Темнопольная микроскопия при сифилисе
Исследование в темном поле - темнопольная микроскопия
Dark-field microscopy
Что такое исследование в темном поле
Исследование в темном поле ( Dark-field microscopy) - темнопольная микроскопия - это микроскопическое исследование различного биоматериала с помощью специального (темнопольного) микроскопа.Применение этого метода исследования связано с тем,что некоторые микроорганизмы плохо окрашиваются или совсем не окрашиваются современными красителями.Кроме того исследование в темном поле позволяет наблюдать микроорганизмы в живом состоянии.
Для чего применяется исследование в темном поле
Темнопольная микроскопия применяется для обнаружения возбудителя сифилиса - бледной трепонемы (T.pallidum) в отделяемом из эрозий,язв и эрозированных папул.Так как бледная трепонема может окрашиваться только специальными и сложными методами окраски (серебрение по Морозову и.т.д.) применение довольно простой и недорогой темнопольной световой микроскопии позволяет значительно ускорить и удешевить обнаружение возбудителя.
Обнаружение бледной трепонемы является неоспоримым доказательством подтверждения диагноза сифилиса.Особо ценен метод при диагностике первичного серонегативного сифилиса (при отрицательных результатах КСР),при диагностике нейросифилиса (обнаружение спирохеты в ликворе) и диагностике реинфекции сифилиса.Показаниями для исследования являются любые эрозии,язвы и эрозированные папулы в области половых органов,ануса,слизистой оболочки рта и губ.
Как проводится исследование в темном поле
При проведении исследования важно получить так называемый тканевой сок,в котором содержаться бледные трепонемы.После обработки поверхности высыпного элемента (эрозии,язвыэрозированной папулы) осторожными движениями затупленного скальпеля добиваются выделения тканевого сока - прозрачно-желтой жидкости,который немедленно забирается для исследования и просматривается в темнопольном микроскопе.
получение
тканевого сока
забор тканевого сока
Полный текст и оригинальные фотографии исследования представлены в STD Slide Gallery Канадского агенства здоровья (Public Health Agency of Canada)
В некоторых случаях материал для исследования с помощью темнопольной микроскопии берется из периферических лимфатических узлов с помощью пункции (прокола с отсасыванием).
Какие результаты исследования в темном поле
Диагноз сифилиса потверждается при обнаружении подвижных бледных трепонем с поступательными,качательными,маятникообразными и ротаторным движениями.Обращается внимание на количество равномерных завитков,которых у бледной трепонемы насчитывают от 8 до 14.Все эти особенности необходимы,чтобы отличить бледную трепонему от других,так называемых сапрофитирующих (непатогенных) спирохет - S.buccalis,S.refringens,S.balantidis,S.pseudopallida,которые могут находится в материале,
особенно если он взят из полости рта.
ИМЕЮТСЯ ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ.ПРОКОНСУЛЬТИРУЙТЕСЬ С ВРАЧОМ. Возбудителем сифилиса - хронической инфекции со специфическим поражением кожи, внутренних органов и нервной системы, является бледная трепонема (Treponema palladium). Методы лабораторной диагностики этой инфекции зависят от ее стадии. Материалом для микроскопического исследования при сифилисе являются отделяемое твердого шанкра, пунктат лимфатических узлов, отделяемое слизистых оболочек и кожи при вторичном сифилисе, а также сыворотка крови и спинномозговая жидкость для серологической диагностики. Методы микробиологической диагностики сифилиса представлены в схеме 17. Микроскопический метод(темнопольная микроскопия с высокой разрешающей способностью) обычно применяется при первичном сифилисе при исследовании отделяемого твердого шанкра. Бледная трепонема имеет 8-12 равномерных мелких завитков правильной формы, обладает характерным плавным штопорообразным вращательно-поступательным, маятникообразным, сгибательным и контрактильным движением. На половых органах встречаются непатогенные Treponema refringens и Treponema balantidis, а в полости рта Treponema microdentium и Treponema buccalis, которые необходимо дифференцировать по морфологическим свойствам от бледной трепонемы. В силу этих обстоятельств темнопольной микроскопия желательно подвергнуть пунктат регионарных лимфатических узлов. Применяется также дифференциация Treponema palladium от непатогенных трепонем методом люминесцентной микроскопии с моноклональными или поликлональными антителами, который является одновременно экспресс-методом диагностики сифилиса (рис. 24). Схема 17.Методы микробиологической диагностики сифилиса Рис. 24. Бледная спирохета (Treponema palladum). Прямая РИФ. х900 Методы окраски бледной спирохеты (по Романовскому-Гимзе, при котором она окрашивается в бледно-розовый цвет, импрегнацией серебром по Морозову), а также метод Бурри (изготовление негативных препаратов в капле туши) с последующим исследованием препаратов в обычном световом микроскопе имеют низкую воспроизводимость и существенно уступают темнопольной микроскопии по степени разрешающей способности, поэтому в реальной практике эти методы не применяются. Бактериологический метод диагностики сифилиса не применяется в связи с трудностью культивирования бледных трепонем и отсутствием эффективных питательных сред. Серологический метод. Рекомендуется использование следующих методов серодиагностики сифилиса, направленных на обнаружение в крови больных специфических антител к бледной трепонеме: · Для проведения отборочных исследований на сифилис ставят неспецифический тест - микрореакцию преципитации (МР). В лунку полистироловой пластины вносят 3 капли исследуемой сыворотки и 1 каплю кардиолипинового антигена, смесь встряхивают и учитывают результаты. Положительная реакция характеризуется выпадением хлопьев. МР обладает высокой чувствительностью и специфичностью, хорошо сочетается с подтверждающими диагноз специфическими трепонемными тестами, позволяет объективно оценить эффективность лечения, однако необходимо ее подтверждение одним из специфических тестов (ИФА, РНГА, РИФ, РИБТ, РСК). · ИФА применяется как для отборочных целей, так и для диагностики сифилиса. Разработаны тест-системы для определения антител к бледной спирохете классов G и M, что имеет важное значение для диагностики ранних форм сифилиса (в том числе врожденного), дифференциальной диагностики рецидивов, реинфекции, оценки эффективности лечения и т.д. · РНГА также используется для целей отбора и диагностики. Обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, чем другие серологические реакции при сифилисе, отличается простотой в постановке. · РИФ сопоставима по своим результатам с ИФА и РНГА. Сыворотку больного адсорбируют взвесью непатогенных трепонем или разводят 1:200, наносят на предметное стекло, содержащее фиксированные ацетоном бледные трепонемы из тестикул зараженного кролика, после чего на препарат наносят люминесцирующий иммуноглобулин кролика против глобулинов человека. Мазки исследуют с помощью люминесцентного микроскопа, отмечая при положительном результате наличие ярко-зеленого свечения трепонем. · РИБТ. Сущность реакции заключается в способности антител к бледной трепонеме иммобилизировать (обездвиживать) их в присутствии комплемента. Подсчитывают процент иммобилизации, при этом при показателе 0-20% реакция считается отрицательной, от 21 до 50% - слабо положительной, от 51 до 100% - положительной. · РСК ставится по общепринятой методике с неспецифическим кардиолипиновым (экстракт липидных фракций из бычьего сердца – реакция Вассермана) и специфическим (из разрушенных ультразвуком трепонем) антигенами. Положительная реакция характеризуется задержкой гемолиза. · Иммуноблотинг – вариант ИФА для определения антител в крови больного к антигенам бледной спирохеты. В настоящее время ставится вопрос о повсеместном введении более информативных, простых и экономичных ИФА и РНГА для диагностики сифилиса с одновременной отменой РСК и РИБТ. Генодиагностика.Разработана ПЦР и метод ДНК-зондов для диагностики сифилиса. Микроорганизмы – спирохеты – в организме больного человека находятся в межтканевом пространстве, между соединительнотканными волокнами, окружают русла лимфатических и кровеносных сосудов. Чтобы точно определить наличие возбудителя сифилиса, необходимо забрать материал для исследования именно оттуда. Конечно, забирать материал имеет смысл только элементов сыпи (в особенности с эрозий и язвочек), с поверхности шанкров и со слизистых оболочек гениталий, ротовой полости и прямой кишки. Кроме того, существуют и альтернативные способы, например, пункция лимфатических узлов. Чтобы мазок на сифилис получился удачным, перед взятием диагностического материала с поверхности язвы или эрозии нужно убрать все лишние загрязнения с помощью марлевого тампона, пропитанного физиологическим раствором. После подсушивания поверхности элемента на его поверхность начинает просачиваться жидкость, в большом количестве содержащая возбудителя болезни. Ускорить процесс можно с помощью мягкого надавливания на элемент (разумеется, в резиновых перчатках). После этого с помощью предметного стекла изготовляется мазок на сифилис, который после обработки микроскопируется. Чтобы получить материал из неподверженных эрозии высыпаний, используется метод поскабливания их скальпелем или стерильной бритвой.
Импрегнацию трепонем серебром (серебрение по Морозову) проводят следующим образом: мазок высушивают, заливают первым реактивом на одну минуту, после чего предметное стекло промывают водой. Затем наступает очередь второго реактива – стекло при этом нагревают на 1 минуту в пламени спиртовки (умеренно). После промывания стекло вновь нагревают до окраски мазка в коричневый цвет. Затем снова следует тщательное отмывание, сушка и исследование в иммерсионной среде. Бледные трепонемы после серебрения по Морозову выглядят черными или темно-коричневыми неподвижными микробными телами. Все морфологические свойства их сохраняются в достаточной степени для достоверной идентификации. Возбудителем сифилиса является бледная трепонема. Она была открыта в 1905 году – выделена из элементов сыпи и лимфоузлов больных сифилисом.
Морфология возбудителя сифилисаБледная спирохета не имеет ядерной мембраны. ДНК не делится на хромосомы. Размножается эта бактерия путем поперечного деления. На более поздних стадиях инфекционного заболевания появляются: Они более устойчивы к антибиотикам, иммуноглобулинам, температурным воздействиям. Толщина тела бактерии – около 1 мкм. Длина может достигать 20 микронов. Характерное число завитков для возбудителей сифилиса – от 8 до 12. Они равномерные, узкие и крутые. По направлению от концов тела бактерии к её середине высота завитков возрастает, а расстояние между ними уменьшается. Указанное количество завитков является средним. Встречаются отдельные бактерии с очень длинным телом – до 20 завитков. Попадаются и очень короткие спирохеты, состоящие из 1-2 завитков. Для бактерии характерна упругость – она сохраняет форму в любых условиях. Движения её медленные. Это позволяет отличать бледную спирохету в микроскоп от других бактерий данного рода. Движений этот микроорганизм может осуществлять всего четыре:
В наиболее заразной своей форме трепонема меняет структуру клеточной стенки. В ней нет мембраны. Такая бактерия легко проникает через эндотелий сосудов. Характеристика возбудителя сифилисаБледная спирохета размножается делением. Происходит это очень медленно. На одно деление затрачивается больше суток. В то же время трепонема устойчива к замораживанию. Температура до минус 7 градусов вообще не влияет на жизнедеятельность бактерии. При минус 18 градусах она сохраняет патогенность в течение 1 года. В тканях трупа бледная спирохета может жить до 3 дней. Бактерия быстро погибает при:
Они гибнут в организме под влиянием пенициллинов. Причем, не имеют от них защиты. Но погибают медленно, что связано с медленно протекающими метаболическими процессами. В консервированной крови бледная трепонема гибнет через 5 дней. Эти данные учитываются при переливании донорской крови. Пути передачи сифилисаСифилис – возбудитель инфекции с преимущественно половым путем передачи. Он также может распространяться другими путями: Источником заражения может быть только человек. Он наиболее заразен в раннем периоде заболевания. Это первые 2 года болезни. Те, кто болеет свыше 5 лет, малоконтагиозны. Условия инфицирования:
Обычно эти условия соблюдаются. Ведь для инфицирования человека достаточно лишь нескольких бактерий. А микроповреждения на коже и слизистых присутствуют почти всегда. Неполовые механизмы заражения:
От матери к ребенку инфекция может передаваться и через плаценту. То есть, малыш заражается не во время родов, а ещё до их начала. Бытовое заражение возможно при тесном телесном контакте. Так родители заражают детей. Инфицирование также возможно:
Бледные трепонемы содержатся в:
Возбудитель сифилиса не передается или риск заражения минимальный, если:
Вероятность инфицирования повышается, если на теле человека присутствуют любые эрозии. Риск передачи заболевания увеличивает герпес, неспецифический баланопостит, эрозии шейки матки, порезы и ранения. Другие факторы, увеличивающие риск инфицирования:
Социальными факторами риска заражения являются наркомания, проституция, молодой возраст, большое количество партнеров, алкоголизм, низкий социальный уровень. Антитела к возбудителю сифилисаСерологическая диагностика заболевания включает трепонемные и нетрепонемные тесты. Нетрепонемные выявляют антитела к антигенам, образующимся в результате разрушения клеток. Трепонемные направленные на обнаружение антител к антигенам возбудителя сифилиса. Определение антител к бледной трепонеме – основной способ диагностики этого заболевания. Он имеет такие преимущества:
Недостатком является невозможность применения этих исследований для контроля излеченности. Потому что титр антитрепонемных антител может не снижаться очень долго даже после успешной терапии. Особенно, если лечение было проведено по поводу позднего сифилиса. Тесты бывают качественными или количественными. В западной медицине количественные тесты не применяются. Потому что они дороже обходятся и не имеют практического смысла. Изменение титра ни о чем не говорит – ни об успешности лечения, ни о его неудачах. В медицине стран СНГ количественные трепонемные тесты иногда используются. Обычно же диагностика проводится качественная, а результаты выдаются такие:
РПГА считается положительной при титре больше 1:80. Если он меньше, это отрицательный тест. ИФА дает показатель оптической плотности, но по его динамике нельзя сделать никаких выводов. Краткая характеристика некоторых используемых анализов на антитела к возбудителю сифилиса: Часто используется как подтверждающий тест. Чувствительность в первичном периоде может составлять 80-90%. Но во вторичном и третичном она возрастает до 95-100%. Простой метод, занимающий минимум времени. Идеально подходит для скрининга (массового обследования). Становится положительным уже через 3 недели после заражения. При первичном сифилисе чувствительность РПГА около 75%, дальше возрастает до 100%. Даже при скрытых формах чувствительность достигает 95%. Но РПГА остается положительной долгие годы после излечения заболевания, а иногда и всю жизнь. Поэтому результаты терапии с её помощью оценить невозможно. Дорого стоит, хотя и простой в исполнении тест. Определяются суммарные антитела к возбудителю сифилиса, сразу к нескольким антигенам. В рутинной диагностике заболевания тест не применяется. Он помогает в разрешении спорных ситуаций, когда одни результаты исследований противоречат другим. Темнопольная микроскопия при сифилисеВыявление бледной трепонемы – это абсолютный критерий подтверждения диагноза. Образцы для исследования:
Нежелательно брать для исследования материал из прямой кишки или рта. Там живет много сапрофитных спирохет. Они выглядят точно так же, как возбудитель сифилиса. Материал не окрашивают. Используется темнопольная микроскопия. Обычный конденсор микроскопа заменяют таким, где центральная часть затемнена. Лучи света проникают лишь через узкую щель. В результате бокового освещения световые лучи отражаются от твердых частиц. Поэтому наблюдается их свечение. Для исследования в темном поле требуется мощный источник света. В микроскоп доктор видит:
Также врач может видеть в темном поле: При большом количестве эритроцитов обнаружить возбудителя сифилиса становится сложнее. Бактерии могут прятаться за ними. К тому же, поле становится слишком светлым. Тогда желательно провести исследование повторно, используя другой материал. Однократное микроскопическое исследование не всегда может выявить возбудителя. Даже если врач провел бактериоскопию несколько раз, и не обнаружил спирохету, это не исключает диагноз. При сохраняющихся симптомах должны проводиться дополнительно серологические тесты. ПЦР с поверхности высыпаний при сифилисеПЦР – ещё один метод прямого обнаружения возбудителя сифилиса. Материал используется тот же. Допускается также определение ДНК бледной трепонемы в крови. Данная методика обладает более высокой чувствительностью, чем микроскопия. В процессе исследования используется положительный и отрицательный контроль. ДНК при помощи того же теста выявляется в суспензии, полученной из яичек инфицированного и неинфицированного кролика. ПЦР позволяет выявить возбудителя сифилиса даже при минимальной концентрации бактерий в материале.
|