Рост бактерий в культуре. Фазы роста бактерий. Лаг фаза роста. Экспоненциальная фаза роста бактерий. Стационарная фаза роста.

Добавил пользователь Skiper
Обновлено: 14.12.2024

Обмен веществ в микробной клетке сопровождается биосинтезом белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и других соединений. В результате этих процессов увеличиваются размеры и биомасса клетки, что определяется как рост. Увеличение численности клеток в процессе их деления называют размножением. Интенсивность роста определяется путем деления биомассы на численность клеток в единице объема через определенные промежутки времени.

Бактерии, размножающиеся в замкнутом объеме питательной среды, представляют собой микробную популяцию. В лабораторных условиях и на производстве микробные популяции культивируют периодическим или непрерывным методом.

8.1. ПЕРИОДИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ. КРИВАЯ РОСТА

Периодическим культивированием называют размножение микроорганизмов в замкнутом объеме питательной среды. Если в процессе культивирования в среду не добавлять питательные вещества и не выводить продукты жизнедеятельности, то рост микроорганизмов будет продолжаться лишь до тех пор, пока содержание какого-либо компонента не будет исчерпано. Рост микроорганизмов в такой замкнутой системе подчиняется определенным закономерностям и описывается так называемой «кривой роста», выражающей зависимость логарифма числа клеток от времени культивирования (рис. 23).

Рис. 23. Кривая роста микробной популяции в периодических условиях

На типичной кривой роста можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности:

✵ I — лаг-фаза (или фаза задержки роста);

✵ II — экспоненциальная (или логарифмическая);

✵ IV — фаза отмирания.

Лаг-фаза охватывает промежуток времени от момента внесения инокулята (посевного материала) до начала размножения микроорганизмов. Во время лаг-фазы число клеток или совсем не увеличивается, или нарастает очень незначительно. Задержка роста в начале лаг-фазы объясняется адаптацией к новым условиям. Тем не менее этот период характеризуется повышенной метаболической активностью: в клетках возрастает содержание РНК и общего белка, синтезируется ряд ферментов. Наблюдается заметное увеличение размеров клеток — они в 3— 5 раз больше обычных. Длительность лаг-фазы зависит от вида микроорганизма, состава питательной среды, количества и возраста вносимого инокулята. Лаг-фаза сокращается при использовании полноценной среды и молодого инокулята.

Иногда в периодической культуре может наблюдаться наличие двух лаг-фаз — диауксия. Это явление двухфазного роста в 1942 г. впервые описал французский ученый Жак Моно на примере поочередного использования двух разных углеводов кишечной палочкой. При культивировании кишечной палочки на среде, содержащей глюкозу и сорбит, клетки сначала потребляют глюкозу, тогда как синтез ферментов, необходимых для расщепления сорбита, подавляется. Эти ферменты синтезируются лишь после того, как вся глюкоза будет израсходована.

Экспоненциальная (или логарифмическая) фаза характеризуется максимальной и практически постоянной скоростью роста клеток. Число клеток в этой фазе возрастает в геометрической прогрессии. В этой фазе рост культуры сбалансирован: питательные вещества субстрата и продукты жизнедеятельности не лимитируют размножение микроорганизмов.

В экспоненциальной фазе роста, длительность которой для многих культур микроорганизмов на жидких средах невелика, питательные вещества быстро потребляются, накапливаются вредные продукты обмена, снижается интенсивность синтеза внутриклеточных компонентов. Все это приводит к замедлению роста культуры и переходу ее в следующую фазу — стационарную.

Стационарная фаза соответствует периоду, когда число жизнеспособных клеток, достигнув максимума, перестает увеличиваться. Многие клетки еще продолжают делиться, но количество вновь образующихся клеток равно количеству погибающих. При этом общая численность микробной популяции не изменяется. К концу стационарной фазы условия роста продолжают ухудшаться и культура переходит в завершающую фазу.

Фаза отмирания характеризуется массовой гибелью микробных клеток. Скорость гибели клеток намного опережает скорость их деления. В сложившихся неблагоприятных условиях выживают лишь единичные особи, появляются так называемые инволюционные формы, не дающие потомства.

Биологическая библиотека - материалы для студентов, учителей, учеников и их родителей.

Наш сайт не претендует на авторство размещенных материалов. Мы только конвертируем в удобный формат материалы, которые находятся в открытом доступе и присланные нашими посетителями.

Если вы являетесь обладателем авторского права на любой размещенный у нас материал и намерены удалить его или получить ссылки на место коммерческого размещения материалов, обратитесь для согласования к администратору сайта.

Разрешается копировать материалы с обязательной гипертекстовой ссылкой на сайт, будьте благодарными мы затратили много усилий чтобы привести информацию в удобный вид.

Закономерности роста популяций микроорганизмов

Закономерности роста популяций микроорганизмов - общие закономерности роста и размножения бактериальной популяции графически описываются в виде кривой, отражающей зависимость логарифма числа живых клеток от времени. Такая кривая имеет S-образную форму и позволяет различать несколько фаз, сменяющих друг друга [1] .

Содержание:

S-образная кривая закономерности роста популяции микроорганизмов характерна для периодической культуры. В лабораторных и промышленных условиях используют два способа культивирования микроорганизмов: периодический (статический) и непрерывный (проточный). В первом случае получают периодическую культуру, а во втором - непрерывную культуру [2] .

Сбалансированный рост бактерий

Сбалансированный рост бактерий наблюдается в среде, к которой данные микроорганизмы полностью адаптированы. В период сбалансированного роста удвоение биомассы происходит с одновременным удвоением всех прочих параметров популяции: количества белка, ДНК, РНК, внутриклеточной воды [2] .

Культуры бактерий, растущие сбалансировано, сохраняют постоянный химический состав. Кроме того, в такой культуре скорость прироста вещества клеток в любой выбранный момент пропорциональна числу и массе имеющихся в это время бактерий. Коэффициент этой пропорциональности называют удельной скоростью роста (µ). Данная величина вычисляется по установленной формуле и изменяется в зависимости от условий выращивания культуры [2] .

Динамика развития бактериальной популяции в периодической культуре

I- исходная стационарная фаза;

II- лаг-фаза - период задержки размножения.

2. Экспоненциальная фаза:

III- экспоненциальная (логарифмическая фаза).

3. Стационарная фаза:

IV- фаза отрицательного ускорения;

V- максимальная стационарная фаза.

4. Фаза отмирания:

VI - фаза ускорения гибели;

VII- фаза логарифмической гибели;

VIII- фаза уменьшения скорости отмирания [3] .

Фазы развития бактерий в периодической культуре

Зависимость концентрации жизнеспособных клеток бактерий в периодической культуре от длительности инкубирования описывается кривой S-образной формы, на которой различают несколько фаз роста, сменяющих друг друга в четкой последовательности:

1. Начальная фаза (лаг-фаза, фаза задержанного роста) - охватывает промежуток времени между инокуляцией бактерий и достижением ими максимальной скорости деления. В клетках бактерий в этот период идут в основном процессы, связанные с приспособлением их к условиям культивирования (составу среды, температуре, рН и т. п.) [2] [3] . Часто данную фазу делят на две:

исходную стационарную фазу (I) - составляющую период от момента внесения бактерий в питательную среду до начала их роста;
лаг-фазу (II) - период задержки размножения, характеризующийся увеличением частоты клеточного деления и нарастанием числа клеток [2][3] .

2. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза (III) - период времени, характеризующийся максимальной постоянной скоростью размножения бактерий и увеличением их числа в геометрической прогрессии. В течение экспоненциальной фазы все клетки бактериальной популяции имеют одинаковый размер, содержат максимальное количество РНК. Количество белка в них постоянно и максимально из возможного. Бактериальные клетки в данную фазу наиболее жизнеспособны и обладают высокой биохимической активностью [2] .

3. Стационарная фаза - наблюдается в период, когда число жизнеспособных клеток достигает максимума и не увеличивается, поскольку скорость размножения бактерий равна скорости их отмирания. Поскольку скорость роста определяется концентрацией субстрата, то скорость роста начинает снижаться ещё до его полного использования. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно [2] . Стационарную фазу часто подразделяют на:

фазу отрицательного ускорения (IV) - характеризуется уменьшением скорости размножения бактерий, удлинением периода их генерации;
максимальную стационарную фазу (V) - отражает динамическое равновесие между покоящимися, делящимися и отмирающими клетками [3] .

4. Фаза отмирания - наблюдается экспоненциальное снижение числа живых клеток.Продолжительность данной фазы изменяется в зависимости от условий среды и физиологических особенностей микроорганизма [2] .Фаза отмирания подразделяется на:

фазу ускорения гибели (VI) - период уменьшения количества бактериальных клеток, в основном, за счёт аутолитических процессов (процессов саморастворения);
фазу логарифмической гибели (VII) - отражает максимальную постоянную скорость отмирания бактерий с последующим из аутолизом (саморастворением);
фаза уменьшения скорости отмирания (VIII) - переход оставшихся в живых особей в состояние покоя [3] .

Особенности развития бактерий в непрерывной культуре

Непрерывные бактериальные культуры выращивают в условиях непрерывного (проточного) культивирования в специальных сосудах. В такой сосуд, содержащий популяцию бактерий, подается свежая питательная среда. Одновременно из него удаляется часть среды с клетками микроорганизмов и продуктами его метаболизма. Такая система с постоянной концентрацией питательных веществ обеспечивает бактериям длительный период пребывания в любой фазе роста, в частности экспоненциальной фазе роста [2] .

Благодаря постоянному сохранению условий существования бактерий, обеспечивается максимальный выход биомассы (при получении вакцин) или биологически значимых соединений (витаминов, антибиотиков, ферментов, аминокислот) [3] .

Стационарная фаза

Стационарная фаза - третья фаза графической кривой, описывающей закономерности роста популяции микроорганизмов. Это период в котором число жизнеспособных клеток достигает своего максимума и не увеличивается, поскольку скорость размножения бактерий уравнивается со скоростью их отмирания [2] .

Кривая, описывающая закономерности роста популяции микроорганизмов, имеет S-образную форму. Данную кривую делят на четыре основные фазы: лаг-фаза, экспоненциальная фаза, стационарная фаза, фаза отмирания. В связи с постепенным переходом популяции из одной фазы к другой часто возникает потребность дробления основных фаз. В частности стационарную фазу делят на фазу отрицательного ускорения и максимальную стационарную фазу [2] .

Стационарная фаза на кривой роста бактериальной популяции

3 - Стационарная фаза [2]

Процессы стационарной фазы

Скорость роста бактерий в периодической культуре (замкнутой популяция бактериальных клеток в ограниченном пространстве) в основном определяется концентрацией субстрата. Поэтому ещё до его полного использования наблюдается снижении скорости роста. Переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно [2] .

Скорость роста популяции может снижаться и по другим причинам: из-за высокой плотности популяции, при низком парциальном давлении кислорода, из-за накопления токсичных продуктов обмена. Все эти факторы также обусловливают переход к стационарной фазе [2] .

Переход в стационарную фазу включает период несбалансированного роста, когда скорость синтеза компонентов клеток различна. Соответственно будет различным и содержание отдельных химических веществ в клетках на разных стадиях. Однако химический состав клеток все же будет зависеть от фактора лимитирующего рост [2] .

Свойства бактериальных клеток в период стационарной фазы

Бактериальные клетки в стационарной фазе отличаются от клеток экспоненциальной фазы. Они меньше по размеру, содержат гораздо меньше РНК, более устойчивы к различного рода воздействиям (химическим и физическим) [2] .

В данный период в клетках бактерий или в среде культивирования часто идет накопление продуктов вторичного метаболизма (антибиотиков, пигментов, бактериоционов). Продолжительность этой фазы может занимать от нескольких часов до нескольких дней в зависимости от вида микроорганизма [2] .

Поведение клеток в бактериальной популяции регулирует апоптоз. Суть этого явления сводится к тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция делится на две субпопуляции. Одна из них гибнет и подвергается автолизу (саморастворению). Другая - использует продукты автолиза в качестве субстрата и продолжает размножаться. Апоптоз основан на механизме генетического контроля особыми генами, специфическими для каждого вида бактерий, вызывающими гибель и автолиз части популяции [2] .

Как указано выше, стационарная фаза охватывает период, в котором число жизнеспособных бактериальных клеток, достигнув максимального количества для данной замкнутой системы, больше не увеличивается [1] .

Для более подробного описания закономерности процессов, происходящих в периодической культуре (замкнутой популяция бактериальных клеток в ограниченном пространстве), стационарную фазу делят на две части:

IV - фаза отрицательного ускорения;
V - максимальная стационарная фаза [3] .

Фаза отрицательного ускорения - период уменьшения скорости размножения бактерий и удлинения периода их генерации. Иными словами, скорость размножения и число делящихся особей уменьшается, а число погибших - увеличивается [1] [3] .

Максимальная стационарная фаза - отражает динамическое равновесие между покоящимися, делящимися и отмирающими клетками [1] .

Экспоненциальная фаза

Экспоненциальная фаза - вторая фаза графической кривой, описывающей закономерности роста популяции микроорганизмов. Это период времени в течение которого скорость размножения является максимальной, а численность бактерий увеличивается в геометрической прогрессии [2] .

Кривая, описывающая закономерности роста популяции микроорганизмов, имеет S-образную форму. Данную кривую делят на четыре основные фазы: лаг-фаза,экспоненциальная фаз, стационарная фаза, фаза отмирания [1] [3] .

Экспоненциальная фаза роста

Кривая роста бактериальной популяции

2 - Экспоненциальная фаза [2] .

Развитие бактерий в пределах экспоненциальной фазы

Бактериальные клетки в пределах экспоненциальной фазы интенсивно размножаются. У различных видов бактерий величины скорости деления и скорости роста клеток варьируют в значительных приделах. В частности, Escherichia coli (кишечная палочка) при 37°Cделится каждые 20 минут, а бактерии, принадлежащие к родам Nitrosomonas и Nitrobacter - каждые 5-10 часов [2] .

Достигнув определенной концентрации, популяция вступает в следующую за эспоненциальной - стационарную фазу. В частности, культура бактерии кишечной палочки вступает в стационарную фазу при концентрации клеток 2-5 х10 9 мл [2] .

Характеристика бактериальных клеток в экспоненциальной фазе

Во время экспонециальной фазы все клетки в популяции имеют приблизительно одинаковый размер, содержат максимальное количество РНК, количество белка в них также постоянно и максимально. Во время данной фазы бактериальные клетки характеризуются высокой жизнеспособностью и биохимической активностью [2] .

Основные фазы роста микроорганизмов

Обмен веществ в микробной клетке сопровождается биосинтезом белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и других соединений. В результате этих процессов увеличиваются размеры и биомасса клетки, что определяется как рост. Увеличение численности клеток в процессе их деления называют размножением. Интенсивность роста определяется путем деления биомассы на численность клеток в единице объема через определенные промежутки времени.

• I — лаг-фаза (или фаза задержки роста);

• II — экспоненциальная (или логарифмическая);

• IV — фаза отмирания.

Лаг-фаза охватывает промежуток времени от момента внесения инокулята (посевного материала) до начала размножения микроорганизмов. Во время лаг-фазы число клеток или совсем не увеличивается, или нарастает очень незначительно. Задержка роста в начале лаг-фазы объясняется адаптацией к новым условиям. Тем не менее этот период характеризуется повышенной метаболической активностью: в клетках возрастает содержание РНК и общего белка, синтезируется ряд ферментов. Наблюдается заметное увеличение размеров клеток — они в 3— 5 раз больше обычных. Длительность лаг-фазы зависит от вида микроорганизма, состава питательной среды, количества и возраста вносимого инокулята. Лаг-фаза сокращается при использовании полноценной среды и молодого инокулята.

Иногда в периодической культуре может наблюдаться наличие двух лаг-фаз — диауксия. Это явление двухфазного роста в 1942 г. впервые описал французский ученый Жак Моно на примере поочередного использования двух разных углеводов кишечной палочкой. При культивировании кишечной палочки на среде, содержащей глюкозу и сорбит, клетки сначала потребляют глюкозу, тогда как синтез ферментов, необходимых для расщепления сорбита, подавляется. Эти ферменты синтезируются лишь после того, как вся глюкоза будет израсходована.

Экспоненциальная (или логарифмическая) фаза характеризуется максимальной и практически постоянной скоростью роста клеток. Число клеток в этой фазе возрастает в геометрической прогрессии. В этой фазе рост культуры сбалансирован: питательные вещества субстрата и продукты жизнедеятельности не лимитируют размножение микроорганизмов.

Стационарная фаза соответствует периоду, когда число жизнеспособных клеток, достигнув максимума, перестает увеличиваться. Многие клетки еще продолжают делиться, но количество вновь образующихся клеток равно количеству погибающих. При этом общая численность микробной популяции не изменяется. К концу стационарной фазы условия роста продолжают ухудшаться и культура переходит в завершающую фазу.

Фаза отмирания характеризуется массовой гибелью микробных клеток. Скорость гибели клеток намного опережает скорость их деления. В сложившихся неблагоприятных условиях выживают лишь единичные особи, появляются так называемые инволюционные формы, не дающие потомства.

Особенности периодического культивирования

Различают два основных способа культивирования микроорганизмов — периодическое и непрерывное. При периодическом культивировании клетки помещают в закрытый сосуд определенного объема, содержащий питательную среду, и задают начальные условия. Развитие культуры приводит к постепенной смене условий существования микроорганизмов: увеличивается плотность популяции, снижается концентрация питательных веществ и накапливаются продукты обмена. Периодическую культуру можно рассматривать как замкнутую систему, которая проходит разные фазы своей жизни (рис. 5.5, а).

Рис. 5.5. Типичные кривые роста:

а — при периодическом культивировании; б — диауксия на среде, содержащей два доступных питательных субстрата

Каждая фаза характеризуется определенными физиологическими параметрами. Лаг-фаза — это фаза «привыкания» клеток к среде, при этом происходят увеличение количества ДНК и РНК и индукция синтеза соответствующих ферментов. Лаг-фаза удлиняется, если брать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду. Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки перенести в свежую среду того же состава и той же температуры. На средах, содержащих смесь субстратов, наблюдается диа- уксия, при которой после исчерпания одного субстрата культура переходит во вторую лаг-фазу для подготовки к потреблению другого субстрата (рис. 5.5, б). В экспоненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях. По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обмена скорость роста снижается (наступает фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, в течение которой процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии, когда процессы деления и отмирания клеток в популяции уравновешены. Для бактерий эта фаза достигается при концентрации в среднем 109 клеток/мл, для водорослей и простейших — 106 клеток/мл. Когда исчерпание питательных веществ и накопление продуктов метаболизма достигают неких пороговых концентраций, начинается фаза отмирания и число клеток в популяции постепенно снижается. Фаза отмирания обычно тоже имеет логарифмический характер.

Для проведения расчетов р принимались некоторые допущения, при которых скорость изменения плотности клеток в саморазмножающейся системе пропорциональна самой плотности, т.е. изменение в экспоненциальной фазе роста следует кинетике реакций первого порядка. Тогда

Периодическое культивирование

В процессе культивирования микроорганизмов периодическим способом, как указывалось ранее, можно выделить несколько периодов роста (рис. 2.19).

В первый период, после внесения в среду посевного материала (лаг-фаза), происходит процесс приспособления посевной культуры к новой среде. Численность популяции в эта время не увеличивается (а в некоторых случаях даже снижается). Состояние популяции в лаг-фазе формально можно описать так:

(для т, лежащего между 0 и т1).

Предполагается, что в период лаг-фазы микробные клетки не потребляют субстрата, но метаболическая активность клеток проявляется в повышении содержания белка и РНК (при постоянстве содержания ДНК), а также в увеличении объема клеток, который в общем виде может быть выражен с помощью уравнения

По достижении определенных соотношений между величинами поверхности клетки и ее объема происходит деление клетки, вследствие чего численность популяции начинает увеличиваться с возрастающей скоростью, которая для данной фазы роста культуры, называемой переходной, описывается соотношением

Интегральная зависимость, описывающая участок кинетической кривой роста между т1 и т2, имеет вид

Увеличение скорости роста популяций в переходной фазе идет до предела, определяемого формально достижением параметром ф величины, равной единице, после чего скорость роста начинает выражаться зависимостью

(для т между т2 и т3), откуда интегральная форма представляет экспоненциальную функцию

Эта фаза роста носит название экспоненциальной, или фазы логарифмического роста. Для оценки скорости роста биомассы часто пользуются величиной удельной скорости роста u.

В качестве характеристики растущей культуры, находящейся в этой фазе, используют термины «время удвоения» и «время генерации» q, рассчитываемое по уравнению

Однако такой характер роста популяции, который в первом приближении может быть описан экспоненциальной зависимостью, наблюдается в течение ограниченного периода времени, так как по мере увеличения биомассы все отчетливее проявляется тенденция к замедлению скорости роста. Для такого участка кинетической кривой роста популяции, называемого фазой затухающего роста культуры, может быть использовано дифференциальное уравнение для скорости роста

и его интегральная форма для описания изменения концентрации биомассы во времени

(для интервала времени между т3 и т4).

Снижение скорости роста по мере приближения X к значению Х4 происходит вплоть до достижения нулевого значения, которое характеризует вступление популяции в стационарную фазу: X = X4

(для т, лежащих между т4 и т5).

По завершении фазы стационарного роста начинается фаза отмирания, или фаза дегенерации, культуры, характеризующаяся уменьшением численности популяции.

Приведенная выше система уравнений может быть использована только для описания конкретной кинетической кривой роста, полученной в результате эксперимента, но не в состоянии служить основой для прогнозирования процесса, так как в приведенных зависимостях в качестве параметров (Х1, …, Х4; т1, …, т5) вводятся конечные значения концентрации биомассы и времени. В настоящее время еще нет общепринятой математической модели роста популяции, которая достаточно точно описывала бы кинетику накопления биомассы в условиях периодического культивирования и содержала бы минимальное число эмпирических коэффициентов. В наибольшей степени этим требованиям отвечает модель Н. И. Кобозева, использование которой при изучении кинетики роста популяции дает обнадеживающие результаты. Интегральная форма предложенного им уравнения, описывающего кинетическую кривую роста популяции, имеет вид

Это уравнение является наиболее общим выражением для роста популяции, и в зависимости от частных условий (обратимое или необратимое размножение, рост популяции с исчерпыванием субстрата или при поддержании его количества на постоянном уровне) уравнение приобретает соответствующую форму и дает различное выражение для величины концентрации биомассы.

Основной недостаток периодического способа — цикличность и постоянное изменение условий культивирования, что затрудняет контроль и регулирование параметров процесса.

Большие возможности для повышения эффективности производства заложены в непрерывном способе выращивания.

Читайте также: