единственного источника метки 355-метионии обнаруживался в тяжелом компоненте, было сделано заключение, что по крайней мере часть этих дополнительных аминокислот расположена на NH2-коице молекулы L-цепи (у эукариотов синтез полипептидных цепей начинается с включения метионина). В дальнейшем данные о синтезе предшественника были подтверждены в опытах с мРНК» кодирующими синтез x-L-цепей МОРС 70Е (Toncgawa, Baldi, 1973), МРС„ (Storb, Marvin, 1976), МОРС 41 (Mach e. a., 1973), МОРС 321 (Schechter, Burstein, 1976), МОРС 63 (Schechter е. а., 1976) и L-цепей МОРС 104Е (Burstein е. а., 1976).
мРНК участвующие в синтезе антител. Методы изучения мРНК
В настоящее время наметилось два подхода — химический и иммунохимический. В основе первого лежит химическое фракционирование мРНК, выделенных из клеток, продуцирующих иммуноглобулины. Основными этапами являются: выделение из мисломных клеток микросом или связанных с мембранами полирибосом (Stavnezer е. а., 1971; Milstein е. а., 1972); экстракция из них РНК в условиях, предупреждающих их деградацию; фракционирование РНК в градиенте плотности сахарозы; выделение фракций, соответствующих по размерам предполагаемой мРНК; очистка их от рибосомальных РНК на колонках с олиго((1Т)- или поли (У)-целлюлозой (или сефарозой), задерживающих только богатые аденнловыми основаниями мРНК (полиА-мРПК), и исследование биологической активности выделенных фракций.
В ряде случаев для дополнительной очистки препаратов мРНК используется электрофорез в полнакрпламидном геле в присутствии 99%-ного формамида (Farace е. а., 1976; Matthyssens с. а., 1976). С теми или иными вариациями приведенная выше схема используется в настоящее время подавляющим большинством исследователей. Выход индивидуальной полиА-мРНК обычно составляет 0,01% от внесенного количества РНК (Brownlee е. а., 1973). В результате в настоящее время выделено нз плазмоцитом МОРС 70Е, МОРС 21, МОРС 41 несколько мРНК, кодирующих как Н-, так и L-цепи. Чистота большинства этих препаратов не превышает 40—60%.
Лишь одной группе авторов удалось недавно таким способом получить мРНК более чем 90%-ной чистоты (Matthyssens е. а., 1976). Это не удивительно. Использованный метод основан, во-первых, на разделении молекул РНК по их молекулярному весу и, во-вторых, на отделении популяции полиЛ-содержащих РНК от лишенных ее.
Естественно, что в клетках может присутствовать ряд мРНК с аналогичными свойствами, не имеющих отношения к иммуноглобулинам. Все эти РНК неизбежно будут загрязнять препараты индивидуальной иммуноглобулиновой РНК. Очевидно, что в зависимости от относительной доли синтезируемого клетками иммуноглобулина этих примесей будет либо больше, либо меньше.
Поэтому для выделения мРНК из миелом, синтез иммуноглобулинов в которых достигает 30—40% от синтеза всех белков вообще, этот метод может быть использован; в то же время для выделения мРНК, кодирующих синтез иммуноглобулинов, из нормальных лимфоидных тканей, особенно из чрезвычайно гетерогенной по клеточному составу селезенки, он явно непригоден.
Значительно более перспективным, с нашей точки зрения, является иммунохимический подход к решению этой проблемы. Преимущество его заключается в том, что уже первый этап фракционирования предполагает строго специфическое выделение индивидуальных полирибосом с помощью антител к синтезируемому этими полирибосомами белку. Существует три варианта этого метода. Первый — осаждение полирибосом антителами к синтезируемому ими белку в присутствии носителя, т. е. того же самого белка (копреципитация) (Delovitch е. а., 1972; Laskov, Mitelman, 1975).
Второй — обработка полирибосом антителами к синтезируемому ими белку и осаждение полученного комплекса антисывороткой к антителам (непрямая преципитация) (Schechtcr, 1973, 1974а). И третий — извлечение индивидуальных полирибосом с помощью иммуносорбентов, содержащих ковалентно или нековалентно связанные антитела к синтезируемому на полирибосомах белку (Сидорова и др., 1973; Sidorova с. а., 1974; Любимова и др., 1975). Из полученных таким образом индивидуальных полирибосом тем или иным способом экстрагируют полисомные РНК и извлекают мРНК, пропуская эту смесь через колонки с олиго- или поли (У)-целлюлозой. С помощью иммунохимического подхода удалось получить препараты мРНК примерно 95%-ной чистоты.
Свойства мРНК антител. Структура мРНК иммуноглобулинов
Выделение относительно чистых препаратов мРНК позволило перейти к прямому изучению их физико-химических свойств и структуры. Сразу же обнаружилось, что константы седиментации, а следовательно, и молекулярные веса и размеры мРНК, кодирующих Н- и L-цени, значительно выше ранее предполагавшихся. Константы седиментации мРНК для Н-цепей определены ровными 12—17S (Namba, Hanaoka, 1969; Bernardini, Tonegawa, 1973; Cowan e. a., 1976), а для L-мРНК —12— 15S (Tonegawa, Baldi, 1973; Mach e. a., 1973; Schechter e. a., 1976).
Соответственно молекулярные веса этих мРНК составляют 440 000 в случае L-мРНК, а не 220 000, как считалось ранее, и 650 000, а не 400000 для Н-мРНК. Число нуклеотидов в L-мРНК составляет 1100—1250, а в Н-мРНК —1900.
Легко подсчитать, что для синтеза L-цепи, состоящей из 214 аминокислотных остатков, требуется всего ~650 нуклеотидов (м. в. 220 000). Для синтеза предшественника, содержащего дополнительно 20 NH2-концевых и 25 СООН-концевых аминокислотных остатков, требуется еще 60 и 75 нуклеотидов (м. в. 45 000). Итого для синтеза предшественника L-цепи достаточно 785 нуклеотидов, т. е. ~65% всех имеющихся в мРНК.
Аналогично для синтеза Н-цепей, состоящих из 450 аминокислот, требуется 1350 нуклеотидов, а в Н-мРНК, как мы видели, входит 1900. Таким образом, число экстр а нуклеотидов в этом случае составляет 650. Что же представляют собой «неиспользуемые» 30% нуклеотидов, где они расположены и какова их функция?
Изучение строения двух мРНК, кодирующих L-цепи (Brownlee е. а., 1973; Faust е. а., 1974), и одной мРНК, кодирующей Н-цепь (Вегпаг-dini, Tonegawa, 1973, 1974) показало, что 200 нуклеотидов (м. в. 65000) в этих мРНК приходится на долю полиА-последовательности, располагающейся на 3'-конце молекул. Функция их пока неясна. Очевидно лишь, что поскольку полиА-нуклеотиды обнаружены у всех исследованных до сих пор мРНК, кодирующих синтез белков как связанными, так и свободными полирибосомами (Rosenfeld е. а., 1972), то специального отношения к синтезу секретируемых белков вообще и иммуноглобулинов в частности они не имеют.
Известно, что полиА-конец присоединяется к молекуле мРНК уже после завершения ее синтеза. Предполагается, что полиА-участок играет роль при транспорте мРНК из ядра в цитоплазму, однако наличие полиА-участка в вирусном геноме, реплицирующемся в цитоплазме, свидетельствует о том, что у полиА-нуклеотидов должны быть и другие функции. Не исключено, что участок полиА нужен для изменения вторичной и третичной структуры мРНК и повышения ее стабильности или для связывания мРНК с полирибосомами; может быть, он играет роль в трансляции мРНК, хотя однозначно это не доказано (Rosenfeld е. а., 1972).
Кроме 200 нуклеотидов, приходящихся на долю участка полиА, в L-мРНК остается еще 200 нуклеотидов, не транслируемых и неизвестно где расположенных.
В L-цепьевой мРНК из клеток МОРС 41 недавно были найдены незначительные количества N6-метилгуанозина и N7-метилгуанозина, расположенного на 5'-конце и связанного с соседними нуклеотидами 5',5'-пирофосфатной связью. Сейчас известно, что наличие метилгуанидилового остатка на 5'-конце необходимо для стабилизации и трансляции мРНК у эукариотов.
Данные по расшифровке строения мРНК носят предварительный характер. По свидетельству самих авторов, неточно определены размеры нетранслируемого участка на 5'-конце мРНК; пока только 194 нуклеотида удалось «приписать» кодируемой области белковой цепи, состоящей из 75 аминокислот (из 214 во всей L-цепи).
Сходная работа была проведена и с мРНК, кодирующей Н-цепи МОРС 21 (Cowan е. а., 1976). Использование одного из мутантов МОРС 21, синтезирующего Н-цепи с делецией Сн1 -домена, позволило расшифровать 18 олигонуклеотидов, содержащих 202 основания и принадлежащих как V-, так и С-областям. В Н-мРНК также были обнаружены полиА- и нетранслируемые нуклеотиды.
Необходимо отметить, что принципиальное значение результатов, полученных в этих опытах, заключается еще и в том, что они окончательно решили вопрос о синтезе Н- и L-цепсй как единого целого и о слиянии информации о структуре V- и С-областей на уровне ДНК-Действительно, в L-мРНК удалось не только выявить последовательности нуклеотидов, кодирующие V- и С-области, и показать, что они расположены на одной молекуле, но даже выделить олигонуклеотид, кодирующий остатки 105—108, т. е. место сочленения V- и С-областей.
Как мы видели ранее, аналогичные данные были получены и с помощью другого подхода также на молекулярном уровне.
Кроме того, в пользу слияния V- и С-генов на уровне ДНК и считывания информации уже с таких объединенных генов, как с одного гена, свидетельствуют опыты с соматическими гибридами клеток, продуцирующих иммуноглобулины, различающиеся по своим V- и С-областям (Margulies е. а., 1977; Milstein е. а., 1977). Ни в одном из таких опытов не наблюдалось образования рекомбинаптных молекул, содержащих V-область, кодируемую одним партнером, а С-область, кодируемую другим.
Читайте также: