Саузерн-блоттинг в молекулярной генетике. Особенности

Добавил пользователь Валентин П.
Обновлено: 21.12.2024

Mетод обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей путем переноса электрофретически разделенных фрагментов ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный (бумажный) фильтр за счет капиллярного эффекта (“blotting” - буквально: “промокание”) и гибридизации с меченым ДНК- или РНК-зондом, комплементарным искомой последовательности; образование гибридов обнаруживают методом авторадиографии < autoradiography >; метод разработан Э.Саузерном и Р.Дэйвисом в 1975.

(Источник: «Англо-русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд-во ВНИРО, 1995 г.)

Смотреть что такое "Саузерн-блоттинг" в других словарях:

Саузерн блоттинг — (от англ. Southern blot) метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определенной последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами… … Википедия

Саузерн-блоттинг — блоттинг по Саузерну Метод обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей путем переноса электрофретически разделенных фрагментов ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный (бумажный) фильтр за счет капиллярного эффекта… … Справочник технического переводчика

саузерн-блоттинг — Southern Blotting Саузерн блоттинг ДНК образец. Саузерн блоттинг включает в себя электрофоретическое разделение ДНК и методы переноса фрагментов ДНК из агарозного геля на мембрану под действием электрического поля для дальнейшего анализа с… … Толковый англо-русский словарь по нанотехнологии. - М.

Саузерн-блоттинг блот-гибридизация по С — Саузерн блоттинг, блот гибридизация по С. * Саўзерн блотынг, блот гібрыдызацыя па С. * Southern blotting or S. hybridization or S. transfer техника гелевого блоттинга (см.), при которой фрагменты ДНК, разделенные по размеру в агарозном гель… … Генетика. Энциклопедический словарь

САУЗЕРН-БЛОТТИНГ — (Southern blot analysis) метод идентификации специфических форм ДНК в клетках. Молекулы ДНК удаляются из клеток и с помощью рестриктирующих ферментов разделяются на небольшие фрагменты. Эти фрагменты отделяются друг от друга, и с помощью генного… … Толковый словарь по медицине

Саузерн-Блоттинг (Southern Blot Analysis) — метод идентификации специфических форм ДНК в клетках. Молекулы ДНК удаляются из клеток и с помощью рестриктирующих ферментов разделяются на небольшие фрагменты. Эти фрагменты отделяются друг от друга, и с помощью генного зонда производится поиск… … Медицинские термины

Саузерн-блот — Саузерн блоттинг Саузерн блоттинг (от англ. Southern blot) метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определенной последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для… … Википедия

Блоттинг — (от англ. Blot) общее название методов молекулярной биологии по переносу определённых белков или нуклеиновых кислот из раствора, содержащего множество других молекул, на какой либо носитель (мембрану из нитроцеллюлозы, PVDF или… … Википедия

Блоттинг блоттинговый перенос — Блоттинг, блоттинговый перенос * блотынг, блотынгавы перанос * blotting or blot transfer процедура переноса электрофоретически разделенной ДНК (см. ), ДНК фрагментов, РНК, РНКфрагментов или белков с геля (агарозного или полиакриламидного) на… … Генетика. Энциклопедический словарь

Саузерн-блоттинг в молекулярной генетике. Особенности

Блоттинг по Саузерну в исследовании ДНК

Блоттинг по Саузерну позволяет исследовать генетические нарушения на уровне ДНК. При выявлении нормального гена его можно использовать в качестве пробы (т. е. ДНК-пробы для сравнительного исследования структуры ДНК у конкретного человека).

Если исследуемая ДНК и ДНК-проба представлены одной нуклеотидной нитью и они комплементарны, то при их соединении должна произойти гибридизация (спаривание) молекул. Если же спаривание не произошло, то исследуемая ДНК не содержит генетической структуры, имеющейся в ДНК-пробе.

Для удобства исследуемая ДНК помещается на какой-либо подходящий материал, обычно нейлоновую мембрану. Такая методика называется блоттингом по Саузерну (Southern blot) в честь исследователя Е.М. Southern. Разработаны также модификации этого метода для исследования РНК (Northern blot) и белков (Western blot).

Блоттинг по Саузерну осуществляется в несколько этапов. Сначала из клеток выделяется ДНК; разумеется, клетки должны иметь ядро (лейкоциты, трофобласты). ДНК обрабатывается рестриктазой до неисчислимого количества небольших частей. Интересующий исследователя ген оказывается «раскидан» во множестве фрагментов, однако его точное местоположение и размер пока что определить невозможно.

ДНК переносится в агарозный гель, на который подается электрический ток. В процессе гель-электрофореза под влиянием электрического тока маленькие фрагменты ДНК двигаются быстрее и дальше, чем большие. Затем гель окрашивают бромистым этидием, который встраивается между парами оснований и позволяет видеть ДНК в ультрафиолетовом свете. Поскольку геномная ДНК человека огромна, на электрофоретической дорожке она выглядит как мазок, хотя в действительности состоит из множества отдельных фрагментов разного размера.

ДНК, содержащаяся в агарозе, на данный момент все еще представляет собой двойную спираль. Если обработать гель щелочью, ДНК денатурирует до одиночных нитей. После этого можно исследовать гель на гибридизацию с однонитевой ДНК-пробой, но в связи с хрупкостью геля ДНК обычно переносят па нейлоновую мембрану (блоттинг по Саузерну).

Гель помещают на платформу в контейнере, наполненном буферным раствором. Нейлоновая мембрана располагается непосредственно над гелем, поверх которой кладут бумажные салфетки. Буфер проходит через гель под воздействием капиллярной силы, вызывая миграцию однонитевой ДНК на нейлоновую мембрану. Затем мембрану обрабатывают в вакуумной печи для постоянного связывания ДНК с нейлоном. Время переноса может быть уменьшено за счет электроблоттинга или обработки вакуумом.

В итоге па нейлоновой подложке образуется пятно (blot), которое содержит набор образцов ДНК — исследуемых и контрольных. Эта ДНК может быть гибридизована с ДНК-пробами. Например, если предполагаемое заболевание — наследственная гиперплазия надпочечников вследствие делеции гена 21-гидроксилазы, исследование проводится с ДНК-пробой, комплементарной гену 21-гидроксилазы.

Перед гибридизацией ДНК-пробу метят каким-либо маркером, обычно радиоизотопом, например 32P, хотя используют не только радиоактивные вещества, а например, биотин-авидин. Если проба представляет собой двунитевую ДНК, ее денатурируют (расщепляют на две нити) кипячением или обработкой щелочью. После того как проба помечена и денатурирована, ее растворяют и помещают в пакет или пробирку с мембраной для гибридизации. После завершения этого этапа несвязавшуюся ДНК-пробу отмывают, чтобы удалить как можно больше неспецифических молекул.

При промывке при высокой температуре и низкой концентрации клеток остаются связанными только комплементарные последовательности. После этого мембрану помещают в пластиковый конверт внутрь кассеты, содержащей фотопленку, при температуре —70 °С. После «проявки» становится видно наличие или отсутствие полосок на пленке. Если в образцах больного и здоровых индивидуумов (контроль) полоски одного и того же размера и в одинаковом количестве, значит, ген в исследуемой ДНК сохранен и не имеет явных нарушений.

Но это не говорит об отсутствии небольших мутаций, как, например, замена одной пары нуклеотидов. Блоттинг по Саузерну не позволяет выявлять столь малые мутации, если только они не затрагивают области расщепления ДНК рестриктазой.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Исследование РНК или ДНК конкретного гена предполагает возможность различить специфические сегменты ДНК или молекулы РНК, соответствующие этому гену, среди множества других сегментов ДНК или молекул РНК, присутствующих в образце клеток или ткани. Когда анализируют геномную ДНК, проблема состоит в том, чтобы обнаружить и изучить специфический интересующий фрагмент ДНК в сложной смеси, содержащей несколько миллионов фрагментов, полученных расщеплением геномной ДНК рестриктазами. С образцами РНК сложность в том, чтобы обнаружить и измерить объем и качество конкретной копии мРНК в суммарной РНК ткани, в которой искомая мРНК составляет менее 1 на 1000 от общего числа копий РНК.

Решение проблемы обнаружения одной редкой последовательности среди множества других связано с использование гель-электрофореза для разделения молекул ДНК или РНК по размеру с последующей гибридизацией с нуклеотидным зондом, идентифицирующим интересующую молекулу.

Техника Саузерн-блоттинга (блоттинга по Саузерну) позволяет обнаружить и изучать на грубом уровне множество интересующих фрагментов в, казалось бы, не информативной коллекции из порядка миллиона фрагментов, полученных после обработки ДНК рестриктазами. Саузерн-блоттинг, разработанный в середине 1970-х годов, стал стандартным методом исследования конкретных фрагментов ДНК, расщепленной ферментами рестрикции. Сначала в ходе этой процедуры из доступного источника выделяют ДНК. Как источник ДНК может быть использована любая клетка организма, за исключением зрелых эритроцитов, не имеющих ядра.

В ходе анализа образцов ДНК пациента обычно используют геномную ДНК лимфоцитов, полученных при обычной пункции вены. В 10 мл периферической крови содержится приблизительно 108 лейкоцитов или около 100 микрограмм ДНК — доза, достаточная для расщепления рестриктазами. Геномная ДНК также может быть получена из других тканей, включая культуру фибробластов кожи, амниотических клеток или ворсин хориона, что используют для пренатальной диагностики, или из биопсийного образца ткани различных органов (например, печени, почки, плаценты).

Пробу с миллионами различных фрагментов ДНК, генерируемых ферментативным расщеплением образца геномной ДНК рестриктазами, наносят на поверхность агарозного геля в точку старта. Затем фрагменты ДНК разделяют по размеру с помощью электрофореза в геле агарозы, при котором мелкие частицы перемещаются в электрическом поле быстрее крупных. Когда разделенную таким образом исследуемую ДНК окрашивают флюоресцентным красителем, например этидиум бромидом, фрагменты ДНК проявляются как флюоресцирующие области, распределенные вдоль полосы движения в геле, меньшие фрагменты — выше, большие — ниже. ДНК появляется в геле как смазанное пятно, а не в виде дискретных полос, поскольку обычно образуется слишком много разноразмерных фрагментов ДНК, чтобы отделить один от другого.

Пятно двухнитевых фрагментов ДНК сначала денатурируют сильной щелочью для разделения нитей ДНК. Полученные однонитевые молекулы ДНК затем переносят с геля на бумажные пористые фильтры (отсюда второе название метода — «перенос по Саузерну»).

Для идентификации одного или нескольких интересующих фрагментов среди миллионов других фильтр инкубируют с комплементарным однонитевым меченым зондом в условиях, способствующих спариванию двойных молекул ДНК. Несвязанные зонды удаляют отмывкой, затем фильтр со связанными радиоактивными зондами выдерживают с фотопленкой, что выявляет положение одного или более фрагментов, к которым присоединился зонд. Таким образом, на пленке можно увидеть специфические радиоактивные полосы для каждого интересующего фрагмента ДНК человека на исходном геле.

Способность Саузерн-блоттинга идентифицировать мутации ограниченная, поскольку зонды могут обнаруживать дефекты, только имеющие ощутимое влияние на размер рестрикционного фрагмента, например крупные делеции или инсерции (вставки). Мутация, изменяющая одно или несколько оснований, не может быть обнаружена, если не создает или не уничтожает сайт узнавания рестриктазы, приводя к значительному изменению размера фрагмента, обнаруживаемого зондом. Тем не менее, кроме Саузерн-блоттинга, существует множество методов для обнаружения мутаций, влияющих на одну или несколько пар оснований в гене.

Саузерн блоттинг

Саузерн блоттинг (от англ. Southern blot ) — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определенной последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделенной по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. Метод называется по имени изобретателя, английского биолога Эдвина Саузерна. [1]

Другие технологии переноса (блота), например, вестерн блоттинг, нозерн блоттинг, саузвестерн блоттинг используют сходные методы, но для определения РНК или белка в образце, и называются по образцу метода, придуманного Саузерном. Так как Саузерн-блот назван по имени ученого, термин пишут с заглавной буквы, в то время как вестерн-блот и нозерн-блот — со строчной буквы.

Содержание

Метод

Рестрикция эндонуклеазами рестрикции для разрезания высокомолекулярной ДНК на более мелкие фрагменты.
Фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине.
В случае, если некоторые фрагменты ДНК длиннее 15 кб, перед переносом гель обрабатывают, например, соляной кислотой, которая вызывает депуринизацию ДНК и облегчает перенос на мембрану.
В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль ДНК денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК.
Листок нитроцеллюлозной (или нейлоновой) мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют непосредственно на гель или через несколько слоев бумаги. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий.
Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в вакууме до температуры 80 °C в течение двух часов или освещается ультрафиолетовым излучением (в случае нейлоновых мембран).
Осуществляют гибридизацию радиоактивно (флюоресцентно) меченной пробы с известной последовательностью ДНК с мембраной.
После гибридизации избыток пробы отмывают с мембраны и визуализируют продукты гибридизации путем авторадиографии (в случае радиоактивной пробы) или оценивают окраску мембраны (в случае использования хромогенного окрашивания).

Результаты

Гибридизация пробы со специфическим участком ДНК, закрепленным на мембране, указывает на наличие анализируемой последовательности нуклеотидов в пробе.

Применение

Саузерн блоттинг, который проводят с геномной ДНК, обработанной эндонуклеазами рестрикции, может быть использован для определения числа копий генов в геноме. Проба, которая гибридизуется только с единственным фрагментом ДНК, который не был разрезан рестриктазами, дает одну полосу на Саузерн-блоте, в то время как множественные полосы на блоте указывают на то, что проба гибридизовалась с несколькими идентичными последовательностями. Изменения условий гибридизации (повышение температуры, при которой проводят гибридизацию, изменение концентрации соли) приводят к повышению специфичности и снижению гибридизации с близкими, но не идентичными последовательностями.

Примечания

↑Southern, E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J Mol Biol.. — 1975.

См. также

Wikimedia Foundation . 2010 .

Полезное

Смотреть что такое "Саузерн блоттинг" в других словарях:

Саузерн-блоттинг — Southern blotting, Southern transfer Саузерн блоттинг, блоттинг по Саузерну. Mетод обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей путем переноса электрофретически разделенных фрагментов ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный… … Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

Саузерн-блот

Смотреть что такое "Саузерн-блот" в других словарях:

Саузерн, Эдвин — Сэр Эдвин Мэллор Саузерн (р. 7 июня 1938) английский молекулярный биолог, член лондонского королевского общества по развитию знаний о природе (также известного как лондонское королевское общество), лауреат премии Ласкера (2005). Премия была … Википедия

Блот — * блот * blot название нитроцеллюлозной или нейлоновой мембраны, на которую перенесены ДНК, РНК или белок, а также фильтра, на котором выполняются Саузерн , нозернили вестерн эксперименты (см. ) … Генетика. Энциклопедический словарь

Блот-гибридизация — * блот гібрыдызацыя * blot hybridization гибридизация рестриктазных фрагментов исследуемой ДНК, предварительно разделенных электрофоретически и перенесенных на нитроцеллюлозный фильтр при помощи фильтровальной бумаги, со специфичным нуклеотидным… … Генетика. Энциклопедический словарь

Нозерн-блот — Общая схема метода Нозерн блот (англ. Northern blot) метод исследования экспрессии генов путём тестирования молекул РНК (мРНК) и их фрагментов в образцах. Метод Нозерн блот … Википедия

Вестерн-блот — Вестерн блоттинг (вестерн блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. На первом этапе использует электрофорез белков в полиакриламидном геле для… … Википедия

Нозерн-блот н-блоттинг РНК-б — Нозерн блот, н. блоттинг, РНК б. * нозерн блот, н. блотынг, РНК б. * Nothern blot or N. blotting or N. transfer or RNA b. метод, сходный с методом Саузерн блоттинга (см.). Используется для элюирования (извлечения) фрагмента РНК из гелей после… … Генетика. Энциклопедический словарь

Читайте также: