Скорость ферментативных реакций. Факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций.

Добавил пользователь Alex
Обновлено: 14.12.2024

Характер зависимости ферментативной реакции от рН определяется тем, что этот показатель оказывает влияние на:

a) ионизацию аминокислотных остатков, участвующих в катализе,

b) ионизацию субстрата,

c) конформацию фермента и его активного центра.

Ингибирование ферментов

Скорость ферментативной реакции может быть снижена действием ряда химических веществ, называемых ингибиторами. Некоторые ингибиторы являются для человека ядами, например, цианиды, другие - используются в качестве лекарственных препаратов.

Ингибиторы можно разделить на два основных типа: необратимые и обратимые. Необратимые ингибиторы (I) связываются с ферментом с образованием комплекса, диссоциация которого с восстановлением активности фермента невозможна:

E + I

Примером необратимого ингибитора является диизопропилфторфосфат (ДФФ). ДФФ ингибирует фермент ацетилхолинэстеразу, играющего важную роль в передаче нервного импульса. Этот ингибитор взаимодействует с серином активного центра фермента, блокируя тем самым активность последнего. Вследствие этого нарушается способность отростков нервных клеток нейронов проводить нервный импульс. ДФФ является одним из первых веществ нервно-паралитического действия. На его основе создан ряд относительно нетоксичных для человека и животных инсектицидов - веществ, ядовитых для насекомых.

Обратимые ингибиторы, в отличие от необратимых, при определенных условиях могут быть легко отделены от фермента. Активность последнего при этом восстанавливается:

Среди обратимых ингибиторов выделяют конкурентные и неконкурентные ингибиторы.

Конкурентный ингибитор, являясь структурным аналогом субстрата, взаимодействует с активным центром фермента и таким образом перекрывает доступ субстрата к ферменту. При этом ингибитор не подвергается химическим превращениям и связывается с ферментом обратимо. После диссоциации комплекса EI фермент может связаться либо с субстратом и преобразовать его, либо с ингибитором (рис. 34.). Поскольку и субстрат и ингибитор конкурируют за место в активном центре, такое ингибирование называется конкурентным.


Рис. 34. Механизм действия конкурентного ингибитора.

Конкурентные ингибиторы используются в медицине. Для борьбы с инфекционными болезнями ранее широко применялись сульфаниламидные препараты. Они близки по своей структуре к пара-аминобензойной кислоте (ПАБК), необходимому фактору роста многих патогенных бактерий. ПАБК является предшественником фолиевой кислоты, которая служит кофактором ряда ферментов. Сульфаниламидные препараты выступают в качестве конкурентного ингибитора ферментов синтеза фолиевой кислоты из ПАБК и тем самым подавляют рост и размножение патогенных бактерий.

Неконкурентные ингибиторы по структуре не сходны с субстратом и при образовании EI взаимодействуют не с активным центром, а с другим участком фермента. Взаимодействие ингибитора с ферментом приводит к изменению структуры последнего. Образование EI-комплекса является обратимым, поэтому после его распада фермент вновь способен атаковать субстрат (рис. 35).

Рис. 35. Механизм действия неконкурентного ингибитора

В качестве неконкурентного ингибитора может выступать цианид CN - . Он связывается с ионами металлов, входящими в состав простетических групп и подавляет активность этих ферментов. Отравления цианидами крайне опасны. Они могут привести к летальному исходу.

Аллостерические ферменты

Термин «аллостерический» происходит от греческих слов allo - другой, stereo - участок. Таким образом, аллостерические ферменты наряду с активным центром имеют другой центр, называемый аллостерический центр (рис. 36). С аллостерическим центром связываются вещества, способные изменять активность ферментов, эти вещества называют аллостерическими эффекторами. Эффекторы бывают положительными - активирующими фермент, и отрицательными - ингибирующими, т.е. снижающими активность фермента. Некоторые аллостерические ферменты могут подвергаться действию двух и более эффекторов.


Рис. 36. Структура аллостерического фермента.

Регуляция мультиферментных систем

Некоторые ферменты действуют согласованно, объединяясь в мультиферментные системы, в которых каждый фермент катализирует определенную стадию метаболитического пути:

В мультиферментной системе есть фермент, который определяет скорость всей последовательности реакций. Этот фермент, как правило, бывает аллостерическим и находится в начале матаболитического пути. Он способен, получая различные сигналы, как повышать, так и понижать скорость катализируемой реакции, тем самым регулируя скорость всего процесса.

I.3. Факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции

Факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции, влияют также и на активность ферментов. К ним относят:

концентрация субстрата и фермента,

условия протекания реакции (температура, рН среды, давление),

наличие активаторов и ингибиторов.

Рассмотрим их более подробно.

Влияние концентрации субстрата.

В 1913 г. Михаэлис и Ментен показали, что скорость ферментативной реакции не прямо пропорциональна концентрации субстрата. При увеличении концентрации субстрата и постоянной концентрации фермента скорость вначале увеличивается линейно (а - реакция первого порядка), затем переходит в реакцию смешанного порядка (б), затем стремится к максимальной скорости (в - реакция нулевого порядка) (рис. 2).


Рис. 2. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

Для описания зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата было предложено уравнение Михаэлиса-Ментен:

где υmax - максимальная скорость, [S] - концентрация субстрата, КS - константа диссоциации фермент-субстратного комплекса.

Преобразуя это уравнение, делением на [S], можно получить:

Следует отметить, что уравнение Михаэлиса-Ментен не учитывает влияние на скорость ферментативного процесса продуктов реакции. Бриггс и Холдейн модифицировали это уравнение, введя константу Михаэлиса Кm. Константа Михаэлиса представляет отношение констант скоростей распада фермент-субстратного комплекса ES к константе скорости его образования: Кm = (k-1 + k+2 ) / k+1

для ферментативной реакции:

В результате Бриггс и Холдейн получили уравнение:

Если Кm = [S], то по уравнению υ = υmax / (1+1) = υmax /2. Это означает, что Кm численно равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине от максимальной величины.

Кm - это мера сродства данного субстрата к ферменту: если Кm велика, это означает, что потребуется много субстрата для достижения ½ . υmax (реакция идет медленно); низкая величина Кm указывает на то, что для насыщения фермента достаточно небольшое количество субстрата. Итак, Кm большая - низкое сродство S к E, Кm малая - высокое сродство S к E.

Таким образом, применяя данные уравнения, можно количественно характеризовать эффективность действия ферментов.

Влияние концентрации фермента.

При условии избытка субстрата скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна концентрации фермента. Эта зависимость подчиняется уравнению прямой υ = k . [E].

Влияние рН среды.


Рис. 3. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды.

Влияние температуры.

Известно, что скорость химической реакции повышается в 2-4 раза при повышении температуры на каждые 10 о С. Однако из-за белковой природы ферментов повышение температуры приведет к тепловой денатурации фермента и снижению скорости реакции. Оптимальная температура - это та температура, при которой скорость реакции максимальна. Для ферментов растений tопт - 45-50 о С, ферментов теплокровных - 37 о С. Исключение миокиназа мышц выдерживает нагревание до 100 о С.

Влияние активаторов на активность ферментов.

Активаторы - вещества, повышающие активность ферментов. Примеры активаторов: чаще катионы - Mg 2+ , Mn 2+ , Zn 2+ , K + , Co 2+ , Fe 2+ , Cu 2+ ; реже анионы - Сl - ; иногда белки.

- формируют АЦ фермента (Mg 2+ , Zn 2+ , Co 2+ , Fe 2+ , Cu 2+ ),

- облегчают образование фермент-субстратного комплекса (Mg 2+ , Mn 2+ )

- стабилизируют нативную структуру фермента,

- защищают функциональные группы АЦ фермента от повреждения, например глутатион и цистеин восстанавливают SH-группы активного центра.

Влияние ингибиторов на активность ферментов.

Ингибиторы (I)- вещества, понижающие активность ферментов.

Классификация ингибиторов ферментов. Ингибиторы делят на неспецифические и специфические. Специфические ингибиторы бывают необратимые и обратимые, а среди обратимых выделяют конкурентные (изостерические) и неконкурентные (аллостерические).

Неспецифические ингибиторы (соли тяжелых металлов, кислоты, щелочи) вызывают денатурацию фермента. Их действие не связано с механизмом ферментативного катализа.

Действие специфических ингибиторов связано с механизмом ферментативного катализа.

При необратимом ингибировании образуется прочный комплекс фермента и ингибитора. Даже если удалить ингибитор из среды, та часть молекул фермента, которая успела связаться с ингибитором остается неактивной длительное время, и ингибирование становится необратимым.

Примеры необратимых ингибиторов:

1. Ингибиторы металлосодержащих ферментов - HCN, KCN, CO, NaN3 - влияют на активность ферментов дыхательной цепи, препятствуя переносу электронов на кислород, поэтому их называют дыхательными ядами.

2. Вещества, связываютщие SН-группы активного центра, например моноиодацетат, соединения ртути и мышьяка.

3. Вещества, связываютщие ОН-группы серина в активном центре, например, фосфорорганические соединения - боевые отравляющие вещества.

При обратимом ингибировании образуется непрочный комплекс фермента и ингибитора, способный распадаться, в результате чего фермент вновь становится активным. Обратимые ингибиторы бывают конкурентные и неконкурентные.

Конкурентный ингибитор очень похож на субстрат и фермент не может их различить, т.е. I и S конкурируют за активный центр фермента.

В результате связывания конкурентного ингибитора с активным центром фермента падает концентрация фермент-субстратных комплексов и скорость реакции уменьшается. Однако для активного центра фермента все же лучше подходит субстрат. Поэтому при достаточно большой концентрации субстрата его молекулы начнут вытеснять ингибитор из АЦ фермента, увеличится число молекул фермент-субстратного комплекса и скорость реакции увеличится. Таким образом, путем увеличения концентрации субстрата можно нейтрализовать действие конкурентного ингибитора и достичь максимальной скорости реакции.

Пример конкурентного ингибитора - малонат, который ингибирует фермент сукцинатдегидрогеназу (СДГ), ускоряющую реакцию превращения янтарной кислоты (истинный субстрат) в фумаровую. Малонат похож по строению на сукцинат и может взаимодействовать а АЦ фермента, но фумарат не образуется.

СООН СООН (малонат)

Янтарная кислота Фумаровая кислота

Неконкурентные ингибиторы не имеют структурного сходства с субстратом и часто связываются не с АЦ фермента, а с каким-либо другим участком фермента (часто с аллостерическим центром). Поэтому ингибитор может присоединяться как к свободному ферменту, так и к фермент-субстратному комплексу, в обоих случаях инактивируя фермент.

Неконкурентное ингибирование может быть следствием нескольких способов взаимодействия фермента и ингибитора:

1) Блокирование ферментов ионами тяжелых металлов (Hg 2+ , Pb 2+ и др.), которые присоединяются к сульфгидрильным группам полипептидной цепи; солями синильной кислоты, оксидом углерода (II), которые присоединяются к железосодержащим простетическим группам.

2) Присоединение ингибитора к аллостерическому центру, что вызывает такие изменения в структуре фермента, которые передаются в активный центр и нарушают его строение, вызвав инактивацию фермента.

6.7. Факторы, влияющие на скорость ферментативного катализа

Скорость ферментативной реакции определяется количеством вещества, превращающимся в единицу времени, и зависит от температу­ры, рН среды, концентрации субстрата и фермента.

Скорость ферментативной реакции является мерой активности фермента. Активность фермента можно измерить только косвенно: по количеству превращаемого субстрата или получаемого продукта реакции в единицу времени.

Влияние температуры на активность ферментов

Зависимость каталитической активности от температуры (термолабильность) для большинства ферментов выражается типичной кривой, представленной на рис.16.

Рис. 16. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры

Скорость ферментативных реакций, как и любых других, при повышении температуры на каждые 10 °С увеличивается примерно в 2-4 раза (правило Вант-Гоффа), но это правило справедливо лишь в облас­ти температур до 50-60°С. При температуре выше 50°С начинается де­натурация фермента, что означает уменьшение его количества и соот­ветственно снижается скорость реакции. При температурах 80-100°С почти все ферменты утрачивают свою активность (исключение состав­ляет только один фермент мышечной ткани - миокиназа, который вы­держивает нагревание до 100°С). Оптимальной для действия ферментов животного происхождения является температура 40-50°С, а для расти­тельного - 50-60°С. Однако есть ферменты с более высокими оптималь­ными температурами, например, у папаина (фермента растительного происхождения, ускоряющего гидролиз белка) он равен 80°С. В то же время у каталазы (фермента, ускоряющего распад перекиси водорода до воды и О2 ) оптимальная температура действия находится между 0 и 10°С, а при более высоких температурах происходит инактивация фер­ментов. При температурах 0°С и ниже большинство ферментов не раз­рушается, но их активность стремится к нулю.

Свойство термолабильности ферментов имеет важное значение для понимания процессов жизнедеятельности. При снижении температуры некоторые животные впадают в состояние спячки или анабиоза. При этом скорость ферментативных процессов уменьшается, что снижа­ет расход накопленных организмом питательных веществ и замедляет обмен веществ. Искусственное охлаждение организма (гибернация) ис­пользуется в клинике для проведения хирургических операций.

Влияние рН на активность ферментов

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентра­ции водородных ионов носит колоколообразный характер (рис. 17). Ка­ждый фермент имеет свой оптимум рН среды, при которой он макси­мально активен. Большинство ферментов имеет максимальную актив­ность при физиологическом значении рН среды 6,0-8,0, однако некото­рые ферменты хорошо работают или в кислой (пепсин), или в щелочной (аргиназа) среде. В табл. 8 приведены оптимумы рН ряда ферментов.

Влияние изменения рН среды на молекулу фермента состоит в изменении степени ионизации кислотных и основных групп активного центра фермента, что сказывается на третичной структуре белка и со­ответственно на формировании активированного фермент-субстратного комплекса. Кроме того, имеет значение состояние ионизации субстрата и кофермента.

Факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции

Для простых ферментов зависимость имеет вид гиперболы.

Согласно правилу Вант-Гоффа, при повышении температуры на каждые 10 С скорость реакции возрастает в 2-3 раза. То есть, с одной стороны, по мере увеличения температуры увеличивается средняя энергия молекул, при этом они активизируются, выше частота их соударений, выше подвижность отдельных элементов активного центра фермента и скорость реакции увеличивается, но до известного предела. При дальнейшем повышении температуры (выше 45С) скорость реакции понижается. Это объясняется белковой природой фермента, который может пдвергаться тепловой денатурации, что резко понижает эффективную концентрацию фермента и соответственно скорость реакции.

При низких температурах (0 и ниже) ферменты не денатурируются, хотя активность их падает почти до нуля. Исходя из этого, существует температурный оптимум, в пределах которого ферменты нормально работают.

При действии рН происходит 3 явления:

1)изменение ионизации и заряда на поверхности аллофермента;

2) изменение степени ионизации функциональных групп активного центра;

3) изменение ионизации самого субстрата.

Так, при сдвиге рН в кислую сторону происходит следующее:

СООН== СОО + Н СОО + Н ---- СООН

При сдвиге рН в основную сторону:

СООН+ ОН ==== СОО + НО

То есть и в этом и в другом случае происходит перезарядка функциональных групп активного центра. Поэтому здесь тоже существует свой оптимум рН. Для разных ферментов он разный: пепсин - рН = 1,5-2,5; сахароза - рН = 4; трипсин - рН = 7,7-7,8; ариназа- рН = 8,5-10,0.

5) Концентрация продукта

Оказывает влияние на скорость реакции по принципу обратной связи, то есть тормозит. При наполнении продукта вся система блокируется на последней стадии (ретроингибирование). Так, например, накопление молочной кислоты, образующейся при распаде глюкозы, приводит к снижению последней и формированию утомления.

Скорость ферментативной реакции. Факторы, влияющие на ферментативную активность

Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта. Скорость определяют по углу наклона касательной к кривой на начальной стадии реакции.


Рис. 2 Скорость ферментативной реакции.

Чем круче наклон, тем больше скорость. Со временем скорость реакции обычно снижается, по большей части в результате снижения концентрации субстрата.

Факторы, влияющие на ферментативную активность

Действие Ф. зависит от ряда факторов: температуры, реакции среды (pH), концентрации фермента, концентрации субстрата, от присутствия специфических активаторов и неспецифических или специфических ингибиторов.

При высокой концентрации субстрата и при постоянстве других факторов скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермента.


Рис. 3 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.

Катализ осуществляется всегда в условиях, когда концентрация фермента гораздо ниже концентрации субстрата. Поэтому с возрастанием концентрации фермента растет и скорость ферментативной реакции.

Влияние температуры на скорость ферментативной реакции может быть выражено через температурный коэффициент Q10: Q10 = (скорость реакции при (х + 10)°C) / (скорость реакции при х °C)

В пределах 0-40°C Q10 ферментативной реакции равен 2. Иными словами, при каждом повышении температуры на 10°C скорость ферментативной реакции удваивается.


Рис. 4 Влияние температуры на активность такого фермента, как амилаза слюны.

С повышением температуры движение молекул ускоряется, и у молекул реагирующих веществ больше шансов столкнуться друг с другом. Увеличивается, следовательно, и вероятность того, что реакция между ними произойдет. Температура, обеспечивающая наибольшую активность, называется оптимальной. За пределами этого уровня скорость ферментативной реакции снижается, несмотря на увеличение частоты столкновений. Происходит это вследствие разрушения вторичной и третичной структур фермента, иными словами, вследствие того, что фермент претерпевает денатурацию.


Рис. 5 Ход ферментативной реакции при разных температурах.

Когда температура приближается к точке замерзания или оказывается ниже ее, ферменты инактивируются, но денатурации при этом не происходит. С повышением температуры их каталитическая активность вновь восстанавливается.

Поскольку белки в сухом состоянии денатурируются значительно медленнее, чем белки оводненные (в виде белкового геля или раствора), инактивирование Ф. в сухом состоянии происходит гораздо медленнее, чем в присутствии влаги. Поэтому сухие споры бактерий или сухие семена могут выдержать нагревание до гораздо более высоких температур, чем те же споры или семена в увлажненном состоянии.

Концентрация субстрата

При данной концентрации фермента скорость ферментативной реакции возрастает с увеличением концентрации субстрата.


Рис. 6 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

Теоретическая максимальная скорость реакции Vmax никогда не достигается, но наступает момент, когда дальнейшее увеличение концентрации субстрата уже не влечет за собой сколько-нибудь заметного изменения скорости реакции. Это следует объяснить тем, что при высоких концентрациях субстрата активные центры молекул Ф. в любой данный момент оказываются практически насыщенными. Таким образом, сколько бы ни было в наличии избыточного субстрата, он может соединиться с Ф. лишь после того, как образовавшийся ранее фермент-субстратный комплекс диссоциирует на продукт и свободный Ф. Поэтому при высоких концентрациях субстрата скорость ферментативной реакции лимитируется и концентрацией субстрата, и временем, которое требуется для диссоциации фермент-субстратного комплекса.

При постоянной температуре любой Ф. работает наиболее эффективно в узких пределах pH. Оптимальным считается то значение pH, при котором реакция протекает с максимальной скоростью.


Рис. 7 Зависимость активности фермента от pH.

При более высоких и более низких pH активность Ф. снижается. Сдвиг pH меняет заряд ионизированных кислотных и основных групп, от которого зависит специфичная форма молекул Ф. В результате изменяется форма молекул Ф., и в первую очередь форма его активного центра. При слишком резких сдвигах pH Ф. денатурирует. Свойственный данному Ф. оптимум pH не всегда совпадает с pH его непосредственного внутриклеточного окружения. Это позволяет предположить, что среда, в которой находится Ф., в какой-то мере регулирует его активность.

Читайте также: