Динамические мутации. Оценка частоты мутаций

Добавил пользователь Евгений Кузнецов
Обновлено: 14.12.2024

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, 660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1, Российская Федерация

Красноярское краевое патологоанатомическое бюро, Красноярск, 660022, Российская Федерация

ГОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого

Определение мутации BRAF V600E у пациентов с меланомой кожи: клинико-морфологические особенности

Журнал: Архив патологии. 2014;76(5): 38‑43

Аксененко М.Б., Бекузаров С.С., Рукша Т.Г. Определение мутации BRAF V600E у пациентов с меланомой кожи: клинико-морфологические особенности. Архив патологии. 2014;76(5):38‑43.
Aksenenko MB, Bekuzarov SS, Ruksha TG. BRAF V600E mutation detection in melanoma patients: Clinical and morphological features. Arkhiv Patologii. 2014;76(5):38‑43. (In Russ.).

Цель исследования - оценить частоту мутации BRAF V600E у пациентов с меланомой кожи и ассоциацию данного вида мутации с клинико-морфологическими характеристиками заболевания. Материал и методы. Проведен анализ мутации у 71 пациента с меланомой кожи, находившегося на лечении в КГБУЗ "Красноярский краевой онкологический диспансер". Анализ мутации BRAF V600E осуществляли методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени. Перед выделением ДНК стекла с материалом, полученным от пациентов, окрашенные гематоксилином и эозином, оценивали на предмет содержания опухолевых клеток в срезе. В дальнейшем проводились выделение геномной ДНК с помощью набора FFPET DNA-Extraction Kit ("Биолинк", Россия) и постановку реакции ПЦР в реальном времени. Результаты. У 40,84% больных наблюдалась мутация V600E гена BRAF, в 59,16% случаев данный вид мутации не определялся. Выявлены особенности локализации и гистотипа опухоли в зависимости от BRAF-статуса. Заключение. Определение наличия или отсутствия мутации V600E в гене BRAF у пациентов с меланомой кожи является важным звеном в оценке биологического поведения опухолевых клеток и реализации ими таких биологически значимых функций, как опухолевая инвазия, метастазирование, неоангиогенез, что имеет значение для дальнейшей оценки опухолевой прогрессии и последующего прогноза течения заболевания.

Меланома кожи является новообразованием, развивающимся в результате злокачественной трансформации меланоцитов и меланобластов [1, 2]. Исследования последних лет в области эпидемиологии меланомы кожи установили четкий рост заболеваемости меланомой в разных странах мира, в том числе и в России [3], что делает чрезвычайно актуальной проблему повышения эффективности ее лечения. Молекулярно-биологические исследования клеток меланомы определили, что при меланоме кожи наблюдается более 40 различных точковых мутаций в ключевом онкогене BRAF [4]. В 40-60% случаев меланома кожи ассоциирована с мутациями онкогена BRAF (локализация в геноме клетки 7q34), следствием которых является конститутивная активация серинтреониновой киназы BRAF и соответственно митогенного сигнала по пути MAPK/ERK [5]. Около 90% таких мутаций приводит к замене глутамата на валин в кодоне 600 (BRAF V600E); известны и другие активирующие BRAF-мутации (например, BRAF V600K, BRAF V600R) [6]. Одним из наиболее значимых достижений молекулярной медицины последних десятилетий явилось определение у пациентов с меланомой кожи молекулярно-генетических подтипов и выявление разных механизмов развития меланомы кожи, что позволило избирательно подходить к лечению пациентов с таким заболеванием. Вместе с тем это привело к появлению новых нерешенных проблем. Во-первых, отсутствует терапия BRAF-негативной меланомы кожи. Во-вторых, несмотря на хорошие результаты проводимой таргетной терапии у пациентов с BRAF-позитивной меланомой, спустя 2-18 мес после применения BRAF-ингибиторов, развивается резистентность к данному виду лечения с быстрым дальнейшим прогрессированием заболевания. Вместе с тем продукт гена BRAF является наиболее доказанной молекулярной мишенью при лечении меланомы кожи, и таким образом является оправданным дальнейшее разъяснение механизмов развития меланомы кожи, формирования особенностей инвазивного роста, метастазирования в зависимости от присутствия или отсутствия мутации вышеуказанного гена.

Цель - оценить частоту мутации BRAF V600E у пациентов с меланомой кожи и ассоциацию с клинико-морфологическими характеристиками заболевания.

Материал и методы

Анализ данных историй болезней пациентов с меланомой кожи осуществлялся на базе КГБУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер». Биоптаты больных с меланомой кожи (n=71) получены в КГБУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро». Перед выделением ДНК стекла с материалом, окрашенные гематоксилином и эозином, оценивали на предмет содержания опухолевых клеток в срезе. В дальнейшем проводили выделение геномной ДНК с помощью набора FFPET DNA-Extraction Kit («Биолинк», Россия). Анализ мутации BRAF V600E осуществляли методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени. На первом этапе осуществлялась нормализация концентрации ДНК к концентрации ДНК в отрицательном стандарте: оптимальной является концентрация ДНК в образце, при которой Ct неизвестных образцов в контрольной реакции отличалась от Ct ДНК контроля не более чем на 2 цикла.

Контрольная реакция проводится для оценки пригодности образцов ДНК для дальнейшего анализа. Определение концентрации ДНК по оптической плотности при длине волны 260 нм не позволяет выбрать концентрацию, оптимальную для BRAF-теста. Причинами могут быть частичная деградация или химические модификации ДНК, возникшие при фиксации ткани, которые могут ингибировать или снижать эффективность ПЦР. Качество и количество ДНК оценивается по величине Ct, которая соответствует количеству циклов ПЦР, при которых кривая флюоресценции пересекает заданный уровень фона. Различные разведения образцов ДНК сравниваются в контрольной ПЦР с ДНК отрицательного стандарта. Для дальнейшей аллель-специфичной ПЦР выбирают разведение образца ДНК, которое имеет наиболее близкую величину Ct относительно отрицательного ДНК-стандарта.

На этом этапе выбранные разведения ДНК тестируют в аллель-специфичной ПЦР. Для этого используют праймеры, специфичные к мутации V600E в гене BRAF. ДНК BRAF дикого типа (без мутации) амплифицируется в тех же условиях с увеличением Ct на 5 циклов, что позволяет отличать ее от мутантной. Для нормировки результатов все образцы тестируют в реакции с контрольной смесью, также в каждый эксперимент включают ПЦР с положительным стандартом и контролем без матрицы.

Для всех образцов ДНК результаты ПЦР для мутации BRAF представляют в виде: dCt = Ct AS - Ct C , где Ct AS - среднее Ct образца ДНК в ПЦР-специфичной к мутации BRAF, Ct C - среднее Ct того же образца ДНК в контрольной ПЦР. Затем dCt образца сравнивают с dCt-положительного стандарта, содержащего 1% ДНК с мутацией. Образец является положительным (содержащим мутацию), если dCt образца равно или меньше dCt-положительного стандарта. Образец является отрицательным (без мутации или содержание мутации менее 1%), если dCt образца больше dCt-положительного стандарта.

Проверку нормальности распределения выборки проводили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий определяли с помощью критерия Манна-Уитни. Для оценки качественных признаков применяли точный односторонний критерий Фишера. При р

Результаты и обсуждение

Анализ частоты встречаемости мутации V600E гена BRAF у больных с меланомой кожи выявил наличие данной мутации у 40,84% пациентов, в 59,16% случаев данный вид мутации не определялся (рис. 1, а, б). Рисунок 1. Детекция мутации V600E гена BRAF методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени. а - контрольная ПЦР. Рисунок 1. Детекция мутации V600E гена BRAF методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени. б - ПЦР BRAF V600E; ДНК с мутацией (красная линия); ДНК без мутации (синяя линия). Не было выявлено значимых различий между полом пациентов в зависимости от BRAF-статуса (p>0,05) (табл. 1). В литературе имеются данные о том, что мутация гена BRAF чаще встречается у женщин [7]. В свою очередь в исследованиях J. Ellerhorst и соавт. [8] также не было выявлено различий по полу и возрасту между пациентами с меланомой кожи в зависимости от их мутационного статуса по BRAF. Средний возраст всей выборки больных составил 58,97±14,15 года. Минимальный возраст пациентов с BRAF-положительным статусом составил 34 года, а максимальный возраст - 77 лет. У пациентов с отрицательным статусом он составил 26 и 88 лет соответственно. Средний возраст манифестации меланомы кожи у пациентов, имеющих мутацию, был меньше, чем у пациентов, которые не имели данной мутации (см. табл. 1). При этом в исследовании, проводимом W. Liu и соавт. [9], было выявлено, что мутация гена BRAF V600E чаще встречается у пациентов в возрасте моложе 50 лет по сравнению с пациентами старше 50 лет, несмотря на то что возраст пациентов с наличием мутации в данном исследовании был меньше, подобной тенденции не наблюдалось. Таким образом, можно отметить, что наблюдается тенденция к наличию BRAF-позитивных меланом кожи у лиц более молодого возраста (табл. 2). Преимущественной локализацией у BRAF-позитивных пациентов была кожа туловища 44,8%, у пациентов с отрицательным BRAF-статусом данная локализация также являлась преимущественной и составляла 40,4%. Известно, что анатомическая локализация меланомы кожи является одним из прогностических факторов. В частности, установлено, что опухоли, расположенные на туловище, а также в области головы и шеи, имеют более неблагоприятный прогноз по сравнению с опухолями, расположенными на конечностях. Опухоли нижней части туловища отличаются лучшим прогнозом, чем верхней [10].

В настоящем исследовании выявлено значимое увеличение количества пациентов, имеющих отрицательный BRAF-статус, с локализацией опухоли на верхних конечностях, включая пальцы кисти. Толщина первичной опухоли по Бреслоу в данной выборке варьировала от 0,1 до 8,5 мм, в большинстве случаев она находилась в диапазоне 2,01-4,0 мм. При этом преобладали пациенты, не имеющие изучаемой мутации. Почти в половине случаев (43,6%) уровень инвазии по Кларку был равен 3 и присутствовало изъязвление опухоли (54,9%), при этом не было выявлено различий между изучаемыми группами по данному признаку (p=0,16). Наиболее часто встречались поверхностно-распространяющаяся меланома (ПРМ) - 54,9% (рис. 2) Рисунок 2. Поверхностно-распространяющаяся меланома. Цитологическая характеристика: клеточная атипия, ядерная атипия, гиперхромия ядер. Здесь и на рис. 3-5: окраска гематоксилином и эозином. ×400. и узловая меланома (УМ) - 28,1%. Гистологический подтип меланомы кожи является одним из прогностических признаков, но, как правило, не рассматривается как самостоятельный признак. Известно, что наилучшим прогнозом обладают меланомы, представленные веретенообразными клетками. При оценке гистологического подтипа исследуемых опухолей преимущественным был смешанно-клеточный вариант (55,7%). При этом выявлено, что эпителиоидно-клеточный вариант меланомы значительно преобладал у людей, не имеющих данную мутацию (p<0,05). Не было установлено различий по содержанию пигмента в зависимости от BRAF-статуса (p>0,05). У 71 пациента, включенного в исследование, преобладали следующие стадии по классификации AJCC: IIb (28,5%) и IIa (22,8%). При оценке TILs-статуса (tumor infiltrating lymphocytes status) большую часть составили пациенты с TILs-статусом по типу Brisk (рис. 3) Рисунок 3. Лимфоцитарный инфильтрат по типу Brisk. Лимфоциты проникают между опухолевыми клетками. , при этом не было выявлено статистически значимых различий среди пациентов, имеющих лимфоцитарный инфильтрат по типу Non Brisk (рис. 4) Рисунок 4. Лимфоцитарный инфильтрат по типу Non Brisk. Лимфоциты образуют фокальные очаги вблизи опухоли, между клетками не проникая (на фото представлен фокальный очаг). и Absent (рис. 5). Рисунок 5. Лимфоцитарный инфильтрат по типу Absent. Лимфоциты отсутствуют в опухолевом узле. Известно, что отсутствие TILs в опухолях толщиной 3,65 мм и больше по Бреслоу служит отрицательным прогностическим признаком выживаемости больных и положительным в отношении вероятности возникновения висцеральных и кожных метастазов [11]. В исследовании данная категория пациентов составила 12,6%.

Таким образом, резюмируя данную работу, можно отметить, что BRAF-позитивные пациенты в исследуемой выборке характеризуются преимущественным расположением меланомы в области участков тела, не подверженных воздействию ультрафиолетового излучения, и тенденцией к развитию в более молодом возрасте.

Заключение

Одной из приоритетных задач изучения механизмов развития различных онкологических патологий является выявление спектра мутаций и различных вариантов регуляции экспрессии генов как в норме, так и при развитии злокачественных новообразований. В связи с этим определение наличия или отсутствия мутации V600E в гене BRAF у пациентов с меланомой кожи является важным звеном в оценке биологического поведения опухолевых клеток и реализации ими таких биологически значимых функций, как опухолевая инвазия, метастазирование, неоангиогенез, что имеет значение для дальнейшей оценки опухолевой прогрессии и последующего прогноза течения заболевания.

Исследование выполнено в рамках гранта Фонда Президента РФ для молодых ученых (Т.Г.Р., MД 901.2013.7).

Частота мутаций

Мутации всегда происходят естественно, случайно и без очевидной причины. Мы не можем заранее предсказать, какая именно мутация произойдет и где, поэтому при их изучении применяют статистические методы. Частотой мутаций называется число вероятных мутаций, каким клетка может подвергнуться за весь срок своей жизни. Частота спонтанных мутаций повышается при воздействии на организм радиоактивных и некоторых химических веществ, называемых мутагенами. Поскольку мутации в соматических клетках приводят к раку, то мутагены являются одновременно и потенциальными канцерогенами.

Определить частоту мутаций некоторых клеток, таких как бактерии и другие микроорганизмы, довольно легко. Она колеблется в пределах от 10 -6 до 10 -8 Это значит, что отдельный ген может мутировать в только в одной клетке на миллион или на сто миллионов клеток одного поколения. Измерять частоту мутаций в сложных диплоидных организмах труднее. Во-первых, изменения фенотипа могут соответствовать мутациям в ряде генов, особенно если это сложный организм. Во-вторых, сложные организмы, вроде человеческого, подвергаются изменениям на протяжении своего развития, и ненормальный фенотип может появиться в результате ненормального развития, а не мутации. Например, к отсутствию конечностей у ребенка могут привести не только мутации, но и некоторые лекарственные препараты, принимаемые во время беременности. В-третьих, если организм гомозиготен по аллелю дикого типа, то для проявления гомозиготного рецессивного фенотипа потребуются две идентичные мутации.

Один из самых простых способов изучения мутации — наблюдение за превращениями доминантного аллеля в рецессивный при скрещивании растений или животных с генотипом АА и аа. Все последующее поколение будет гетерозиготным с доминантным фенотипом; если же наблюдается рецессивный фенотип, то это следствие мутации в половых клетках родителя АА. Проблема заключается в том, что мутации происходят довольно редко, и для их изучения потребовалось бы исследовать неимоверное количество животных, таких как лабораторные мыши, не говоря уже о людях, для которых этот способ становится практически невозможным. Генетик Льюис Дж. Стэдлер изучал мутации кукурузы на примере нескольких генов, определяющих фенотип зерна, так что о мутациях можно было быстро догадаться, посмотрев на зерна в початке. Исследовав несколько миллионов зерен, он обнаружил, что большинство спонтанных мутаций происходит с крайне редкой частотой: приблизительно один случай на 10 -6 гамет. Несколько отдельных генных локусов обладали частотой мутации, равной 10 -4 , что больше обычного показателя для бактерий.

Уильям Рассел и его коллеги изучали мутации мышей в одной из самых больших лабораторий по исследованию мышей, расположенной в городе Ок-Ридж (штат Теннесси). Как и Стэдлер, они искали редкие рецессивные черты среди особей, полученных от скрещивания гомозигот АА ВВ СС DD РР SS SeSe х aa bb cc dd pp ss sese (буквами обозначены гены, затрагивающие фенотип мышей). Из 288 616 мышей было отобрано только 17 с мутациями по всем локусам, что составляет приблизительно 0,006%. Предположительная частота мутации по локусу колеблется от 1 х 10 -7 до 3 х 10 -7 на одну гамету, что опять-таки сравнимо с частотой мутаций бактерий.

Мутации

Мутантные организмы (мутанты) — это организмы, содержащие в своем геноме одну или несколько мутаций. Мутантные организмы могут отличаться от исходных (организмов дикого типа) по самым различным свойствам — морфологическим, физиологическим, биохимическим и другим. Например, у микроорганизмов мутации сопровождаются изменением формы колоний, питательных потребностей, отношения к лекарственным веществам и т. д. У высших растений мутации сопровождаются изменениями качественных и количественных признаков (рис. 115). У насекомых мутанты отличаются от исходных организмов по форме и окраске тела, крыльев, конечностей, глаз, реакции на свет, серологическим свойствам и т. д. (рис. 116). У млекопитающих мутации также ведут к изменению многих качественных и количественных признаков (рис. 117). У человека мутации приводят к различным отклонениям от нормы и сопровождаются наследственной патологией (см. гл. XIII). В целом можно сказать, что мутации являются вредными, полезными или нейтральными для организмов. Но важно помнить, что мутанты остаются организмом того же вида, что и организм дикого типа, из которого они произошли.

Мутации следует отличать от фенокопий, которые продуцируются факторами среды. Мимикрируя действие генов, они не передаются по наследству. Например, если беременных мышей экспонировать к пониженному атмосферному давлению, то некоторые из особей в пометах таких мышей будут иметь повреждения в мочеполовом тракте, не передающиеся, однако, по наследству. В случае человека фенокопиями можно считать, например, ненаследуемые повреждения скелета и слепоту, вызываемые ядами и другими вредными факторами воздействия.

Мутации возникают на всех стадиях индивидуального развития организмов и поражают гены и хромосомы как в половых клетках, причем до оплодотворения и после оплодотворения (после первого деления оплодотворенных яйцеклеток), так и в соматических, причем в любой фазе клеточного цикла. Поэтому по типу клеток, в которых возникают мутации, различают генеративные и соматические мутации (соответственно).

Генеративные мутации происходят в генитальных и половых клетках.

Если мутация (генеративная) происходит в генитальных клетках, то мутантный ген могут получить сразу несколько гамет, что увеличит потенциальную способность наследования этой мутации несколькими особями (индивидуумами) в потомстве. Если мутация произошла в гамете, то, вероятно, лишь одна особь (индивид) в потомстве получит этот ген. На частоту мутаций в половых клетках оказывает влияние возраст организма.

Соматические мутации встречаются в соматических клетках организмов. У животных и человека мутационные изменения будут сохраняться только в этих клетках. Но у растений из-за их способности к вегетативному размножению мутация может выйти за пределы соматических тканей. Например, знаменитый зимний сорт яблок «Делишес» берет начало от мутации в соматической клетке, которая в результате деления привела к образованию ветви, имевшей характеристики мутантного типа. Затем следовало вегетативное размножение, позволившее получить растения со свойствами этого сорта.

По типу наследования различают доминантные, полудоминантные, кодоминантные и рецессивные мутации. Доминантные мутации характеризуются непосредственным эффектом на организм, полудоминантные мутации заключаются в том, что гетерозиготная форма по фенотипу является промежуточной между формами АА и аа, а для кодоминантных мутаций характерно то, что у гетерозигот A₁A₂ проявляются признаки обоих аллелей. Рецессивные мутации не проявляются у гетерозигот.

Если доминантная мутация встречается в гаметах, ее эффекты выражаются непосредственно в потомстве. Многие мутации у человека являются доминантными. Они часты у животных и растений. Например, генеративная доминантная мутация дала начало анконской породе коротконогих овец.

Примером полудоминантной мутации может служить мутационное образование гетерозиготной формы Аа, промежуточной по фенотипу между организмами АА и аа. Это имеет место в случае биохимических признаков, когда вклад в признак обоих аллелей одинаков.

Примером кодоминантной мутации являются аллели I A и I B , детерминирующие группу крови IV.

В случае рецессивных мутаций их эффекты скрыты в диплоидах. Они проявляются лишь в гомозиготном состоянии. Примером являются рецессивные мутации, детерминирующие генные болезни человека.

Таким образом, главными факторами в детерминировании вероятности проявления мутантного аллеля в организме и популяции являются не только стадия репродуктивного цикла, но и до-минантность мутантного аллеля.

В зависимости от локализации в клетках различают генные (точечные) и хромосомные мутации (рис. 118).

Генные мутации заключаются в изменениях индивидуальных генов. Поэтому их еще называют точечными мутациями и классифицируют на односайтовые и многосайтовые. Односайтовая мутация затрагивает один сайт, многосайтовая — несколько сайтов генного локуса. Некоторые сайты являются «горячими точками», т. к. в них происходят концентрированные мутации, что связано с наличием в нуклеотидных последовательностях модифицированных оснований. Последние подвергаются частому дезаминированию, а это ведет к изменениям в последовательностях оснований.

Генные мутации классифицируют также на прямые и обратные (реверсивные) мутации, которые одинаково встречаются у организмов всех систематических групп.

Прямые мутации — это мутации, инактивирующие гены дикого типа, т. е. мутации, которые изменяют информацию, закодированную в ДНК, прямым образом, в результате чего изменение от организма исходного (дикого) типа идет прямым образом к организму мутантного типа.

Обратные мутации представляют собой реверсии к исходным (диким) типам от мутантных. Эти реверсии бывают двух типов. Одни из реверсий обусловлены повторными мутациями аналогичного сайта или локуса с восстановлением исходного фенотипа и их называют истинными обратными мутациями. Другие реверсии представляют собой мутации в каком-то другом гене, которые изменяют выражение мутантного гена в сторону исходного типа, т. е. повреждение в мутантном гене сохраняется, но он как бы восстанавливает свою функцию, в результате чего восстанавливается фенотип. Такое восстановление (полное или частичное) фенотипа вопреки сохранению первоночального генетического повреждения (мутации) получило название супрессии, а такие обратные мутации назвали супрессор-ными (внегенными). Как правило, супрессии происходят в результате мутаций генов, кодирующих синтез тРНК и рибосом.

Большинство генов довольно устойчива по отношению к мутациям, однако известны гены, которые мутируют очень часто. Как правило, мутантный фенотип организмов является одинаковым, независимо от того, наследуется ли генная мутация от отца или матери. Тем не менее небольшое число генов у человека и мышей экспрессируется дифференциально, причем в зависимости от источника наследования мутантного гена (от отца или матери). Во всех случаях один из родительских аллелей полностью инактиви-руется, тогда как другой аллель является активным. Напоминая инактивацию Х-хромосом, это явление получило название генетического импринтинга. Следовательно, генетический импринтинг представляет собой явление неэквивалентности генных аллелей, активность которых зависит от родительского происхождения. Например, патологический синдром Прадела-Вилли у человека обязан мутации, которая встречается только в отцовском хромосомном гомологе, а синдром Ангельмана у человека возникает в результате мутации в материнском хромосомном гомологе.

Хромосомные мутации связаны с изменениями числа и структуры хромосом. Изменения в числе хромосом определяются добавлением или уменьшением всего набора хромосом, ведущим к полиплоидии или гаплоидии (соответственно), часто называемые геномными мутациями, а также добавлением или удалением одной или больше хромосом из набора, что ведет к гетероплоидии или анеуплоидии (моносомии, трисомии и др. полисемии), тогда как изменения в структуре хромосом определяются перестройками (аберрациями) их структуры.

Полиплоидия — это хромосомная мутация в виде увеличения числа полных гаплоидых наборов хромосом. Известны триплоидия (Зп), тетраплоидия (4п), пентаплоидия (5п) и т. д. Наиболее часто полиплоидия встречается у растений, поскольку для них характерны гермафродитизм и апомиксис. Почти третья часть всех видов диких цветковых растений представлена полиплоидами. Типичными полиплоидами являются виды пшеницы, у которых соматические числа 2n = 14,28 и 42, при основном гаметном числе n = 7, картофель, табак, белый клевер, люцерна и другие растения. Родственные виды, наборы хромосом которых представляют ряд возрастающего увеличения (кратного) основного числа хромосом, составляют полиплоидные ряды.

Полиплоидные растения с нечетными наборами хромосом характеризуются пониженной плодовитостью и снижением уровня количественных признаков. Напротив, для растений-полиплоидов с четными наборами хромосом характерен повышенный уровень количественных признаков.

Полиплоиды, происходящие от диплоидных организмов аналогичного вида, называют автополиплоидами. Примером автопо-липлоидов служат растения мягкой пшеницы, у которых 2п == 42 и которые являются гексаплоидами. Искусственные полиплоиды, полученные из гибридов диплоидных растений, относящихся к далеко отстоящим друг от друга видам, называют аллополипло-идами.

В природе встречаются как автополиплоиды, так и аллополип-лоиды, однако географическое распределение полиплоидов обычно отличается от распределения их диплоидиых «родственников». Например, флора о. Шпицберген содержит очень высокий процент полиплоидных рядов, тогда как в других местах количество их меньше по сравнению с диплоидами.

Полиплоидия растений имеет хозяйственную ценность (повышенные размеры плодов, большая сахаристость, лучшая сохранность и др.). По этой причине полиплоиды используют в селекционной работе для получения новых сортов сельскохозяйственных растений.

У животных полиплоидия очень редка. Она встречается у земляных червей, размножающихся партеногенетически (обнаружены полиплоидные ряды с основными числами 11, 16, 17, 18 и 19 хромосом), у некоторых членистоногих, рыб и земноводных. В частности, она описана у морских креветок Artemia salivana. Женские особи саламандр отдельных видов, которые имеют крупные эритроциты с ядрами, продуцируют триплоидные личинки с 42 хромосомами, тогда как саламандры с малыми ядерными эритроцитами продуцируют диплоидные личинки с 28 хромосомами. Все тихоокеанские лососевые рыбы являются полиплоидами.

Сирийский хомячок (Mesocricetius aurantus), у которого 2 n = 44, является аллополиплоидом, возникшим в результате естественной гибридизации между европейским хомяком (Cricetus cricetus, 2n == 22) и хомяком, принадлежащим к одному из азиатских видов (Cricetus griseus, 2n = 24).

Редкость полиплоидии у раздельнополых животных, по-видимому, определяется тем, что она нарушает нормальные соотношения аутосом и половых хромосом в зиготах.

Кроме авто- и аллополиплоидии, в соматических клетках ряда многоклеточных организмов установлена эндополиплоидия, характеризующаяся увеличением числа хромосом в покоящемся ядре (при отсутствии митоза). От полиплоидии следует отличать псевдополиплоидию отдельных растений и насекомых, возникающую в результате однократного или многократного деления компонентов генома, когда центромеры имеют диффузный характер.

Гаплоидия — это мутация в виде уменьшения всего набора хромосом. Она найдена в основном также у растений. Известны гапло-иды свыше 800 видов растений, включая такие культуры, как пшеница и кукуруза. У животных она очень редка, а у человека совсем неизвестна.

Мутации в виде нарушений нормального количества хромосом из-за добавления или удаления одной или более хромосом в какой-то хромосомной паре называют гетероплоидией или анеуп-лоидией. Среди гетероплоидов известны полисемии, когда какая-то пара хромосом становится большей на один (трипликатом) и более гомологов, моносомии, когда какая-либо хромосомная пара теряет один гомолог, и нулесомии, когда теряется вся хромосомная пара. Эти мутации широко распространены как у животных, так и у растений. В частности трисомии и моносомии обнаружены у человека, собак и других животных, а также у многих плодовых, зерновых и овощных растений. Часто трисомии, как и моносомии, обнаруживают в клетках абортированных эмбрионов или плодов человека. Гетероплоидия сопровождается многими фенотипическими эффектами, которые, например, у человека неблагоприятны для его здоровья.

Мутации, поражающие структуру хромосом, называют хромосомными перестройками или чаще аберрациями. Эти мутации классифицируют на внутрихромосомные и межхромосомные перестройки. Они возникают как у животных, включая человека, так и у растений.

Внутрихромосомными перестройками являются делении (нехватки, дефишенсы), дубликации, инверсии, тогда как межхромосомные перестройки представлены транслокациями (рис. 119). Внутрихромосомные перестройки в зависимости от «разлома» плеч хромосом бывают парацентрическими («разлом» затрагивает одно хромосомное плечо) и перицентрическими («разлом» проходит по обе стороны центромеры, т. е. захватывает оба плеча). Межхромосомные перестройки обычно захватывают две или более негомологичные хромосомы. Степень изменений бывает различной и часто доходит до изменения группы сцепления.

Делеции представляют собой потери сегмента хромосомы, несущего один или несколько генов. Они являются наиболее частой и опасной для человека формой генетических макроповреждений. Большие делеции заключаются в потере одного или нескольких генов или даже блоков генов. У гаплоидных организмов крупные делеции детальны. Эффект делеции у диплоидных организмов зависит от количества делегированных генов, количественных потребностей в продуктах пораженных генов, позиции генов среди функционально координированных групп и других факторов. Гомозиготные делеции для диплоидных клеток или организмов детальны.

Дупликации (добавления) представляют собой добавления (удлинения) какого-либо сегмента хромосомы, несущего один или несколько генов, в результате того, что один и тот же сегмент хромосомы может быть повторен в процессе биосинтеза несколько раз. Этот повтор может быть малым, касаясь одиночного гена, или большим, затрагивая большое количество генов. Дупликации часто безвредны для их носителей. Предполагают, что они способствуют формированию полигенов или являются способом введения новых генов в геномы. Некоторые дуп-ликации, однако, вредны и даже детальны (см. гл. IX).

Инверсии заключаются в поворотах на 180° сегментов, освобождающихся в результате парных разрывов в хромосомах. Если инвертированный сегмент не содержит центромеру, эту мутацию называют парацентрической инверсией, если же такой сегмент содержит центромеру, такую мутацию называют перицентрической. Инверсии оказывают влияние на мейоз, что приводит к пониженной фертильности гибридов. Описаны отдельные наследственные аномалии, вызываемые этой мутацией (см. гл. XIII).

Транслокация — это обмен частями (сегментами) гомологич-ной и негомологичной хромосом, образованными разрывами по длине последних. Транслоцируемые сегменты могут иметь разные размеры — от небольших до значительных.

Хромосомные перестройки, как и гетероплоидия, также сопровождаются различными фенотипическими эффектами. У человека они ведут к нарушению здоровья. У растений они ведут к изменению их продуктивности.

Однако, обсуждая значение хромосомных перестроек, нельзя не заметить, что для отдельных организмов они безразличны. Например, у пионов, дурмана и других растений присутствие в гено-ме транслокаций является нормальным явлением.

В зависимости от происхождения различают спонтанные и индуцированные генные и хромосомные мутации, которые возникают у организмов независимо от уровня их организации.

Спонтанными называют те мутации, которые возникают у организмов в нормальных (природных) условиях на первый взгляд без видимых причин, тогда как индуцированными называют те мутации, которые возникают в результате обработки клеток (организмов) мутагенными факторами. Главное отличие спонтанных мутаций от индуцированных заключается в том, что мутация может возникнуть в любой период индивидуального развития. Что касается случайного характера мутаций в пространстве, то это означает, что спонтанная мутация произвольно может поразить любую хромосому или ген.

Длительное время считали, что спонтанные мутации являются беспричинными, однако теперь по этому вопросу существуют другие представления, сводящиеся к тому, что спонтанные мутации не являются беспричинными, что они являются результатом естественных процессов, протекающих в клетках. Они возникают в условиях природного радиоактивного фона Земли в виде космического излучения, радиоактивных элементов на поверхности Земли, радионуклидов, инкорпорированных в клетки организмов, которые вызывают эти мутации или в результате ошибок репликации ДНК. Факторы естественного радиоактивного фона Земли вызывают изменения в последовательности оснований или повреждения оснований подобно тому, как это имеет место в случае индуцированных мутаций (см. ниже).

Ошибки репликации ДНК заключаются в том, что какой-либо нуклеотид ошибочно включается в ДНК при ее репликации и при наличии недостатка в «редактирующем» механизме, что исключает коррекцию ошибок. Ошибки в репликации ДНК, т. е. «неаккуратность» ДНК-полимеразы оказывают влияние на частоту спонтанных мутаций. Ошибки репликации ДНК могут быть также связаны с химической нестабильностью нуклеотидов, сопровождающейся изменением спаривающей способности азотистых оснований. Например, цитозин может быть дезаминирован в урацил, который затем распознается ДНК-полимеразой как тимин в течение репликации ДНК.

Определение частот спонтанных мутаций организмов разных видов проводят с помощью разных способов, один из которых связан с определением частоты таких мутаций на репликацию пары азотистых оснований в молекулах ДНК. Этот способ оказался предпочтительным в случае бактерий и других низших организмов.

Определенные к настоящему времени частоты мутаций на репликацию пары оснований и общие частоты генных мутаций у разных организмов показаны в табл. 13.

В случае человека частоты спонтанных мутаций определяют измерением прямых мутаций в пределах разных генов, которые очень чувствительны к мутациям независимо от того, являются ли условия для организмов ограничивающими или селективными.

Рассмотрим конкретный пример определения частоты спонтанных мутаций, например, среди родившихся за один год 242 257 детей 7 оказались больными ахондоплазией. Следовательно, 7 : 242 257´1 : 2 (два аллеля на зиготу) = 1,4´10- 6 . Таким образом частота ахондоплазии составляет 1,4 х 10- 5 . Одни гены вообще устойчивы к спонтанным мутациям, другие спонтанно мутируют чаще, третьи так часто, что их носители являются мозаиками мутантных (мутировавших) и немутантных (немутировавших) генов.

Средние частоты мутаций по многим генам у человека и домашних животных составляют примерно 1´10 -9 , что значительно выше частоты мутаций микроорганизмов. Больше того, между частотами спонтанных мутаций по разным генам человека или домашних млекопитающих существуют значительные различия, достигающие 100 раз, а то и более. Подлинные причины этих различий неизвестны, хотя для их объяснения и предложено несколько гипотез. Одна из них заключается в том, что наиболее чувствительны к мутациям гены больших размеров, поскольку в них содержится много азотистых оснований и существует большая вероятность мутации отдельных из них. По другой гипотезе наиболее чувствительными к мутациям являются гены, располагающиеся в районах хромосом, являющихся «горячими» точками.

Спонтанные и индуцированные мутации. Их биологическая роль. Факторы мутагенеза. Классификация. Примеры. Оценка и профилактика генетического действия мутационной энергии.

Спонтанные мутации - это мутации, которые возникают без видимых причин. Они широко распространены в природе. Все свойства и признаки организма подвержены спонтанным мутациям.

Причины спонтанных мутаций условно делятся на 2 группы - внешние и внутренние. Внешние связаны с естественным радиационным фоном: космическими излучениями, радиацией элементов земной коры, радиактивными изотопами, поступающими в организм с пищей. Обычные показатели естественного радиационного фона (как привыкли говорить, в норме, хотя понятие нормы в данном случае неприменимо) - 13 - 27 микрорентген в час. Внутренние обусловлены генотипом. Так, у кишечной палочки есть гены-мутаторы, наличие которых увеличивает частоту мутаций других генов в 2000 раз. Длительное хранение семян приводит к увеличению частоты спонтанных мутаций. У дрозофилы в норме частота летальных мутаций, локализованных в Х-хромосоме, составляет приблизительно 0,15%; но есть линии, где эта частота равна 1%.

Индуцированные мутации возникают в результате целенаправленного действия какого-то фактора.

Наследственные различия у микроорганизмов, растений, животных и человека, в том числе наследственные болезни и уродства, появились в результате мутаций. Если спонтанные мутации — явление довольно редкое (частота—10 -6 —10 -7 ), то применение мутагенных агентов значительно повышает частоту их.

Факторы, способные индуцировать мутационный эффект, получили название мутагенных. Установлено, что любые факторы внешней и внутренней среды, которые могут нарушить гомео-стаз, способны вызвать мутацию. Главнейшими мутагенами являются: химические соединения, различные виды излучений, биологические факторы.

Самое популярное на сайте:

Тема 5. Управление финансами Управление финансами - это целенаправленное воздействие субъектов управления на систему финансов.
Основные принципы трудового права Принцип права - это краткое отражение сути правовых норм.
Понятие и виды форм государственного устройства Форма государственного устройства - это способ территориальной организации государства.
Кризисы возрастного развития Кризис новорождённости (биологический кризис) - 0 - 2 мес.
Вопрос № 2. Характеристика признаков преступления. Общественная опасность Общественная опасность, будучи важным социальным свойством преступления, выражается в причинении преступлением вреда или создании.

Динамические мутации. Оценка частоты мутаций

Синдром FX является первым описанным синдромом, вызываемым нестабильностью гена FMR1. Механизм развития заболевания связан с локальным гиперметилированием промотора гена FMR1, что в свою очередь становится причиной дефицита белка FMRP и, как следствие, нарушения нейрогенеза.

FMRP-белок представляет собой РНК-связывающий белок, циркулирующий в клетке между ядром и цитоплазмой. Наибольшая экспрессия FMRP отмечается в тканях мозга, в первую очередь в дендритных шипиках. Считается, что FMRP регулирует трансляцию приблизительно 1/3 всех белков пост- и пресинаптического протеома [4]. Это указывает на его важную роль в развитии и поддержании нейронных контактов. При его отсутствии имеет место избыточная дендритная (локальная) трансляция, которая отрицательно влияет на работу синапсов.

Клиническая картина синдрома FX

К фенотипическим особенностям людей с синдромом FX следует относить удлиненное лицо, большие уши, выступающий лоб, загнутый кончик носа, высокое арочное небо, страбизм и астигматизм, макроорхизм после пубертата, гиперэластичность кожи [1].

Когнитивное развитие. Главным клиническим проявлением синдрома являются интеллектуальное недоразвитие и РАС. У большинства пациентов мужского пола IQ не превышает 50 баллов. При этом когнитивное развитие имеет свой специфический профиль, характерный для всех детей с FXS и не меняющийся с возрастом. Так, значительные трудности вызывают задания на зрительно-пространственную и зрительно-моторную координацию, числовые операции, субтесты, выполнение которых построено на сукцессивном способе обработки информации, задачи на планирование и переключение внимания [5, 6]. На этом фоне относительно сохранными могут являться словарный запас, долговременная память, способности к распознаванию лиц и эмоций, незавершенных изображений. Разброс показателей интеллектуального развития среди людей с полной мутацией невелик. Исключение составляют случаи мозаицизма. Различают два вида мозаицизма — количественный и «мозаицизм по метилированию». Количественный мозаицизм означает, что в части клеток число повторов увеличено до состояния полной мутации, в части — до премутации (20—40% пациентов с синдромом FX). Мозаицизм по метилированию предполагает, что в каких-то клетках ген метилирован, а в каких-то нет, хотя во всех клетках имеется полная мутация гена (3%). В целом для людей с мозаичным синдромом FX характерны более высокие показатели интеллекта (70 и выше). Случаи количественного мозаицизма сближают этих пациентов с людьми с премутацией [7, 8].

Более вариативной является картина когнитивных нарушений у женщин—носительниц синдрома. Так, в исследовании B. de Vries и соавт. (1996) было показано, что средний показатель общего интеллекта в группе женщин с полной мутацией составил 74 балла. Среди женщин с полной мутацией 71% имели индекс интеллекта менее 85 баллов, 50% — менее 70 баллов [9]. По результатам другого исследования [10], только 15% девочек 7—15 лет, имеющих полную мутацию, имеют индекс невербального интеллекта более 85 баллов, 40% — между 70 и 85, 45% — менее 70. Вместе с тем, несмотря на различия в степени интеллектуальных нарушений у лиц мужского и женского пола, профиль нарушений достаточно схожий. К слабым сторонам развития следует относить кратковременную слухоречевую память, абстрактное мышление, исполнительные функции, пространственные представления, арифметические операции. Относительно сохранными могут оказаться симультанный способ обработки информации, зрительное восприятие, ситуативная память.

Речевое развитие. Динамика речевого развития наряду с аутистическими симптомами является одним из наиболее нестабильных признаков синдрома. У большинства детей, имеющих полную мутацию, в той или иной степени наблюдаются речевые нарушения. Фразовая речь обычно появляется с выраженной задержкой, к 4 годам. Вместе с тем степень нарушений может быть различной. У части детей экспрессивная, рецептивная и прагматическая стороны речи соответствуют аналогичным показателям у детей более младшего возраста или детей с другими формами интеллектуальной недостаточности аналогичного уровня развития ментальных способностей [11, 12].

В других исследованиях были получены противоположные результаты, согласно которым речевое развитие может расходиться с тем уровнем, который можно ожидать, исходя из ментального возраста ребенка. В целом было показано, что нарушения речевого развития ассоциированы с выраженностью аутистической симптоматики [13—15]. Чем сильнее выражены аутистические проявления, тем хуже развита речь. В исследовании [16] было показано, что при выполнении заданий, инструкции к которым были намеренно неадекватными, подростки и юноши с синдромом FX намного реже, чем здоровые дети более младшего возраста, сообщали собеседнику о своем непонимании задания. Эти особенности коррелировали с уровнем понимания речи. Чем лучше испытуемые понимали обращенную речь, тем чаще они сообщали о затруднениях, с которыми сталкивались. Связь с аутистическим профилем в данной работе не рассматривалась, но в качестве гипотезы можно предположить, что фактором, оказывающим взаимное влияние на эти два речевых аспекта, могут быть именно нарушения коммуникации, характерные для аутизма. Подтверждением этой гипотезы могут служить исследования, показавшие корреляцию между степенью аутистических расстройств и уровнем рецептивной речи [17].

Важно также отметить, что речь людей с синдромом FX в большинстве случаев обладает рядом специфических особенностей. Сюда относятся ускоренный темп, тенденции к автоматическим повторам отдельных слов, персеверациям. С чем связаны различия в речевом развитии, от чего зависит степень, в которой ребенок овладевает речью, на настоящий момент неизвестно [1].

Аутистические расстройства. Синдром FX принято считать коморбидным аутизму. По различным оценкам от 60 до 90% случаев дети с этим синдромом демонстрируют поведенческие признаки, достаточные для диагноза «расстройства аутистического спектра» или «аутизм» [18].

Интересной является динамика аутистической симптоматики в течение жизни. Так, в лонгитюдинальном исследовании [19] при диагностике аутистических расстройств (с помощью методики ADOS) в возрасте 8,5—9 лет 54,8% мальчиков и 41,5% девочек с полной мутацией были отнесены к диагностической группе РАС. При повторной диагностике (через 2,5 года) уже 80,6% мальчиков были отнесены к этой диагностической группе. При этом число девочек в группе РАС значимо не изменилось. Общий процент детей, которые при повторном измерении были отнесены к группе РАС, составил 60. При этом отрицательная динамика в наибольшей степени касалась социально-коммуникативных навыков и не затрагивала стереотипные формы поведения и интересов. В этом было наиболее значимое отличие между детьми с синдромом FX, попавшими в группу РАС, и детьми с идиопатическим аутизмом. У последних, напротив, обнаруживалось усиление симптоматики в разделе стереотипных форм поведения. Данные результаты частично могут объясняться техникой проведения обследования. Если при первичном тестировании в 50% случаев использовался ADOS модуль 2, а в 50% — ADOS модуль 3, то при повторной диагностике 80% детей обследованы при помощи модуля 3. Модуль 3 опирается на более развитую фразовую речь, в связи с чем навыки социального обмена также в большей степени начинают рассматриваться в контексте речевой коммуникации. В связи с этим акцент в диагностике сдвигается с невербальных форм общения на вербальные. cледовательно, в данном случае мы опять подходим к мысли о связанности и взаимозависимости нарушений речевого развития и аутистического профиля в картине синдрома FX.

Особенности поведения. Лица мужского пола, имеющие синдром FX, часто демонстрируют выраженную гиперактивность, импульсивность и нарушения внимания [20]. Однако степень нарушений регуляции поведения также неодинакова. У части детей наблюдается выраженная гиперактивность, которая становится существенным препятствием для обучения и овладения различными навыками. У других детей подобный симптомокомплекс не так выражен.

Эмоционально-личностные особенности. Для детей с FXS характерен высокий уровень социальной тревожности. Часто они испытывают трудности при удержании глазного контакта, демонстрируют избегающее поведение в социальных ситуациях. Характерно, что в отличие от идиопатического аутизма при синдроме FX стабильность глазного контакта во многом зависит от привычности обстановки, в которой находится ребенок, степени его комфорта и доверия человеку, с которым он взаимодействует. В ряде случаев избегание зрительного контакта носит характер чрезмерной застенчивости, вызванной высокой социальной тревогой [20].

Было показано, что среди детей, подростков и взрослых обоих полов с FXS 82,5% соответствуют критериям, по крайней мере, одного тревожного расстройства, а 58,3% — нескольких таких расстройств. Гораздо большее число испытуемых имели те или иные проявления тревожных расстройств, не достигающие, однако, клинической выраженности. Наиболее частыми тревожными расстройствами среди испытуемых были специфические фобии (64,9% мужчин и 51,4% женщин), социальная фобия (34,5% мужчин и 39,5% женщин) и селективный мутизм (28,1% мужчин и 25,3% женщин) [21].

Таким образом, на настоящий момент считается, что клиническая картина синдрома FX определяется отсутствием или выраженным дефицитом белка FMRP. Поскольку ген FMR1, отвечающий за синтез FMRP, расположен в X-хромосоме, синдром тяжелее проявляется у лиц мужского пола. Клиническая картина заболевания определяется умственным снижением, аутистическими признаками и рядом особенностей физического фенотипа. Коэффициент интеллекта у мальчиков и мужчин с FXS варьирует в диапазоне от 45 до 55 баллов. Известные на сегодняшний день случаи более мягкой картины интеллектуального недоразвития связаны с мозаичным характером заболевания. У женщин разброс по уровню развития когнитивной сферы существенно больше за счет наличия второй копии X-хромосомы. Гораздо менее однозначным является социальное и речевое развитие у людей с FXS. До 60% детей с FXS полностью удовлетворяют критериям для постановки диагноза аутизма. Еще 30% могут быть отнесены к группе РАС. Как оказалось, степень аутистических расстройств коррелирует с уровнем речевого развития у детей с FXS. В целом следует отметить, что разброс показателей речевого развития также достаточно велик. У части детей речь не формируется вовсе, у части — уровень вербальной коммуникации соответствует невербальному интеллекту. Однако приблизительно 20% детей с FXS не имеют нарушений общения и социального взаимодействия, что ставит перед исследователями вопрос о том, какие факторы влияют на формирование клинической картины и ее тяжести в этой области.

Читайте также: