Нарушение репарации ДНК как причина развития рака

Добавил пользователь Alex
Обновлено: 03.02.2025

Нарушения функций вышерассмотренных белков, контролирующих апоптоз и/или клеточный цикл (p 53 , pRb, p16 INK4a , pARF и др.) отменяют запрет на пролиферацию клеток с различными аномалиями, в том числе и с генетическими изменениями, что увеличивает вероятность появления онкогенных клеточных клонов. Эту группу белков принято называть "gatekeepers" - "сторожи". Наряду с этим идентифицирован ряд компонентов специализированных систем распознавания и репарации повреждений ДНК, дисфункция которых также вызывает генетическую нестабильность, предопределяющую развитие новообразований. Они получили название "caretakers" - "смотрители". Эта вторая группа белков и является предметом рассмотрения данного раздела.

В зависимости от типа повреждений ДНК могут активироваться три типа репарационных систем: а) системы репарации двунитевых разрывов ДНК; б) системы репарации неспаренных оснований ("mismatch repair"); и, в) системы эксцизионной репарации. Описаны наследственные формы новообразований, связанные с врожденными мутациями генов, продукты которых обеспечивают активацию и функционирование каждой из этих систем. Причем, некоторые из этих белков (ATM, CHK2, р53, BRCA1) активируют также и молекулы, ответственные за остановку клеточного цикла и индукцию апоптоза, выполняя, таким образом, одновременно функции и "смотрителя", и "сторожа".

3.11.1. АТМ, ATR, NBS1, CHK1 и CHK2 - компоненты систем проведения сигналов от поврежденной ДНК к различным эффекторам

Ключевую роль в интеграции сигналов от поврежденной ДНК и их дальнейшей передаче к разнообразным эффекторам играют специфические протеинкиназы ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated), ATR (ATM Related), NBS1, CHK1 и CHK2 (чекпойнткиназы 1, 2) - Рис. 7. Белок ATM, имеющий структурное сходство с фосфатидилинозит-3-киназой (PI3K), накапливается в местах повреждений и приобретает киназную активность, связывая фосфорилированные белки хроматина (H2AX и др.) и белки-сенсоры нарушений структуры ДНК. Причем, ATM активируется в ответ на возникновение двунитевых разрывов ДНК (вызываются g-облучением, ингибиторами топоизомераз и т.д.), тогда как другие нарушения структуры ДНК (например, сшивки оснований, вызываемые УФ-облучением или повреждения, индуцируемые алкилирующими соединениями) не активирует ATM. В этих случаях, как и при ингибировании синтеза ДНК, наблюдается функциональная активация гомолога ATM, белка ATR. Активированные формы ATM и ATR фосфорилируют ряд своих мишеней, в частности р53 (см. раздел 3.3.3), Mre11, NBS1, CHK1, CHK2 и BRCA1 (Рис. 7).

Рис. 7. Схема сигнальных путей, регулирующих реакции клетки на повреждения ДНК. Выделены компоненты, герминальные мутации которых ответственны за наследственные синдромы, характеризующиеся предрасположенностью к развитию определенных новообразований.

Причем для фосфорилирования CHK2 необходимо предварительное фосфорилирование белков комплекса Mre11/NBS1/Rad50, который, локализуясь в местах повреждений, рекрутирует к ним различные молекулы, в том числе CHK2, BRCA1, E2F и PCNA. Привлечение PCNA вызывает переключение с репликативного синтеза ДНК на репарационный и остановку клеточного цикла в S фазе; к блокированию входа и продвижения по S ведет и подавление функции E2F (см. 3.2.2). Фосфорилированные чекпойнткиназы CHK1/2, в свою очередь, фосфорилируют и инактивируют белки семейства Cdc25, что вызывает подавление активности регулируемых ими циклинзависимых киназ и быструю остановку клеточного цикла в G1 (если Cdc25A не активирует Cdk2) или в G2 (когда Cdc25C не активирует Cdc2). Кроме того, CHK1 и CHK2 амплифицируют сигналы к р53 и BRCA1, что способствует длительной задержке в G1 или G2 (см. разделы 3.3.3 и 3.11.2) и, кроме того, активизирует системы репарации ДНК (см. следующие разделы) - Рис.7.

Герминальные инактивирующие мутации обоих аллелей гена ATM вызывают атаксию-телангиэктазию (АТ) - тяжелое заболевание, характеризующееся нейродегенерацией, иммунодефицитом и повышенным риском возникновения новообразований. Примерно у 10% пациентов с АТ в молодом возрасте развиваются лимфоидные опухоли из Т- или В-клеток (лимфосаркомы, лимфогрануломатоз, различные формы лейкозов), а также рак молочной железы. Соматические гомозиготные мутации гена АТМ характерны и для некоторых форм ненаследственных лимфолейкозов (Т-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, В-клеточного хронического лимфолейкоза и др.). Гомозиготный нокаут гена ATM у мышей также значительно увеличивает вероятность развития лимфоидных неоплазий. У индивидуумов с герминальными мутациями только одного из двух аллелей гена АТМ несколько повышена частота возникновения рака молочной железы. Онкогенный потенциал мутаций АТМ связан, очевидно, с нарушениями реакций клетки на повреждения ДНК и возникающей в связи с этим генетической нестабильностью. Так, после g-облучения в клетках с дефектным АТМ не происходит полноценной активации чекпойнтов и остановки клеточного цикла в G1, S или G2. Кроме того, в них блокирована активизация системы репарации двунитевых разрывов ДНК. В результате при инактивации АТМ резко увеличивается вероятность размножения клеточных вариантов с различными генетическими нарушениями.

Сходные последствия наблюдаются и при инактивации одной из важнейших мишеней АТМ - белка NBS1. Герминальные гомозиготные мутации гена NBS1 вызывают Ниймегенский синдром (Nijmegen Breakage Syndrome), характеризующийся иммунодефицитом, генетической нестабильностью и повышенной предрасположенностью к развитию лимфоидных новообразований (в отличие от мутаций АТМ, мутации NBS1 не вызывают атаксию и телангиэктазию). Соматические мутации гена NBS1 выявляются в 10-20% случаев ненаследственных форм острого лимфобластного лейкоза. В клетках с инактивацией NBS1 наблюдается отмена остановки в S после g-облучения и понижение эффективности работы систем репарации двунитевых разрывов ДНК вследствие нарушения функционирования комплекса Rad50/Mre11/NBS1, обеспечивающего оба механизма исправления таких повреждений - гомологичную рекомбинацию ДНК и воссоединение концов разорванной ДНК.

Потенциальным онкогенным эффектом обладают, по-видимому, и нарушения функции белка ATR. Гетерозиготный нокаут гена ATR у мышей приводит к увеличению частоты возникновения лимфосарком, фибросарком, раков печени и яичника (инактивация обоих аллелей гена ATR, в отличие от гомозиготного нокаута гена ATM, вызывает внутриутробную гибель). У людей наследственного предрасположения к развитию каких-либо новообразований, связанного с врожденными мутациями ATR пока не выявлено, но соматические мутации этого гена нередко выявляются в клетках некоторых опухолей, в частности рака желудка.

Увеличение риска развития новообразований наблюдается и при врожденных мутациях чекпойнткиназы CHK2. Оказалось, что у части пациентов с клиническими проявлениями синдрома Ли-Фраумени (см. раздел 3.3.1), но не имеющих мутаций р53, выявляются герминальные гетерозиготные мутации гена CHK2. Этот факт свидетельствует о ключевой роли нарушений сигнального пути CHK2-p53, контролирующего реакции клетки на повреждения ДНК, в возникновении сильной предрасположенности к развитию самых разных новообразований. Соматические инактивирующие мутации чекпойнткиназ CHK2 и CHK1 обнаруживаются в части случаев наиболее распространенных опухолей: рака легкого, толстой кишки, матки и др.

3.11.2. BRCA1 и BRCA2 контролируют репарацию ДНК и размножение клеток

Гены BRCA1 и BRCA2 были впервые идентифицированы как гены, врожденные мутации которых ассоциированы с наследственными формами рака молочной железы. У женщин с герминальными мутациями одного из аллелей гена BRCA1 риск развития в течение жизни рака молочной железы составляет около 85% (этот риск несколько варьирует в зависимости от местоположения и/или типа мутаций). Для опухолей яичника такой риск несколько меньше - около 50%. У носителей врожденных мутаций гена BRCA1 выше также вероятность развития опухолей толстого кишечника и простаты. При герминальных мутациях гена BRCA2 риск развития опухолей молочной железы несколько ниже, чем при мутациях BRCA1. Отличительными чертами мутаций BRCA2 являются более частое возникновение рака молочной железы у мужчин и меньший риск развития опухолей яичника. Гены BRCA1 и BRCA2 ведут себя как классические опухолевые супрессоры: для инициации опухолевого роста помимо врожденной мутации в одном из аллелей необходима и инактивация второго аллеля, которая происходит уже в соматической клетке. Как правило, мутации в генах BRCA1 и BRCA2 ведут к прекращению синтеза полноразмерного белка. Особенностью мутаций генов BRCA1 и BRCA2 является то, что они характерны для наследственных форм новообразований и значительно реже обнаруживаются в ненаследственных опухолях той же локализации.

Гены BRCA1 и BRCA2 кодируют ядерные фосфобелки (соответственно 1863 и 3495 аминокислот), которые за счет разнообразных белок-белковых взаимодействий участвуют в регуляции репарации ДНК и размножения клеток. Так, белок BRCA1 связывает белки, ответственные за гомологичную рекомбинацию и репарацию двунитевых разрывов ДНК (Rad50, Rad51, BRCA2), компоненты систем репарации неспаренных оснований ДНК (MSH2, MSH6, MLH1, ATP-MSH2 и др.), транскрипционные факторы (базальные - HDAC, р300/CBP, SWI/SNF; и сиквенс-специфические - p53, Myc, E2F, ZBRK1, ATF, рецептор эстрогенов, рецептор андрогенов), а также ряд других белков - pRb (см. II.3.2), BARD1 (опосредует убиквитинирование), BAP1 (ответственен за деубиквитинирование), Nm23 (компонент центросомы) и т.д.

Транскрипционная функция BRCA1 заключается в его способности репрессировать одни сиквенс-специфические факторы транскрипции (Myc, E2F, рецептор эстрогенов и др.) и активировать другие (р53 и др.) и модулировать таким образом активность генов, регулируемых этими факторами. При генотоксических стрессах (g-облучение и др.) транскрипционная функция BRCA1 направлена на индукцию остановки клеточного цикла по нескольких механизмам. Так, она обеспечивает усиление активности р53; включение дублирующих, р53-независимых, путей активации некоторых р53-респонсивных генов (p21 Waf1/Cip1 , GADD45), вызывающих задержку соответственно в G1 и G2 (см. раздел 3.3.3); подавление активности Myc, E2F и т.д. Одновременно активированный BRCA1, взаимодействуя с белками репарационных систем, стимулирует восстановление нормальной структуры ДНК. Рекрутируя комплексы Rad50/Mre11/NBS1, он стимулирует процессирование концов разорванной ДНК, подготавливая их либо для гомологичной рекомбинации, либо для воссоединения "конец в конец" - двух основных путей репарации двунитевых разрывов ДНК. Взаимодействуя с комплексом Rad51/BRCA2, он увеличивает эффективность процесса гомологичной рекомбинации ДНК. Связываясь с белками MSH2, MSH3, MSH6 и др., BRCA1 участвует, очевидно, также и в работе системы репарации неспаренных оснований (исправляет ошибки репликации ДНК и неправильную репарацию двунитевых разрывов ДНК) - см. раздел 3.11.3.

Помимо контроля повреждений ДНК и поддержания целостности генома BRCA1 выполняет и ряд других функций. Так, он связывает рецептор эстрогенов и репрессирует его транскрипционную функцию, сдерживая, таким образом, избыточную пролиферацию клеток молочной железы и других эстроген-зависимых органов, в частности при половом созревании и беременности. Кроме того, BRCA1, взаимодействуя с компонентами центросом (Nm23 и др.), принимает участие в обеспечении правильной сегрегации хромосом во время митоза.

Исходя из столь многочисленных функций BRCA1, становятся понятными последствия его инактивации. В клетках с дефектным BRCA1 наблюдается сильная генетическая нестабильность, т.е. повышение частоты возникновения спонтанных или индуцированных мутагенами генетических изменений - генных мутаций, хромосомных транслокаций, анеуплоидии и т.д. Кроме того, отменяется сдерживание пролиферации эстроген-зависимых клеток, что и объясняет, очевидно, возникновение опухолей именно молочной железы и яичника.

Функции белка BRCA2 изучены хуже. Как и BRCA1 он обладает репарационными и транскрипционными активностями. Связывая Rad51 (гомолог бактериального белка RecA), BRCA2 увеличивает его способность катализировать рекомбинации ДНК, обеспечивающие репарацию двунитевых разрывов ДНК. Транскрипционная функция BRCA2 связана, очевидно, со способностью рекрутировать P/CAF (p300/CBP Associated Factors), ацетилирующие гистоны и ремоделирующие хроматин. Однако физиологические гены-мишени BRCA2 пока не идентифицированы. Тем не менее о важности транскрипционной активности BRCA2 для его супрессорной функции может свидетельствовать тот факт, что обнаруживаемые в опухолях молочной железы мутации поражают именно транскрипционный домен. У мышей гомозиготный нокаут резко уменьшает жизнеспособность эмбрионов, а у выживших животных развиваются злокачественные тимомы. На клеточном уровне инактивация BRCA2 приводит к гиперчувствительности к различным генотоксическим агентам (УФ- и g-облучению, химическию мутагенам), повышению частоты встречаемости незарепарированных двунитевых разрывов ДНК и различных перестроек хромосом. Механизмы специфического возникновения у пациентов с герминальными мутациями BRCA2 опухолей молочной железы, яичника и простаты пока не установлены.

3.11.3. MSH2, MSH6, MLH1 и PMS2 - компоненты систем репарации неспаренных оснований ДНК

Риск развития новообразований значительно повышается и при врожденных дефектах системы репарации неспаренных оснований (mismatch repair), исправляющей главным образом ошибки репликации ДНК и неточности репарации двунитевых разрывов. В результате таких ошибок и потери комплементарности нитей ДНК возникают петли, которые распознаются комплексами белков MSH2/MSH6 или MSH2/MSH3 (они отличаются по способности узнавать разные типы петель, образующиеся при замене оснований, инсерциях и делециях). Эти комплексы рекрутируют к местам с нарушенной структурой ДНК комплексы белков MLH1/PMS2 или MLH1/MLH3, которые, в свою очередь, привлекают экзо- и эндонуклеазы, осуществляющие эксцизию аномального фрагмента ДНК, а также факторы репликации (PCNA, ДНК-полимеразы), обеспечивающие застройку бреши и восстановление нормальной структуры ДНК.

Врожденные гетерозиготные мутации по меньшей мере четырех из компонентов этой системы - MSH2, MLH1, MSH6 и PMS2 - вызывают синдром Линча. Главной чертой этого синдрома является развитие в молодом возрасте опухолей толстой кишки (так называемый наследственный неполипозный колоректальный рак) и/или опухолей яичника. Преимущественное возникновение опухолей кишечника, вероятно, связано с высочайшим пролиферативным потенциалом клеток на дне кишечных крипт, что естественно ведет и к более частому появлению ошибок репликации, которые должны исправляться именно системами репарации неспаренных оснований. Естественно, что бурно размножающиеся полустволовые (амплифицирующие) клетки кишечного эпителия накапливают необходимый для развития опухолей набор мутаций быстрее, чем медленно размножающиеся клетки.

Возникновение опухолей при дисфункции MSH2, MLH1, MSH3 или PMS2 связано, очевидно, с повышенной вероятностью мутаций в протоонкогенах и опухолевых супрессорах. Действительно, при мутациях гена MSH2 или MLH1 частота точечных мутаций во всех локусах увеличивается на 1-2 порядка, а в наследственных колоректальных раках, как правило, обнаруживаются точечные мутации в генах b-катенина, АРС, TbR-II, Smad2, Smad4 и т.д., которые, по-видимому, и являются причиной развития новообразований. Маркером инактивации любого из генов репарации неспаренных оснований является легко выявляемая нестабильность микросателлитных последовательностей ДНК. Нарушения функции генов MSH2, MLH1, MSH3, MSH6 и PMS2, приводящие к нестабильности микросателлитов, характерны и для некоторых форм спорадических (ненаследственных) опухолей: они обнаруживаются в 13-15% опухолей толстой кишки, рака желудка и эндометрия, но значительно реже (<2%) в других новообразованиях.

Описаны единичные случаи герминальных мутаций обоих аллелей гена MLH1, которые приводили к развитию еще во внутриутробном возрасте лимфосарком, лейкозов и нейрофиброматоза. Это объясняется видимо тем, что при полной инактивации системы репарации ошибок репликации ДНК и бурном размножении в эмбриогенезе клеток всех тканей, необходимое для образования опухоли количество мутаций успевает накопиться в каких-то клетках задолго до рождения, тогда как при гетерозиготных мутациях темп мутирования ниже и накопление мутаций до критического уровня продолжается в интенсивно размножающихся клетках взрослого организма. С этой точки зрения пока непонятно, почему у мышей как с гетерозиготным, так и с гомозиготным нокаутом гена MSH2 или гена MLH1, также развиваются лимфомы и саркомы, а не опухоли кишечника. (Впрочем, следует заметить, что мыши сильно отличаются от человека и по типу спонтанно развивающихся опухолей: у человека большую часть новообразований представляют различные формы рака, возникающие из эпителиоцитов, тогда как у мышей такие опухоли достаточно редки, а возникают, как правило, лимфомы и саркомы). Природу таких различий еще предстоит выяснить.

3.11.4.Компоненты системы эксцизионной репарации ДНК и пигментная ксеродерма

Система эксцизионной репарации узнает и исправляет сшивки оснований (тиминовые димеры и др.), образующиеся, например, после УФ-облучения или оксидативного стресса. Она включает множество компонентов. Распознавание тиминовых димеров осуществляется белковым комплексом XPC-hHR23, который вызывает рекрутирование к месту повреждения фактора TFIIH - сложного белкового комплекса, состоящего из 9 субъединиц и обладающего разными активностями, в том числе хеликазной и транскрипционной. Привлеченный фактор TFIIH катализирует раскрытие поврежденного участка ДНК и способствует сборке репарационного комплекса. Затем к дефектному участку последовательно рекрутируются белки XPG, XPA, комплекс RPA и, наконец, белки XPF-ERCC1, являющиеся эндонуклеазами. Именно они и осуществляют эксцизию поврежденного участка ДНК (обычно вырезается 24-32 нуклеотида) и инициируют застройку бреши по неповрежденной матрице и восстановление нормальной структуры ДНК.

Герминальные гетерозиготные мутации компонентов системы эксцизионной репарации, в частности генов XPA, XPB, XPC, XPD, XPF, XPG, ведут к возникновению пигментной ксеродермы - наследственного заболевания, характеризующегося повышенной чувствительностью к ультрафиолетовому облучению и развитием множественных опухолей кожи на местах, подвергающихся солнечному облучению. Интересно, что, несмотря на участие эксцизионной репарации в исправлении дефектов, вызванных не только УФ-облучением, но и мутагенами/канцерогенами, частота возникновения других форм опухолей при пигментной ксеродерме почти не увеличивается. При этом у трансгенных мышей с аналогичными дефектами системы эксцизионной репарации отмечается повышение частоты индукции новообразований химическими канцерогенами. Преимущественное возникновение у пациентов с пигментной ксеродермой исключительно опухолей кожи может указывать на незначительную роль химических факторов, загрязняющих окружающую среду, в развитии опухолей внутренних органов у человека.

Материалы конгрессов и конференций

Много лет назад Джеймс Кливер и Дирк Бутсма показали, что фибробласты больных пигментной ксеродермой (ПК) имеют дефект по эксцизионной репарации (ЭР) ДНК после УФ облучения. Поскольку у большинства больных ПК образуется рак кожи, эти данные указывали, что у нормальных людей, редко болеющих раком кожи, репарация ДНК является важным фактором подавления канцерогенеза. По определению, репарация уменьшает число повреждений в ДНК, в том числе и вступающих в репликацию, тем самым, снижая вероятность образования мутаций и хромосомных перестроек, а, следовательно, инициацию рака и прогрессию опухолей. Эта простая концепция была впоследствии подтверждена на некоторых других моделях и стала весьма популярной, однако соотношения между репарацией ДНК и канцерогенезом оказались значительно более сложными, чем это представлялось ранее. Выяснилось, в частности, что до самой репарации работают сложные сигнальные каскады идентификации повреждений в геноме и выбора между репарацией и апоптозом, а также выбора адекватной системы репарации для данного типа повреждений. В последние годы значительный прогресс достигнут в понимании механизмов так называемой пострепликативной репарации или механизмов обхода повреждений ДНК во время и после репликации без их элиминации из генома, а также механизмов эпигеномных модификаций хроматина. Данный доклад будет посвящен краткому описанию известных к настоящему времени систем репарации ДНК в клетках высших эукариот и их роли в поддержании стабильности генома, обеспечивающей в нормальных клетках низкие темпы канцерогенеза.

Наиболее изученной системой репарации является эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН), частично дефектная у большинства больных пигментной ксеродермой. При ЭРН модифицированные нуклеотиды (например, пиримидиновые димеры) удаляются из поврежденной нити благодаря действию нуклеаз XPG и ERCC1/XPF, а образующийся при этом однотяжевый пробел заполняется ДНК-полимеразами d или e с помощью PCNA и зашивается ДНК-лигазой. В ЭРН работают также геликазы XPD и XPB, входящие в состав комплекса TFIIH, и комплекс XPA/RPA, стабилизирующий расплетенный участок и, по-видимому, определяющий, в какой нити будут сделаны разрезы. Узнавание димеров в неактивной ДНК (так называемая глобальная репарация) обеспечивают комплексы XPC/HR23B и DDB2/DDB1, экспрессия которых контролируется хорошо известным опухолевым супрессором и транскрипционным фактором р53. Транскрипция гена DDB2 является индуцибельной, однако ген XPC экспрессируется постоянно.

При ЭРН повреждения ДНК могут распознаваться и без участия комплексов XPC/HR23B и DDB2/DDB1 при так называемой транскрипционной репарации, когда транскрипционный комплекс, содержащий РНК полимеразу II, блокируется на некодирующем повреждении, а репарация запускается белками CSA и CSB, дефектными при синдроме Кокейна. В отличие от больных с пигментной ксеродермой, у больных с синдромом Кокейна (рано стареющие кахектичные карлики) не наблюдается повышения частоты рака кожи, хотя фибробласты УФ-чувствительны. В одной из гипотез предполагается, что в клетках больных с синдромом Кокейна блок транскрипции быстро индуцирует апоптоз, поэтому раковые клоны образоваться не успевают.

Третий важный механизм репарации - это устранение неправильно спаренных нормальных нуклеотидов, гетеродуплексных пар или мизматчей, часто образующихся при репликации некоторых последовательностей в матричных нитях, например микросателлитов, а также при репликации обычных последовательностей нуклеотидов. Дефекты в генах системы репарации гетеродуплексов приводят к нестабильности микросателлитных сегментов и к мутациям по различным генам, в том числе и по генам опухолевых супрессоров. Почему-то особенно хорошо это проявляется в клетках эпителия толстого кишечника и приводит к высокой частоте наследственных неполипозных раков толстой кишки (HNPCC). Наиболее часто встречаются пациенты с мутациями генов hMLH1 (60% всех случаев HNPCC) и hMSH2 (35%), реже - hMSH6, а мутации по hPMS1 и hPMS2 обнаружены лишь в нескольких семьях. Мутации по генам hMLH3 и EXO1 (экзонуклеаза, взаимодействующая с hMSH2) тоже выявлены, но их значение пока неясно, поскольку у носителей рака нет. Мутаций по гену hMSH3 вообще пока не обнаружено.

Очень важной для клетки (и для канцерогенеза) является ее способность воссоединять случайные двойные разрывы (ДР) ДНК, что осуществляется двумя различными репарационными механизмами - негомогическим воссоединением концов (НГВК) ДНК и путем гомологической рекомбинации (ГР) при наличии по соседству второй копии неповрежденного идентичного по нуклеотидной последовательности сегмента ДНК, например сестринской хроматиды. Поскольку в диплоидных ядрах гомологичные хромосомы пространственно разделены (хромосомные территории), репарация путем ГР преимущественно происходит в S- и G2 фазах клеточного цикла, а НГВК осуществляется во время любой фазы цикла. В геномах высших эукариот имеется много повторов, по которым, в принципе, возможна репарация путем ГР, однако такая репарация ДР приводит к хромосомным транслокациям, и она практически полностью подавлена. Главным механизмом подавления потенциально кластогенной ГР между повторами и вообще неправильных (эктопических) воссоединений концов ДНК при репарации ДР является, по-видимому, локальная специфическая модификация хроматина по гистону Н2АХ - фосфорилирование лизина-139 (или образование γ-H2AX). Эта модификация, происходящая в мегабазных доменах хроматина рядом с ДР, способствует удержанию долгоживущих концов ДНК благодаря привлечению в эти домены специального белка когезинa (SMC1), а также белка hRad50, который может одномоментно связываться с двумя концами ДНК.

В клетках человека репарация путем НГВК непосредственно осуществляется продуктами генов DNA-PK, Ku70/80, XRCC4, LIG4, Artemis, hRAD50, hMRE11 и NBS1, а репарация путем ГР происходит с помощью белков RAD51 (paralogs XRCC2, XRCC3), RAD52, RAD54, BRCA1, BRCA2 (FANCD1), FANCD2, а также комплексов XPF/ERCC1 и hRAD50/hMRE11/NBS1. Узнавание случайных ДР осуществляется либо самим комплексом hRAD50/hMRE11/NBS1, который быстро связывается с концами ДНК, либо протеинкиназой АТМ (дефективной при наследственном синдроме атаксия-телеангиэктазия), которая выявляет какие-то не идентифицированные локальные изменения хроматина, вызванные ДР, и при этом активируется. АТМ-киназа быстро фосфорилирует гистон Н2АХ, белки NBS1, FANCD2 и Artemis, а также киназу Chk2 (RAD53), останавливающую клеточный цикл. Фосфорилирование белка Artemis необходимо для репарации примерно 10% случайных ДР. Образование γ-H2AX возможно и за счет активности других киназ (ATR и DNA-PK), но киназа ATR включается только при блоке репликации ДНК, когда в вилках репликации образуются достаточно протяженные однотяжевые бреши, связывающие белок RPA. Заметим, что репарация путем НГВК является неточной, и при ней всегда образуются микроделеции, тогда как ГР точно восстанавливает исходную последовательность нуклеотидов.

Важной для канцерогенеза является пострепликативная репарация (ПРР) или обход повреждений (lesion bypass or DNA damage tolerance) во время или после репликации. Этот путь был открыт у бактерий почти 40 лет назад, когда было показано, что напротив не вырезанных пиримидиновых димеров во время репликации образуются однотяжевые пробелы в дочерних нитях, которые затем устраняются гомологической рекомбинацией между сестринскими дуплексами ДНК, контролируемой белком RecA. ПРР рассматривается как главный источник индуцируемых мутаций.

Основные результаты по генному контролю ПРР в клетках эукариот были получены на дрожжах - это гены эпистатической группы RAD6 (RAD18, RAD5, MMS2, UBC13, RAD30, REV3, POL30). Гомологи большинства из этих генов идентифицированы в геномах высших эукариот. В настоящее время рассматриваются два основных (не альтернативных) механизма обхода некодирующих повреждений у эукариот: 1) прямой синтез ДНК напротив поврежденных нуклеотидов c помощью специальных ДНК-полимераз (translesion synthesis, TLS, or DNA polymerase switch); 2) использование как матрицы для синтеза напротив димера неповрежденного сестринского дуплекса без разрывов родительских нитей, смена матрицы (template switch, TMS). Небольшая часть пострепликативных пробелов может устраняться, по-видимому, и с помощью ГР между сестринскими дуплексами, при которой происходят разрывы родительских нитей ДНК и сестринские хроматидные обмены. Этот механизм ПРР аналогичен точной репарации двойных разрывов ДНК путем ГР, но касается только двойных разрывов, образующихся при репликации. При блоке репликации, однако, клетка стремится избежать рекомбинации, при которой образуются двойные разрывы ДНК в репликативных вилках. Подавление рекомбинации в заблокированных вилках происходит благодаря сумоилированию по лизину-164 белка PCNA ферментом UBC9, после чего SUMO-PCNA связывает геликазу SRS2, которая уже блокирует образование RAD51 филаментов. Дополнительными факторами подавления ГР в вилках репликации являются также известные геликазы BLM, WRN и RECQ4, дефективные при синдромах Блюма, Вернера и Ротмунда-Томсона, соответственно.

Главным событием при TLS является замена блокированной репликативной ДНК полимеразы (ДПδ или ДПε) на другую ДНК полимеразу, способную вставлять нормальные нуклеотиды напротив поврежденных звеньев. В клетках человека такой TLS-полимеразой является продукт гена, дефектного при вариантной пигментной ксеродерме, ДНК полимераза η (ДПη) (у дрожжей ген RAD30), которая связывается с репликативным белком PCNA (POL30), причем связывание усиливается при моно-убихитинилировании PCNA также по лизину-164. Эта модификация зависит от белка RAD18 и происходит при торможении репликации, однако остается неясным, каким образом при этом активируется RAD18. По нашим данным, при торможении репликации hRAD18, как и ДПη, накапливается в заблокированных вилках (фокусах репликации) и при этом перестает экстрагироваться из ядра буфером, содержащим Тритон-Х100. Эти изменения подавляются ингибиторами протеинкиназ стауроспорином и вортманнином, то есть могут быть связаны с фосфорилированием либо самого RAD18, либо какого-то взаимодействующего с ним белка. Есть основания предполагать, что это фосфорилирование осуществляется каскадом ATR/Chk1 в ответ на накопление однотяжевой ДНК в вилках репликации.

В дрожжах параллельно с моно-убихитинилированием PCNA происходит его поли-убихитинилирование по тому же лизину-164, зависисимое от продуктов генов RAD5, MMS2 и UBC13, которое направляет репарацию по второму механизму (смена матрицы, TMS). В клетках человека ПРР по механизму смены матрицы зависит от гомолога дрожжевого гена MMS2, однако поли-убихитинилирования PCNA пока не обнаружено. Необходимо отметить, что ПРР путем смены матрицы (TMS) является точной, а при смене полимеразы (TLS) специальные ДНК-полимеразы могут делать ошибки. Эти ошибки и являются, по-видимому, основным источником индуцированных точковых мутаций в геноме человека. Необходимо, однако, иметь ввиду, что только 5% генома кодирует белки и требует точного воспроизведения во время репликации, поэтому мутации в 95% генома (в некодирующей ДНК), особенно в дифференцированных соматических клетках, редко приводят к заметным фенотипическим эффектам. Что касается половых и стволовых клеток, то в них повреждения ДНК должны легче индуцировать апоптоз, а не репарацию.

X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018


СИСТЕМА РЕПАРАЦИИ ДНК КАК ИСТОЧНИК МУТАТОРНЫХ ГЕНОВ

Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

Процесс, позволяющий живым организмам восстанавливать повреждения, возникающие в ДНК, называют репарацией. Все репарационные механизмы основаны на том, что ДНК - двухцепочечная молекула, т.е. в клетке есть 2 копии генетической информации. Если нуклеотидная последовательность одной из двух цепей оказывается повреждённой (изменённой), информацию можно восстановить, так как вторая (комплементарная) цепь сохранена.

Процесс репарации происходит в несколько этапов. На первом этапе выявляется нарушение комплементарности цепей ДНК. В ходе второго этапа некомплементарный нуклеотид или только основание устраняется, на третьем и четвёртом этапах идёт восстановление целостности цепи по принципу комплементарности. Однако в зависимости от типа повреждения количество этапов и ферментов, участвующих в его устранении, может быть разным.

Очень редко происходят повреждения, затрагивающие обе цепи ДНК, т.е. нарушения структуры нуклеотидов комплементарной пары. Такие повреждения в половых клетках не репарируются, так как для осуществления сложной репарации с участием гомологичной рекомбинации требуется наличие диплоидного набора хромосом.

Нарушения комплементарности цепей ДНК могут происходить спонтанно, т.е. без участия каких-либо повреждающих факторов, например в результате ошибок репликации.

Цель данной работы является изучение системы репарации ДНК как источника мутаторных генов.

Ошибки репарации

Точность репликации ДНК очень велика, но примерно один раз на 105-106 нуклеотидных остатков происходят ошибки спаривания, и тогда вместо пары нуклеотидов А-Т, G-С в дочернюю цепь ДНК оказываются включёнными нук-леотиды, некомплементарные нуклеотидам матричной цепи. Однако ДНК-полимеразы δ, ε способны после присоединения очередного нуклеотида в растущую цепь ДНК делать шаг назад (в направлении от 3'- к 5'- концу) и вырезать последний нуклеотид, если он некомплементарен нуклеотиду в матричной цепи ДНК. Этот процесс исправления ошибок спаривания (или коррекция) иногда не срабатывает, и тогда в ДНК по окончании репликации остаются некомплементарные пары, тем более, что ДНК-полимераза а лишена корректирующего механизма и "ошибается" чаще, чем другие полимеразы.

При неправильном спаривании в первичной структуре дочерней цепи ДНК необычные основания не появляются, нарушена только ком-плементарность. Система репарации некомплементарных пар должна происходить только на дочерней цепи и производить замену некомплементарных оснований только в ней. Ферменты, участвующие в удалении неправильной пары нуклеотидов, распознают матричную цепь по наличию метилированных остатков аденина в последовательностях -GATC-. Пока основания нуклеотидных остатков в дочерней цепи неметилированы, ферменты должны успеть выявить ошибку репликации и устранить её.

Распознавание и удаление (первый этап) некомплементарного нуклеотида происходят при участии специальных белков mut S, mut L, mut H. Каждый из белков выполняет свою специфическую функцию. Mut S находит неправильную пару и связывается с этим фрагментом. Mut Н присоединяется к метилированному (по аденину) участку -GATC-, расположенному вблизи некомплементарной пары. Связующим между mut S и mut Н служит белок mut L, его присоединение завершает образование активного фермента. Формирование комплекса mut S, mut L, mut Н на участке, содержащем ошибку, способствует проявлению у белка mut Н эндонуклеазной активности. Ферментативный комплекс гидролизует фосфоэфирную связь в неметилированной цепи (рис. 4-21).

К свободным концам цепи присоединяется экзонуклеаза (второй этап). Отщепляя по одному нуклеотиду в направлении от 3'- к 5'- концу дочерней цепи, она устраняет участок, содержащий некомплементарную пару. Брешь застраивает ДНК-полимераза β (третий этап), соединение основного и вновь синтезированного участков цепи катализирует фермент ДНК-лигаза (четвёртый этап). Для успешного функционирования экзонуклеазы, ДНК-полимеразы р и ДНК-лигазы необходимо участие в репарации хеликазы и SSB-белков.

Рис. Система репарации ошибок репликации. 1 - белок mut S "узнаёт" некомплементарную пару и присоединяется в этом участке ДНК; 2 - белки mut H взаимодействуют с метилированной по аденину последовательностью материнской цепи -GATC-; завершается формирование ферментативного комплекса после присоединения mut L; 3 - комплекс определяет вновь синтезированную цепь по отсутствию метилированного остатка аденина в последовательности -GATC- и разрывает её; 4 - экзонуклеаза удаляет фрагмент дочерней цепи ДНК, содержащий ошибку; 5 - ДНК-полимераза β по принципу комп-лементарности застраивает брешь; 6 - ДНК-лигаза З'-конец вновь синтезированного фрагмента соединяет с основной цепью и завершает репарацию ошибки.

Нарушение системы репарации у человека является причиной:

Онкозаболеваний (80-90 % всех раковых заболеваний)

Аутоиммунных заболеваний (болезнь Альцгеймера, СКВ, ревматоидный артрит)

Причиной многих наследственных болезней человека выступает нарушение отдельных этапов процесса репарации.

Пигментная ксеродерма

У больных в системе репарации снижена активность ферментов, ответственных за удаление неправильных оснований, "застройку" бреши и другие функции. Дефект репарационной системы проявляется в сверхчувствительности к УФ-свету, что приводит к появлению красных пятен на коже, переходящих в незаживающие коросты и нередко в рак кожи.

Трихотиодистрофия

Заболевание связано с повышенной фоточувствительностью ДНК, вызванной снижением активности фермента, участвующего в удалении димеров тимина. Симптомы заболевания: ломкость волос вследствие нехватки серы в белках волос и их луковиц; часто умственная и физическая отсталость; аномалии кожи и зубов.

Синдром Блума

Мутации в гене BLM, который является составной ДНК геликаз (хеликазы), вызывают возникновение синдрома Блума. ДНК геликазы (хеликазы) - это ферменты, которые раскручивают двухцепную спираль ДНК.

Основные симптомы — лицевая эритема и карликовость. Как правило, эритема появляется в младенческом возрасте в виде бляшек, которые напоминают пятна красной волчанки. В основном локализуются в форме бабочки на крыльях носа и щеках, иногда могут появиться в области век, лба, раковин ушей, с внутренней стороны кистей.

Анемия Фанкони

Был установлен дефект в системе репарации ДНК в фибробластах больных анемией Фанкони. Скорее всего, именно этим обусловлено легкое повреждение хромосом при этой болезни под влиянием ультрафиолетового облучения, малых доз цитостатических препаратов. Симптомы анемии Фанкони начинают проявляться в возрасте 4-10 лет. Ранние признаки патологии: спонтанные кровотечения; кровоподтеки на коже; бледность покровов и слизистых оболочек; вялость, слабость реакций на раздражители.

Кроме того, у ребенка возникает склонность к инфекционным заболеваниям. Печень и селезенка при этом не увеличиваются. Может развиться лимфаденопатия.

Дефекты системы репарации ДНК как причина рака

Парадокс процесса канцерогенеза в том, что скорость мутаций в нормальных клетках слишком низка, чтобы вызвать злокачественную трансформацию. Первым доказательством существования так называемого нестабильного фенотипа стала нестабильность генома некоторых опухолей толстой кишки. Если клетка не может устранять повреждения, происходящие в процессе нормального деления, мутации накапливаются, достигая критического уровня в генах, осуществляющих контроль над ростом клетки, и развивается злокачественная опухоль.

Таким образом, нарушение системы репарации ДНК ведет к злокачественной трансформации. Многочисленные исследования выявили эти нарушения в опухолях, обладающих микросателлитной недостаточностью. Ключевые гены, ответственные за метаболизм клетки, обычно не имеют микросателлитных повторов, которые были бы наиболее подвержены повреждениям. Тем не менее в клетках с дефектами системы репарации частота мутаций в неповторяющихся последовательностях повышена в 100 — 10 000 раз по сравнению с клетками, в которых эта система функционирует нормально.

Хотя микросателлитные последовательности в функциональных генах обычно отсутствуют, мононуклеотидные повторы в некоторых основных генах могут приводить к их инактивации. К таким генам относятся, например, TGF-BR2H(A10), bMSH3 (А8), bMSH6/GTBP (С8), IGF2R (G8) и ВАХ (G8). Парадоксально, но нестабильность числа хромосом часто наблюдается в опухолях без нарушений системы репарации, а опухоли с такими нарушениями часто имеют стабильное число хромосом. Наследственные мутации системы репарации нередко выявляют у лиц, страдающих семейными формами злокачественных опухолей. К таким заболеваниями относятся некоторые опухоли толстой кишки (ННПКРР), рак эндометрия (РЭ) и синдром Линча типа II.

Также с нарушениями системы репарации связано развитие синдромов Торре и Тюрко. ННПКРР составляет около 5 % всех случаев рака толстой кишки; его диагностируют на основании следующих критериев: 1) должно быть по меньшей мере три родственника, из них двое первой степени родства, имевших рак толстой кишки; 2) опухоли толстой кишки по крайней мере в двух поколениях; 3) хотя бы у одного из родственников рак толстой кишки был выявлен в возрасте моложе 50 лет.

У 70 % больных ННПКРР выявляют мутации в генах клеточной системы репарации ДНК — bMLH1 (49 %), bMLH2 (45 %) и bPMS2 (6 %). Нарушения системы репарации обнаруживают в 25 % случаев рака эндометрия (РЭ), примерно 1/4 из них наследственные, остальные — результат инактивации гена MLH1, вызванной гиперметилированием промоторного региона.

Заключение

В основе порядка в хромосоме и в клетке лежат механизмы репарации. С учетом тысяч повреждений, от которых ежедневно страдает геном, и с нарушений при репликации генома, клетке жизненно важно иметь эффективные механизмы репарации. Без таких механизмов геном сможет выполнять свои функции максимум несколько часов, пока основные гены не будут инактивированы повреждениями ДНК. Клеточные линии будут накапливать ошибки репликации с такой скоростью, что их геномы станут полностью нефункциональны уже через считанные деления.

Список литературы:

И. М. Спивак , Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие. - 2017

Биохимия : учебник / под ред. Е. С. Северина. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 784 с.

Долгова Е. В. Репарация межпозвоночных сшивок молекулы ДНК / Е. В. Долгова, А. С. Лихачева, К. Е. Орищенко, Е. А. Алямкина, С. С. Богачев, М. А. Шурдов // Вестник ВОГиС. - 2010. - Том 14, № 2

Петрусева И. О. Молекулярные механизмы действия системы общегеномной эксцизионной репарации нуклеотидов / И. О. Петрусева, А. Н. Евдокимов, О. И. Лаврик // Acta Naturae (русскоязычная версия). - 2014. - Вып. № 1 (20), том 6. - С. 24-32.

Коничев С. А. Молекулярная биология / С. А. Коничев, Г. А. Севастьянова. - М. : Академия, 2005. - 400 с.

Уже на ранних стадиях эволюции ДНК заменила РНК в качестве носителя генетической информации. Но несмотря на свои «преимущества», ДНК постоянно подвергается химическим изменениям, как спонтанным, так и индуцируемым мутагенами и даже клеточными метаболитами. Еще одна обычная причина повреждений ДНК - радиация и ультрафиолетовое облучение. Большинство происходящих с ДНК изменений недопустимы: они либо приводят к вредным мутациям, либо блокирую репликацию ДНК и вызывают гибель клеток. Поэтому все клетки имеют специальные системы исправления повреждений, репарации ДНК. Нарушение этих систем губительно. Принципы репарации ДНК у различных организмов сходны, поэтому эти принципы рассматриваются на примере E. coli, у которой они хорошо изучены.Цель

Рассмотреть репарации повреждений ДНК

ПОНЯТИЕ РЕПАРАЦИИРепарация — особая функция клеток, заключающаяся в способности исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённой при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физическими или химическими агентами. Осуществляется специальными ферментными системами клетки.

Системы репарации существуют не только у микроорганизмов, но также в клетках животных и человека, у которых они изучаются на культурах тканей. Известен наследственный недуг человека — пигментная ксеродерма, при котором нарушена репарация. Источники и типы повреждения ДНК *УФ излучения *Химические вещества, радиация *Ошибки репликации, ДНК * Апуринизация — отщепление азотистых оснований от сахарофосфатного остова * Дезаминирование — отщепление аминогруппы от азотистого основания

РЕПАРАЦИЯ НЕОБЪЕМНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК

Прямое исправление поврежденийЧастая причина точечных мутаций у человека: это спонтанное добавление метильной группы — один из типов алкилирования. Такие модификации исправляются без разрушения цепи ДНК ферментами — гликозилазами. Фермент О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераз (MGMT) защищает клетку от токсических эффектов, производимых алкилирующими агентами, переводя для этого метильную группу из О-6-метилгуанин-ДНК в цистеиновый остаток в MGMT.

Эксцизионная репарация оснований (ЭРО) Основным механизмом удаления необъемных повреждений ДНК является ЭРО. Существует два основных пути ЭРО: «короткоза- платочный» (short-path) и «длиннозаплаточный» (long-path). В ходе «короткозаплаточного» пути про- исходит замещение только одного поврежденного ну- клеотида, тогда как при «длиннозаплаточном» уда- ляются 2-8 нуклеотидов .

ЭРО в коррекции нуклеотидов, спаренных с поврежденными основаниями ДНК Интересны механизмы предотвращения возникнове- ния мутаций и коррекции повреждений с помощью «мисматч»-специфичных ДНК-гликозилаз, уча- ствующих в удалении неповрежденных азотистых оснований, спаренных с поврежденными нуклеоти- дами.

Инцизионная репарация нуклеотидов (ИРН) Альтернативным путем удаления повреждений с участием АП-эндонуклеаз является инцизионная репарация нуклеотидов (ИРН, Nucleotide Incision Repair, NIR). В этом процессе удаление поврежденного нуклеотида происходит без участия ДНК-гликозилаз и без образования по- тенциально мутагенных промежуточных продук- тов - АП-сайтов.

Прямое восстановление структуры ДНК (ПВ) В удалении ряда «необъемных» повреждений так- же участвуют ферменты, способные непосредствен- но восстанавливать структуру азотистых оснований . К таким ферментам относятся диоксигеназы (окислительные деметилазы) семейства AlkB и алкил- трансферазы, участвующие в репарации алкилиро- ванных азотистых оснований ДНК

РЕПЛИКАЦИЯ ПОВРЕЖДЕННЫХ УЧАСТКОВ ДНК СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫМИ ДНК-ПОЛИМЕРАЗАМИ

Не все повреждения могут быть быстро удалены из генома ферментами репарации. Большое количество нерепарированных повреждений нарушают работу высокоточных репликативных ДНКП Pol α, Pol δ и Pol, блокируют репликацию, что приводит к остановке клеточного цикла, хромосомной нестабильности или гибели клеток. Важнейшим механизмом преодоления репликатив ного блока служит вовлечение в репликацию поврежденной ДНК спецДНКП, которые относятся к разным семействам и специализируются на репликации разных повреждений.

Основная функция Pol η в клетке состоит в эффективной и точной репликации через фотопродукты (тимин-тиминовые циклобутановые димеры) и защите клеток от ультрафиолетового из- лучения. Тем не менее, Pol η эффективно включает нуклеотиды напротив некоторых других «необъемных» повреждений.

Pol ζ состоит из четырех субъединиц: каталитической Rev3 и регуляторных Rev7, p50 и p66. Препараты Pol ζ из S. cerevisiae c высокой эффективностью про- должают синтез ДНК от некомплементарных концов праймеров и праймеров, спаренных с повреждениями.

В 2013 году была открыта спецДНКП нового типа - праймаза-полимераза PrimPol, которая обладает одновременно ДНК-полимеразной и праймазной активностями, но отличается от Pol α-праймазы способностью к инициации синтеза ДНК с использованием dNMP. PrimPol не относится ни к одному из семейств известных ДНКП эукариот, а принадлежит AEP-семейству праймаз. Нокаут гена PRIMPOL вызывает чувствительность клеток к повреждениям ДНК и замедляет скорость движения репликативной вилки в отсутствие экзогенных повреждающих фак- торов.

Источники

Алиханян С.И и др. Общая генетика. М., 1985

Генетика. Под ред. Иванова В.И.М.,2006

Скосарева Л.В., Лебедева Н.А., Лаврик О.И., Речкунова Н.И. // Молекуляр. биология. 2013. Т. 47. № 5. С. 731-742.

Косова A.A., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. // Молекуляр. биология. 2015. Т. 49. № 1. C. 67-74.

Актуальность: Данная тема является актуальной по причине того, что репарация является свойством живой клетки бороться с различными повреждениями ДНК, чтобы сохранить целостность ДНК. Данная тема затрагивает одну из важных задач современной медицины.

Цель: понять, как нарушается целостность генетического материала клетки и какие существуют восстановительные механизмы ДНК и как они работают.

1. Изучить, что такое репарация.

2. Разобрать, как происходит повреждение ДНК и по каким причинам

3. Выяснить, как работают репарационные механизмы ДНК

3. «Световое восстановление»………………………………………. …. 5

4. «Темновое восстановление»………………………………………. …….6

6. Классификация репарации………………………………………………..8

8. Интересные факты о репарации………………………………….………11

Репарация (от лат. reparatio — восстановление) — особая функция клеток, заключающаяся в способности исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённых при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физических или химических реагентов. Осуществляется специальными ферментными системами клетки. Ряд наследственных болезней (напр., пигментная ксеродерма) связан с нарушениями систем репарации. В окружающем мире существует множество факторов, способных вызвать необратимые изменения в живом организме. Чтобы сохранить свою целостность, избежать патологических и несовместимых с жизнью мутаций, должна существовать система самостоятельного восстановления.

Нарушения в ДНК

Молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты может быть разорвана как в ходе биосинтеза, так и под влиянием вредных веществ.

Источники повреждения ДНК:

- Ошибки репликации ДНК

- Апуринизация — отщепление азотистых оснований от сахарофосфатного остова

- Дезаминирование — отщепление аминогруппы от азотистого основания

К негативным факторам, в частности, относят температуру или физические силы различного происхождения. Если разрушение произошло, клетка запускает процесс репарации. Так начинается восстановление исходной структуры молекулы ДНК. За репарацию отвечают особые ферментные комплексы, присутствующие внутри клеток. С невозможностью отдельных клеток осуществлять восстановление связаны некоторые заболевания.

Впоследствии исследования Кельнера получили свое логическое продолжение в работах американских биологов Сетлоу, Руперта и некоторых других. Благодаря труду этой группы ученых было достоверно установлено, что фотореактивация является процессом, который запускается благодаря особому веществу - ферменту, катализирующему расщепление димеров тимина. Именно они, как выяснилось, образовывались в ходе экспериментов под воздействием ультрафиолета. При этом яркий видимый свет запускал действие фермента, который способствовал расщеплению димеров и восстановлению первоначального состояния поврежденных тканей. В данном случае речь идет о световой разновидности восстановления ДНК. Определим это более четко. Можно сказать, что световая репарация - это восстановление под воздействием света первоначальной структуры ДНК после повреждений. Однако данный процесс не является единственным, способствующим устранению повреждений.

Спустя некоторое время после открытия световой была обнаружена темновая репарация. Это явление происходит без какого-либо воздействия световых лучей видимого спектра. Данная способность к восстановлению обнаружилась во время исследования чувствительности некоторых бактерий к ультрафиолетовым лучам и ионизирующему излучению. Темновая репарация ДНК - это способность клеток убирать любые патогенные изменения дезоксирибонуклеиновой кислоты. Но следует сказать, что это уже не фотохимический процесс, в отличие от светового восстановления.

Механизм "темнового" устранения повреждений Наблюдения за бактериями показали, что спустя некоторое время после того, как одноклеточный организм получил порцию ультрафиолета, вследствие чего некоторые участки ДНК оказались поврежденными, клетка регулирует свои внутренние процессы определенным образом. В результате измененный кусочек ДНК просто отрезается от общей цепочки. Получившиеся же промежутки заново заполняются необходимым материалом из аминокислот. Иными словами, осуществляется ресинтез участков ДНК. Открытие учеными такого явления, как темновая репарация тканей, - это еще один шаг в изучении удивительных защитных способностей организма животного и человека.

Эксперименты, позволившие выявить механизмы восстановления и само существование этой способности, проводились с помощью одноклеточных организмов. Но процессы репарации присущи живым клеткам животных и человека. Некоторые люди страдают пигментной ксеродермой. Это заболевание вызвано отсутствием способности клеток ресинтезировать поврежденную ДНК. Ксеродерма передается по наследству. Из чего же состоит репарационная система? Четыре фермента, на которых держится процесс репарации - это ДНК-хеликаза, -экзонуклеаза, -полимераза и -лигаза. Первый из этих соединений способен распознавать повреждения в цепи молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты. Он не только распознает, но и обрезает цепь в нужном месте, чтобы удалить измененный отрезок молекулы. Само устранение осуществляется с помощью ДНК-экзонуклеазы. Далее происходит синтез нового участка молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты из аминокислот с целью полностью заменить поврежденный отрезок. Ну и финальный аккорд этой сложнейшей биологической процедуры совершается с помощью фермента ДНК-лигазы. Он отвечает за прикрепление синтезированного участка к поврежденной молекуле. После того как все четыре фермента сделали свою работу, молекула ДНК полностью обновлена и все повреждения остаются в прошлом. Вот так слаженно работают механизмы внутри живой клетки.

На данный момент ученые выделяют следующие разновидности систем репарации. Они активируются в зависимости от разных факторов. К ним относятся: реактивация, рекомбинационное восстановление, репарация гетеродуплексов, эксцизионная репарация, воссоединение негомологичных концов молекул ДНК. Все одноклеточные организмы обладают как минимум тремя ферментными системами. Каждая из них обладает способностью осуществлять процесс восстановления. К этим системам относят: прямую, эксцизионную и пострепликативную. Этими тремя видами восстановления ДНК обладают прокариоты. Что касается эукариот, то в их распоряжении находятся дополнительные механизмы, которые называются Miss-mathe и Sos-репарация. Биология подробно изучила все эти виды самовосстановления генетического материала клеток.

1. Прямая репарация — наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. Так действует, например, O6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза, которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина.

2. Эксцизионная репарация (англ. excision — вырезание) включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы. Эксцизионная репарация (excision repair): процесс с участием ферментативной системы, которая удаляет короткую однонитевую последовательность двунитевой ДНК , содержащей ошибочно спаренные или поврежденные основания , и замещает их путем синтеза последовательности, комплементарной оставшейся нити. Эксцизионная репарация является наиболее распространенным способом репарации модифицированных оснований ДНК. Этот тип репарации базируется на распознавании модифицированного основания различными гликозилазами, расщепляющими N-гликозидную связь этого основания с сахарофосфатным остовом молекулы ДНК. При этом существуют гликозилазы, специфически распознающие присутствие в ДНК определенных модифицированных оснований (оксиметилурацила, гипоксантина, 5-метилурацила, 3-метиладенина, 7-метилгуанина и т.д.). Для многих гликозилаз к настоящему времени описан полиморфизм, связанный с заменой одного из нуклеотидов в кодирующей последовательности гена. Для ряда изоформ этих ферментов была установлена ассоциация с повышенным риском возникновения онкологических заболеваний.

3. Пострепликативная репарация Tип репарации, имеющей место в тех случаях, когда процесс эксцизионной репарации недостаточен для полного исправления повреждения: после репликации с образованием ДНК, содержащей поврежденные участки, образуются одноцепочечные бреши, заполняемые в процессе гомологичной рекомбинации при помощи белка. Пострепликативная репарация была открыта в клетках E.Coli, не способных выщеплять тиминовые димеры. Это единственный тип репарации, не имеющий этапа узнавания повреждения.

Интересные факты о репарации

1. Полагают, что от 80 % до 90 % всех раковых заболеваний связаны с отсутствием репарации ДНК[4].

2. Повреждение ДНК под воздействием факторов окружающей среды, а также нормальных метаболических процессов, происходящих в клетке, происходит с частотой от нескольких сотен до 1000 случаев в каждой клетке, каждый час.

3. По сути ошибки в репарации происходят так же часто как и в репликации, а при некоторых условиях даже чаще.

4. В половых клетках сложная репарация, связанная с гомологичной рекомбинацией не происходит из-за гаплоидности генома этих клеток.

Репарация - это обязательное условие нормального функционирования организма. Подвергаясь ежедневно и ежечасно угрозам повреждений и мутаций ДНК, многоклеточная структура приспосабливается и выживает. Это происходит в том числе и за счет налаженной системы репарации. Отсутствие нормальной восстановительной способности вызывает болезни, мутации и другие отклонения. К ним относятся различные патологии развития, онкология и даже само старение. Наследственные болезни вследствие нарушений репарации могут приводить к тяжелым злокачественным опухолям и другим аномалиям организма. Сейчас определены некоторые заболевания, вызываемые именно сбоями систем репарации ДНК. Это такие, например, патологии, как синдром Кокейна, ксеродерма, неполипозный рак толстой кишки, трихотиодистрофия и некоторые раковые опухоли.

1. Кирпичев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология М. AKADEMA. 2005г.

2. С.Коничев, Г.А.Севастьянова Молекулярная биология. — Москва: Академия, 2003г.

3. С.Г. Инге-Вечтомов. Генетика с основами селекции. — Москва: Высшая школа, 1989г.

Читайте также: